Name: bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

El protocolo actual ha sido utilizado con éxito para generar de larga duración clones de cDNA infecciosos para dos cepas diferentes (CNU / LP2 27 y SA 14 -14-2 28) de JEV, un flavivirus cuyo cDNA funcional ha demostrado ser inherentemente difícil de construir y propagar debido a la toxicidad de la célula huésped y la inestabilidad genética del cDNA clonado 8,74-76 Este protocolo implica tres componentes principales:. primeros, maximizando la síntesis / amplificación de una copia de ADNc fieles de la ARN viral de alta fidelidad utilizando transcriptasa inversa / ADN polimerasa; segundo, la clonación de la región viral prM-E de codificación que contiene secuencias tóxicas (datos no publicados) 74,77,78 en un muy bajo número de copias del vector BAC a partir del ADNc inicial subclonación a las de longitud completa pasos finales de montaje cDNA; y tercero, la utilización de un BAC vector de clonación que puede acomodar un ADN extraño con un tamaño medio de 120 a 350 kb, 19-21 que aparentemente tolera más grande inse DNArts que hacen otros vectores de clonación. Este enfoque de clonación será generalmente aplicable a muchos otros virus de ARN de cadena positiva, particularmente aquellos con un gran genoma de ARN de ~ 10 a 32 kb. Generación de un clon de cDNA infeccioso es un paso clave en el desarrollo de un sistema de genética inversa para los virus de ARN, especialmente para los virus de ARN de cadena positiva, porque su genoma actúa como ARNm viral que se traduce en proteínas por los ribosomas de la célula huésped. Por lo tanto, la replicación viral puede ser iniciado por la introducción de un genoma de ARN de longitud molécula de ADNc derivado en una célula huésped susceptible. La disponibilidad de un clon de ADNc infeccioso JEV, cuando se combina con la tecnología de ADN recombinante, se ha incrementado nuestra comprensión de los diversos aspectos del ciclo de vida viral a nivel molecular, tales como la expresión génica y la replicación del genoma 73,79. 63,64 Además, una ADNc de longitud completa JEV clon ha demostrado ser una herramienta valiosa para el desarrollo de vacunas antivirales 28 y vectores de suministro de genes. &lt;sup&gt; 80,81 Al igual que con todos los virus de ARN de cadena positiva, hay múltiples pasos críticos en la construcción de un ADNc funcional confiable para JEV partir de la cual RNAs altamente infecciosas se pueden sintetizar in vitro. Idealmente, la secuencia de los ARN sintéticos transcritos a partir de un clon del ADNc de longitud completa debe ser idéntica a la del ARN genómico viral, en particular los 5&#39;-y 3&#39;-terminales secuencias que se requieren para la iniciación de la replicación viral RNA . de 60-62 En el protocolo actual, el auténtico 5&#39;-y 3&#39;-extremos se aseguraron mediante la colocación de la secuencia del promotor SP6 aguas arriba de la primera de nucleótidos de adenina del genoma viral y el posicionamiento de un sitio artificial única restricción Xba I aguas abajo de la última timina nucleótidos del genoma viral, respectivamente. Capsulado RNAs sintéticos con el auténtico 5 &#39;y 3&#39; se produjeron mediante transcripción run-off de un cDNA te Xba I-linealizado y tratado con MBNmplate usando SP6 ARN polimerasa cebada con la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un análogo de tapa. Este protocolo puede ser modificado de varias maneras. Para la transcripción in vitro, otro ARN del bacteriófago polimerasa (por ejemplo, T3 o T7) se puede utilizar en conjunción con su secuencia promotora bien definido. 27 Como un sitio run-off, un sitio de restricción diferente se puede utilizar si no está presente en el genoma viral y si ARN sintético a partir del ADNc linealizado termina con el final auténtico 3 &#39;. La importancia de la secuencia de nucleótidos del extremo 3 &#39;se ha demostrado por una disminución de ~ 10 veces en la infectividad del ARN cuando un ARN sintético contiene tres o cuatro nucleótidos-virus no relacionado en su extremo 3&#39;. 27 En una reacción de transcripción in vitro, tanto la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A y m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G analógico tapa puede ser utilizado igualmente bien, aunque los últimos lugares una relación G nucleótidos extra de aguas arriba de la viral 5 &#39;-end, pero queAdemás no altera la infectividad o replicación del ARN sintético. 