This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Todos los experimentos descritos en este documento fueron aprobados por la Junta local de Experimentación Animal de la Universidad de Radboud Nijmegen, en conformidad con las leyes y reglamentos (RU-diciembre 2013 a 205) Holandés. 1. Manchas Gel Matrix extracelular <ol><li> Realice los siguientes pasos un día antes del aislamiento: <ol><li> Descongelar una alícuota de gel de matriz extracelular (100 l) a 4 ° C durante al menos 1,5 h. Diluir 1:10 en medio de Eagle modificado por Dulbecco; con 4,500 mg / L de glucosa, 4 mM L-glutamina, y 110 mg / ml de piruvato de sodio (DMEM). Mantener el gel de la matriz extracelular a 4 ° C en todo momento. Nota: Los cambios de temperatura bruscos resultarán en recubrimiento desigual y la formación de cristales. </li><li> Mantenga la solución de gel matriz extracelular diluido en hielo durante 15 min. </li><li> Pre-enfriar una micropipeta 20 l durante 10 minutos. </li><li> Ponga portaobjetos de cámara de 8 pocillos en una placa de Petri de 100 mm y transferir el plato sobre una superficie fría (por ejemplo, un acumulador de frío) durante 10 min.</li><li> Utilice la micropipeta pre-enfriado para poner una gota de 10 l de gel de matriz extracelular en cada pocillo. Mantenga la placa de Petri en la superficie fría durante al menos otros 7 min (Figura 1). </li><li> Eliminar completamente el gel matriz extracelular restante (Figura 1B), y secar los pozos a 37 ° C durante la noche. </li></ol></li></ol> 2. La disección de la cabeza Músculos (maseteros, digástrico y elevador velo del paladar) <ol><li> Antes de la disección, preparar 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado con 2% de penicilina-estreptomicina (P / S). Mantenga en hielo. </li><li> Después de la eutanasia de una rata adulta joven (9 semanas) con CO 2 / O 2, decapitar la cabeza y quitar la piel de la cabeza. Transferir la cabeza para helado de PBS suplementado con 2% P / S en un tubo de 50 ml. </li><li> Músculo masetero (derivado de la primera arco branquial) <ol><li> Coloque la cabeza con un lado en una almohadilla de silicona y fijar con hipodérmica needles (Figura 2A). </li><li> Identificar la glándula parótida y el nervio facial (Figura 2A). Exponer la fascia profunda que cubre la glándula. Cortar la fascia y extirpar la glándula con unas tijeras de disección. Identificar el conducto auditivo externo. Trace el nervio facial desde el agujero estilomastoideo y retirar con cuidado las ramas temporales, cigomáticos, y bucales con una hoja de bisturí No. 15. </li><li> Liberar la cabeza superficial del músculo masetero quitando la fascia. Identificar cabezas tanto superficial y profunda del músculo masetero. Seguir la pista a la cabeza superficial hasta su gruesa aponeurosis tendinosa insertada en el proceso cigomático del maxilar. </li><li> Separar el tendón desde su origen en el proceso cigomático con unas pinzas rectas. Cortar con una hoja de bisturí No. 15 o tijeras de disección y cuidadosamente la vida (Figura 2B). </li><li> Disecar la cabeza superficial del masetero hasta su inserción en el ángulo y la mitad inferior de la tél lateral superficie de la rama de la mandíbula con una hoja de bisturí No. 15 (Figura 2C). Ahora, eliminar completamente el músculo. </li></ol></li><li> Vientre posterior del músculo digástrico (derivado del arco branquial 2º) <ol><li> Coloque la cabeza en una posición supina sobre la almohadilla de silicona y fijar con agujas hipodérmicas (Figura 3A). </li><li> Retire la grasa subcutánea que recubre tanto sublingual y glándulas submandibulares. A continuación, retire la fascia superficial y glándulas utilizando tijeras de disección. Exponer el músculo digástrico (anterior y vientre posterior). </li><li> Sostenga el tendón anterior del vientre posterior con unas pinzas rectas, cortar y diseccionar cuidadosamente hasta su origen en la bulla timpánica (Figura 3B). Haga lo mismo en el lado contralateral. </li></ol></li><li> Músculo elevador del velo palatino (derivado del arco branquial cuarto) <ol><li> Después de la disección del vientre posterior del músculo digástrico, Localizar el músculo estilohioideo, tire de él lateralmente, y retire con cuidado (Figura 4A). </li><li> Localizar el tendón del músculo elevador del velo palatino que se inserta en la bulla timpánica (Figura 4A). Diseccionar cuidadosamente y cortarla en ambos lados. </li><li> Busque la tráquea y el esófago que corre detrás de él. Levante el esófago, y exponer la faringe, la laringe y el paladar blando. </li><li> Localizar la zona del paladar blando donde se inserta el músculo elevador del velo palatino y cortar suelto (Figura 4B). Nota: Directamente después de la disección, retire con cuidado los tendones y tejido conectivo de cada músculo bajo el microscopio estereoscópico. Sumergir todas las muestras rápidamente en etanol al 70%, y transferirlos a PBS enfriado con hielo suplementado 2% P / S en un tubo de 15 ml. </li></ol></li></ol> 3. Aislamiento de las células satélite <ol><li> Lleve a cabo los siguientes pasos de preparación para SC aislamiento de 3 grupos de músculos: <ol><li>Preparar 7,5 ml de 0,1% de pronasa en DMEM. Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 micras. Pre-calentar la solución a 37 ° C en un baño de agua durante 10 min antes del aislamiento. </li><li> Preparar 35 ml de DMEM suplementado con 10% de suero de caballo (HS) y 1% P / S. También pre-caliente a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Preparar 15 ml de medio de cultivo que consta de DMEM suplementado con suero bovino fetal al 20% (FBS), 10% HS, 1% P / S y 1% de extracto de embrión de pollo (CEE). Pre-caliente a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Pre-coat seis pipetas de plástico (10 ml) con HS y seco durante al menos 10 minutos antes de su uso. </li></ol></li><li> En la campana de cultivo, transferir cada músculo en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Usando las tijeras de disección, corte el músculo en pequeños trozos de unos 2 mm. Tenga cuidado de no picar el tejido demasiado. </li><li> Añadir con cuidado 2,5 ml de solución de pronasa 0,1% a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 60 min. Agite suavemente la placa después de 20, 40 y 60 min. Nota: El duratio exactan de la incubación depende de factores como la edad y la tensión de los animales. </li><li> Monitorear bajo el microscopio. Compruebe los fragmentos musculares y detener la digestión enzimática cuando los haces de fibras consiguen una apariencia aflojado (Figura 5). </li><li> Añadir 2,5 ml de DMEM suplementado con 10% HS y 1% P / S. Transferir a un tubo de 15 ml y centrifugar los tubos a 400 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante por decantación. </li><li> Añadir 5 ml de DMEM suplementado con 10% HS y 1% P / S. Pipetear la solución hacia arriba y abajo con una pipeta de 10 ml de plástico (trituración) durante al menos 20 veces para homogeneizar el tejido. </li><li> Centrifugar los tubos a 200 g durante 4 min. Recoger el sobrenadante y transferir a un tubo de 15 ml. </li><li> Añadir 5 ml de DMEM suplementado con 10% HS y 1% P / S. Pipeta de nuevo con una pipeta de plástico de 10 ml hasta que los fragmentos de tejido pasa fácilmente a través de la pipeta. </li><li> Centrifugar los tubos a 200 xg durante 4 min y recoger el sobrenadante en un tubo de 15 ml. </li><li> Put un filtro de células (40 micras) en un tubo de 50 ml y transferir el sobrenadante que contiene las células disociadas en el filtro. Lavar con 1 ml de DMEM para la recuperación celular máxima. </li><li> Centrifugar los tubos a 1.000 xg durante 10 min y descartar el sobrenadante con una pipeta. </li><li> Resuspender el precipitado en 300 l de medio de cultivo y contar las células en un hemocitómetro. </li></ol> 4. La diferenciación de las células satélite en Spots matriz de gel extracelular <ol><li> Diluir la suspensión de células para obtener 1,5 x 10 3 células en 10 l de medio de cultivo. </li><li> Asegure las tapas de las cámaras de diapositivas con cinta y marcar los puntos con un marcador negro en la parte inferior del vidrio objeto. </li><li> Usando una micropipeta, poner una gota de suspensión celular 10 l en el punto de gel matriz extracelular. Compruebe bajo el microscopio si la gota de suspensión celular se ha colocado correctamente en el lugar. Incubar durante seis horas a 37 ° C. </li><li> CuidadosoLy Agregar 400 l de medio de cultivo (DMEM suplementado con 20% FBS, 10% HS, 1% P / S y 1% CEE) y se incuba durante tres días a 37 ° C. Nota: En este punto, recién aisladas SC se somete a un trauma masivo (digestión enzimática y duro trituración) y que necesitan para recuperarse. No molestar las células durante los tres primeros días 37. A continuación, el medio de cultivo se puede cambiar dependiendo del tipo de experimento. Las manchas de gel de la matriz extracelular pueden ser sembradas con una densidad celular alta (1.5 hasta 2.5 x 10 3/20 l) para el ensayo de diferenciación. El medio de cultivo (DMEM suplementado con 20% FBS, 10% HS, 1% P / S y 1% de extracto de embrión de pollo) se puede sustituir cada tercer día. </li><li> Alternativamente, si se desea una ampliación y pasar siga los siguientes pasos: <ol><li> Descongelar una alícuota de gel de matriz extracelular (500 l) a 4 ° C durante al menos 1,5 h. Diluir 1:10 en DMEM y siga las recomendaciones en el punto 1.1.1. </li><li> Pre-enfriar una pipeta de 10 ml durante 10 min a 4 y# 176; C. </li><li> Transferencia tres matraces T75 sobre una superficie fría (por ejemplo, un acumulador de frío) durante 10 min. </li><li> Utilice la pipeta previamente enfriado a poner 1 ml de gel de matriz extracelular en cada frasco. Compruebe que la superficie está cubierta por completo. Mantenga los frascos en la superficie fría durante al menos otros 7 min (Figura 1). </li><li> Eliminar completamente el gel matriz extracelular restante con una pipeta de 10 ml, y secar los pozos a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Después de contar, resuspender las SCs recién aisladas en 10 ml de medio de cultivo (DMEM suplementado con 20% FBS, 10% HS, 1% P / S y 1% de extracto de embrión de pollo) y de semillas en los matraces T75 pre-revestido. </li><li> Después de tres días, cambiar el medio (y cada tercer día) hasta 80% de confluencia se alcanza. Para los pases, lavar los frascos T75 tres veces con PBS. A continuación, agregue 1 ml de 0,25% de solución de tripsina y se incuba durante tres minutos a 37 ° C. Resuspender en 9 ml de medio de cultivo (DMEM suplementado con 20% FBS, 10% HS, 1% P / Sy 1% de extracto de embrión de pollo) y centrifugar a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. Después de contar, resuspender 1 x 10 6 células en 1000 l de medio de cultivo y la congelación de las células. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicting interests to disclose.

SCs de diferentes músculos de la cabeza branchiomeric fueron aisladas de uno de 9 semanas de edad, de rata Wistar y se cultivaron directamente en puntos de gel de matriz extracelular sin expansión previa y pases. Después del aislamiento, las células se contaron y se sembraron a la misma densidad celular. Para el aislamiento paralelo de tres músculos diferentes, este método tarda aproximadamente 4 hr. Para evitar la contaminación cultura, un paso crítico es el lavado rápido de alcohol al 70% después de la disección de los músculos. Durante el aislamiento SC es importante para cortar el tejido muscular en trozos pequeños (alrededor de 2 mm), pero evitar demasiado picado como esto se traducirá en un pequeño rendimiento celular debido a daño celular. Además, la duración de la digestión enzimática se debe comprobar cuidadosamente bajo el microscopio para evitar daños mayores. El objetivo de la digestión es para disociar las miofibras. Desde hace más de 90% de las células aisladas expresar Pax7, no se requiere purificación adicional (Figuras 6-8).Esto evita etapas de purificación adicionales en otros métodos tales como pre-chapado en los platos sin revestir 14,37,38, fraccionamiento en Percoll 39,40, célula o fluorescent- o magnético clasificación 41,43. Para la trituración es esencial para inducir cizallamiento entre los fragmentos de tejido y la abertura de la punta de la pipeta ya que esto permite la liberación mecánica de la SC. Si la trituración con una pipeta de 10 ml (dentro punta Diámetro: 1 mm) es difícil, unos 5 ml (dentro de la punta de diámetro: 2 mm) de la pipeta se pueden utilizar por primera vez. Alternativamente, pipetas Pasteur de vidrio se pueden cortar en el diámetro deseado y ser usado. Este método es simple, eficiente y permite el aislamiento simultáneo de SC de diferentes muestras de músculo. Las placas de cultivo para SCs también se pueden recubrir con gelatina o colágeno, pero nuestros estudios anteriores muestran que el gel de la matriz extracelular es mucho mejor para el mantenimiento del potencial miogénico que el colágeno 38. Las manchas de gel de matriz extracelular detamaño milímetro (10 l / Ø 2 mm o 20 l / Ø 4 mm) permite el estudio de la proliferación y diferenciación de las SC con un número limitado de células. Para el ensayo de diferenciación de aproximadamente 8 a 20 veces menos células son requeridos en comparación con una placa de 24 pocillos (Ø 15,6 mm), y aproximadamente 80 a 200 veces menos en comparación con 35 mm placas de Petri (Ø 35 mm) 14,38. Desde gel de matriz extracelular es caro, este método también es más rentable. Además, los portaobjetos de cámara pueden ser reemplazados por cubierta de plástico se desliza para reducir aún más los costes. Para la preparación del gel de la matriz extracelular de spots de secado durante la noche de los portaobjetos de cámara es esencial. Como los puntos de gel de matriz extracelular son transparentes, es necesario marcar los puntos en la parte inferior con una luz frontal. Las cámaras de diapositivas se fijan en una placa de Petri para una fácil manipulación. La expansión del cultivo celular no es necesario, que ofrece la posibilidad de estudiar la SC de Smaller músculos o muestras de músculos pequeños. Alternativamente, por ejemplo, para la PCR o músculo construye si se necesitan más células, las castas recién aisladas primero se pueden expandir en frascos T75 como se indicó anteriormente. SC aislado utilizando este protocolo no son adecuados para la purificación adicional con citometría de flujo inmediatamente después de aislamiento. La digestión con pronasa provoca extensa digestión de la superficie de antígenos de 14. Suero de caballo y suero fetal bovino que se utilizan para el cultivo de células primero deben caracterizarse adecuadamente antes del aislamiento, como diferentes números de lote afectados diferencialmente la proliferación y diferenciación de mioblastos. En los últimos años, hay un interés creciente en los músculos derivados de los arcos branquiales y el mesodermo cabeza (por ejemplo, los músculos extraoculares) 24. Se ha demostrado claramente que los músculos de la cabeza y las extremidades poseen muy diferentes propiedades. Masetero músculo de animales viejos parece volverner su capacidad regenerativa en comparación con los músculos de las extremidades 25,26. SC de los músculos extraoculares poseen una robusta capacidad de proliferación y diferenciación comparable a las SC de músculos de la cabeza, y muestran un potencial mayor que el injerto extremidad muscular SC 24. La composición de la distribución del tipo de fibra y la miosina varía entre los grupos musculares y también entre especies. Los músculos se originan en el primer arco branquial en los seres humanos contienen fibras tanto lento y rápido (subtipos IIA y IIX), myosins neonatales y myosins típicos para desarrollar músculo cardíaco. En roedores estos músculos contienen aproximadamente 95% IIA fibras rápidas miosina y IIb) 44-46. Los estudios sobre los músculos aviar muestran que SCs de tipos de fibras musculares diferente varían en la capacidad de diferenciación. SC de fibras rápidas sólo se diferencian en las fibras musculares rápidas, mientras que los comités permanentes de fibras lentas pueden diferenciarse en dos tipos de fibras 47. Además, el porcentaje de SCs en el músculo rápidofibras es menor que en las fibras musculares lentas 48,49. Esto indica que la distribución del tipo de fibra se debe tener en cuenta para los estudios sobre los músculos en la zona craneofacial. Al igual que los músculos del paladar hendido, la LVP en roedores contiene casi exclusivamente fibras rápidas 50. Por esa razón, las SC de la LVP son adecuados para los estudios pre-clínicos en el campo de la fisura palatina. Este protocolo ofrece nuevas posibilidades para estudiar las SC derivadas de músculos de la cabeza branchiomeric u otros músculos más pequeños o muestras de los músculos más pequeños. Esto facilitará el desarrollo de nuevas terapias para mejorar la regeneración de los músculos en el área maxilofacial en condiciones tales como paladar hendido, sino también en otras condiciones que afectan a los músculos más pequeños.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Acerca de 1: 500 a 1: 1.000 recién nacidos presentan una hendidura que implica el labio y / o paladar (CLP); por lo tanto esta es la malformación congénita más común en los seres humanos 1. Los músculos del paladar blando son fundamentales para el funcionamiento del paladar blando durante el habla, la deglución y la succión. Si una hendidura del paladar blando está presente, estos músculos se insertan anormalmente en el extremo posterior del hueso palatal. El paladar blando se mueve hacia arriba y hacia abajo durante el discurso, evitando que escape el aire por la nariz. Los niños con una hendidura en el paladar no tienen esta función de control que resulta en un fenómeno conocido como la disfunción velofaríngea 2,3. Aunque los protocolos de tratamiento son variables, la reparación quirúrgica del paladar blando se lleva a cabo en la primera infancia (6-36 meses de edad) 4. Los músculos anormalmente insertadas del paladar blando pueden ser corregidas quirúrgicamente 5-7, sin embargo, la disfunción velofaríngea persiste en 7% a 30%de los pacientes 2,3,8-10. La capacidad del músculo esquelético para regenerar a través de la acción de las células satélite (SCS) está bien establecida 11,12. A su lesión muscular, SC se activan y migran al sitio de la lesión. A continuación, proliferan, se diferencian y se fusionan para formar nuevas fibras musculares o reparación dañado los 13. Quiescentes SC expresan el factor de transcripción Pax7 14,15, mientras que su progenie, los mioblastos proliferantes, expresa, además, el factor de determinación miogénica 1 (MyoD) 16. Mioblastos diferenciadores comienzan a expresar miogenina (MyoG) 17. La diferenciación terminal de los mioblastos se caracteriza por la formación de miofibras, y la expresión de proteínas de músculos específicos tales como la cadena pesada de la miosina (MyHC) 16,18. Recientemente, varias estrategias se han utilizado en la medicina regenerativa para mejorar la regeneración del músculo de los músculos de las extremidades 19-23. Estudios específicos sobremúsculos de la cabeza branchiomeric también son importantes, ya que se demostró recientemente que se diferencian de los otros músculos en varios aspectos 24. En contraste con los músculos de las extremidades, se ha sugerido que los músculos de la cabeza branchiomeric contienen menos SCs 25, se regeneran más lento, y el tejido conectivo más fibrosa se ​​forma después de la lesión 26 Además, la proliferación de las SC de músculos de la cabeza branchiomeric también expresar otros factores de transcripción. Por ejemplo, Tcf21, un factor de transcripción para la formación muscular craneofacial se expresa fuertemente en la regeneración de los músculos de la cabeza, pero apenas en la regeneración de los músculos de las extremidades 25. Los músculos del paladar blando de los pacientes CLP son generalmente más pequeños y menos bien organizado en comparación con los músculos palatinos normales 27,28. Fibras lentas y rápidas están presentes en los músculos del paladar blando, pero las fibras lentas son más abundantes. En contraste, los músculos hendido contienen una mayor proporción de fibras rápidas y también un suministro capilar reducidoen comparación con los músculos del paladar blando normales 29-31. Fibras rápidas son más propensos a las lesiones inducidas por la contracción-31-33. La mala alimentación capilar acompaña también puede promover la fibrosis 34,35. Todos estos aspectos pueden contribuir a la mala regeneración de los músculos del paladar blando después del cierre leporino quirúrgica 36. En vista de esto, un protocolo para el aislamiento y caracterización de músculo cabeza branchiomeric SCS es crucial. Esto ofrece la posibilidad de estudiar SC biología de músculos de la cabeza branchiomeric. Además, las nuevas terapias basadas en la ingeniería de tejidos se pueden desarrollar para promover la regeneración muscular después de la cirugía en CLP y otras condiciones que comprometen la zona craneofacial. En general, SCs se pueden obtener después de la disociación del tejido muscular 14. Picado, digestión enzimática, y trituración en general están obligados a liberar las SC de su nicho. SCs se puede purificar por pre-chapado en los platos sin revestir 14,37,38, fractionation en Percoll 39,40, célula o fluorescent- o magnético de clasificación 41-43. Aquí presentamos un nuevo protocolo económico y rápido para el aislamiento de las células satélite de músculos de la cabeza branchiomeric de ratas adultas jóvenes. Este protocolo se basa en un manuscrito anterior 14 y adaptado específicamente para las pequeñas muestras de tejido. El aislamiento de los comités permanentes de los músculos representativas procedentes de la 1 °, 2 ° y 4 arcos branquiales th se describen. Después del aislamiento, bajo número de células satélite se cultivan en los puntos de gel de matriz extracelular de tamaño milímetro para estudiar su diferenciación. Este enfoque evita la necesidad de la ampliación y los pases de los SC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle 25G 0,5x25m</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BC154R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps straight</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BD330R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol 70%</td>
			<td>Denteck</td>
			<td>2,010,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox Slide, 8 Chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#181;L FT20</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Phenol-Red Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>53702</td>
			<td>10KU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3600511</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2850145</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

El uso de este protocolo, el músculo masetero (un lado) rinde 0,8-1 x 10 6 células, el músculo digástrico (vientre posterior) rinde 1,5-2 x 10 5 células, y los rendimientos del músculo elevador del velo palatino 1-1,5 x 10 5 células. Los rendimientos celulares dependen del tipo muscular, tensión, y la edad del animal. Para la comparación entre los tres grupos de músculos, SCS recién aisladas se sembraron a la misma densidad celular (1,5 x 10 3/10 l). Directamente después del aislamiento, más de 90% de las células recién aisladas expresar Pax7 (Figura 6). Día 4, 7 y 10 culturas fueron teñidas con anticuerpos contra Pax7, MyoD, MyoG y MyHC inmunotinción. Cinco campos arbitrarios fueron contados por cultivo usando un objetivo 20X. Al día 4 Pax 7 y Myo D se expresa en todos los grupos musculares (Figuras 6 y 7 y 8), sin embargo la progenie de SatCs del masetero y los músculos digástrico comienzan exprescantar miogenina antes que el velo del elevador palatino muscular (Figura 9). En el día 10, la expresión de MyoG está fuertemente reducido en todos los grupos (Figura 9). Pocos días después de la siembra en los puntos de gel de matriz extracelular, las células proliferantes comienzan a fusionarse y formar miotubos multi-nucleadas, que expresan la cadena pesada de la miosina. Miotubos pequeños son claramente visibles en el día 7 (Figura 10). En el día 10, espasmos de los miotubos se puede observar (Video 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> Figura 1:. Manchas de gel de matriz extracelular en un portaobjetos de cámara (A) para una fácil manipulación, coloque la diapositiva cámara de 8 pocillos en una placa de Petri de 100 mm. Pipetear 10 l de gel de matriz extracelular en cada cámara y lo puso en una superficie fría (7 min). (B) de diapositivas Cámara después del exceso de matriz extracelular gse elimina el. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> Figura 2:. La disección del músculo masetero (A) Cabeza del animal en una vista lateral. Oído (E), la glándula parótida (P) y el nervio facial (VII). (B) tendinosa aponeurosis (Te) de la cabeza superficial del músculo masetero (Ms) y el músculo temporal (T). Separar el tendón de su inserción con un fórceps. (C) diseccionar cuidadosamente el músculo hasta su inserción en la rama de la mandíbula. E: oído, P: glándula parótida, VII: nervio facial, T: músculo temporal, Ms: cabeza superficial del músculo masetero, Te: tendón, Mp: profunda cabeza del músculo masetero. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> Figura 3: Disección del vientre posterior del músculo digástrico (.A) Jefe del animal en posición supina. Localizar la glándula submandibular (Mx), músculo masetero (M), el nervio facial (VII) y el músculo esternocleidomastoideo (ECM). Retire la glándula submandibular. (B) Localizar la parte anterior del músculo digástrico (AD) y vientre posterior (PD). Con unas pinzas rectas, tome el tendón anterior del vientre posterior, cortar y diseccionar cuidadosamente hasta su origen en la bulla timpánica (ty). E: oído, Sg: glándula submandibular, VII: nervio facial, M: músculo masetero, SMC: músculo esternocleidomastoideo, AD: músculo digástrico vientre anterior, PD: músculo digástrico vientre posterior, Ty: bulla timpánica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> Figura 4:. La disección del músculo elevador del velo palatino (A) Vista general después de la disección del músculo digástrico (vientre posterior). Músculo estilohioideo (St) y el tendón del músculo elevadorvelo palatino puede ser localizada. Nota la tráquea (T) y el esófago (Es) que se ejecuta detrás de él. (B) Después de levantar la tráquea y el esófago de la faringe (P) está expuesta. La inserción del músculo elevador del velo palatino en el paladar blando es ahora visible. La flecha indica el paladar blando diseccionado con los músculos del velo palatino elevador en ambos lados. E: oído, St: músculo estilohioideo, VII: nervio facial, M: músculo masetero, AD: músculo digástrico vientre anterior, PD: músculo digástrico vientre posterior, T: tráquea, Es: esófago, P: faringe, * músculo elevador del velo palatino . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> Figura 5: Aspecto del tejido muscular (A) antes y (B) después de la digestión enzimática con pronasa. Tenga en cuenta que haces musculares parecen estar aflojado después de la digestión enzimática. Figura 6: Pax 7 inmunotinción SCs recién aislados, aplicadas a gel de matriz extracelular en el extremo de aislamiento (aproximadamente 6 horas después de la digestión inicial del tejido).. Cinco campos arbitrarios se contaron usando un objetivo de 10X con un promedio de 210 células por campo. Aproximadamente el 90% de las células son Pax 7 positiva. DAPI: azul, Pax7: rojo. Barra de escala, 100 micras. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> Figura 7:. Pax 7, MyoD inmunotinción Día 4, 7 y 10 cultivos se tiñeron con anticuerpos contra Pax7, y la inmunotinción MyoD. (A - C) y (D - F) fotomicrografías representativas de días 4 y 7 culturas del músculo masetero. (G y H </strong&gt;) El número de Pax7 + y + MyoD núcleos por campo microscópico se contó y se expresó como un porcentaje del número total de núcleos (DAPI). DAPI: azul, Pax7: rojo, y MyoD: verde. Escalas bar, 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> Figura 8:. Distribución de Pax7 ± / ± MyoD en cultivos de células mononucleadas en cultivos de músculo masetero palatina, digástrico y del velo del elevador (A - C) Día 4, 7 y 10 culturas fueron teñidas con anticuerpos contra Pax7 y inmunotinción MyoD. El número total de células se basa en el número de total de núcleos (DAPI). (D) la cuantificación de datos de Pax7 ± / MyoD ± cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> Figura 9:. Inmunotinción miogenina Día 4, 7 y 10 cultivos se tiñeron con anticuerpos contra miogenina. (A - D) microfotografías representativas de días 4 y 7 de las culturas del músculo elevador del velo palatino. (E) El número de MyoG + núcleos por campo microscópico se contó y se expresó como un porcentaje del número total de núcleos (DAPI). Cuantificación (F) Los datos de las células MyoG +. DAPI: azul, miogenina: verde. Escalas bar, 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figur</a>e. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> Figura 10:. Miosina pesada cadena inmunotinción Día 4, 7 y 10 culturas fueron teñidas con anticuerpos contra la cadena pesada de la miosina (MyHC). Microfotografías representativas de días 4, 7 y 10 culturas de la (DIG) músculo digástrico. En el día 7, pequeñas miotubos están presentes, mientras que al día 10 miotubos largas y bien organizados son evidentes. Escalas bar, 200 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Video 1:.. Myotube crispar ejemplos de dos campos representativos con miotubos espasmos se muestran para el día 10 culturas de músculo digástrico <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver el vídeo.</a>

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Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Este protocolo describe el aislamiento de las células satélite de músculos de la cabeza branchiomeric de una rata 9 semanas de edad. Los músculos se originan a partir de diferentes arcos branquiales. Posteriormente, las células satélite son cultivadas en un recubrimiento de punto de tamaño de milímetro para estudiar su diferenciación. Este enfoque evita la expansión y pases de las células satélite.

Aislamiento y caracterización de las células satélite de Músculos Rata Head Branchiomeric

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

isolation-characterization-satellite-cells-from-rat-head

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K vistas.  Radboud University Medical Center.  Este protocolo describe el aislamiento de las células satélite de músculos de la cabeza branchiomeric de una rata 9 semanas de edad. Los músculos se originan a partir de diferentes arcos branquiales. Posteriormente, las células satélite son cultivadas en un recubrimiento de punto de tamaño de milímetro para estudiar su diferenciación. Este enfoque evita la expansión y pases de las células satélite. 

Video: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Aislamiento de Pericitos Tipo I y Tipo II de Músculos Esqueléticos de Ratón

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales cardiacas de Endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Aislamiento y caracterización de humanas derivadas de cordón Umbilical las células madre mesenquimales de prematuros y recién nacidos a término

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...