27 Por otra parte, la eliminación de la plantilla de ADNc a partir de los transcritos de ARN por digestión con DNasa I no es necesario para las pruebas de ARN de infectividad, porque la plantilla de cDNA en sí no es infecciosa. 27 La tecnología BAC ahora se ha aplicado a la construcción de clones de cDNA infecciosos para un puñado de virus de ARN de cadena positiva, a saber, dos JEVs, CNU / LP2 27 y SA 14 -14-2 28 (tamaño del genoma, ~ 11 kb); dos virus del dengue, BR / 90 26 y NGC 29 (~ 11 kb); la diarrea viral bovina virus, SD1 (~ 12 kb); 25 de dos virus de la peste porcina clásica, C y Paderborn (~ 12 kb); 24 el virus de la enfermedad de fronteras, Gifhorn (~ 12 kb); 24 el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 el virus de la gastroenteritis transmisible, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 el virus de la peritonitis infecciosa felina,DF-2 (~ 29 kb); 32 el síndrome severo coronavirus respiratorio agudo, Urbani (~ 30 kb); 9 el síndrome respiratorio coronavirus Oriente Medio, EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 y el coronavirus humano OC43 (~ 31 kb) 31 La principal ventaja de usar BAC para la construcción de ADNc es la alta estabilidad genética de los grandes, plásmidos BAC de 1 o 2 copias.; sin embargo, la naturaleza intrínseca de su número extremadamente bajo de copia es también una gran desventaja, debido a muy bajos rendimientos de ADN BAC y la consiguiente reducción en la pureza del ADN de BAC con respecto a la sede de ADN cromosómico. En el protocolo actual, el rendimiento de ADN de BAC se maximiza por el crecimiento de E. coli DH10B transformó con el pBAC BAC infeccioso / SA 14 -14-2 en un medio rico en nutrientes, 2xYT. A pesar de este esfuerzo, el rendimiento promedio es de sólo ~ 15 g de ADN BAC a partir de 500 ml de caldo 2xYT. Además, la pureza del ADN de BAC se logra mejor mediante el uso de CsCl-EtBr centrifugación en gradiente de densidad para la purificación, En lugar del plásmido aislamiento basado en columnas de uso común. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la E. BAC-transformado coli no debe crecer demasiado, ya que podría poner en peligro la estabilidad genética del cDNA clonado, y un mayor crecimiento no necesariamente conducir a mayores rendimientos o ADN BAC de mayor pureza. El protocolo descrito aquí es un optimizado, y el método aerodinámico eficiente para la construcción y propagación de una larga duración cDNA clon infeccioso genéticamente estable como un BAC de JEV, un procedimiento, una vez pensó prácticamente imposible. Esta misma estrategia de clonación se puede aplicar también a muchos otros virus de ARN de cadena positiva. En general, los clones de ADNc infecciosos nos permiten introducir una variedad de mutaciones (por ejemplo, deleciones, inserciones, y mutaciones puntuales) en un genoma de ARN viral para estudiar sus funciones biológicas en la replicación viral y la patogénesis. Este sistema de genética inversa basada en cDNA hace que sea posible desarrollar y TESt vacuna y candidatos terapéuticos dirigidos a un factor de virulencia (s) de un virus de ARN de cadena positiva particular de interés. Además, esta tecnología cDNA infeccioso también puede ser utilizado como un vector viral, capaz de expresar un gen extraño (s) de interés para muchas aplicaciones en la investigación biomédica.

Para virólogos de ARN, el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante a finales de 1970 hizo posible convertir genomas de ARN viral en los clones de ADNc, que luego podrían ser propagan como plásmidos en bacterias para la manipulación genética de los virus de ARN. 1 La primera virus de ARN para ser molecularmente clonado se Qß bacteriófago, un virus de ARN de cadena positiva que infecta a Escherichia coli. Un plásmido que contiene una copia completa de ADNc del ARN genómico Qß dio lugar a fagos Qß infecciosas cuando se introduce en E. coli. 2 Poco después, esta técnica se aplicó a poliovirus, un virus de ARN de cadena positiva de los seres humanos y animales. Un plásmido que lleva un ADNc de longitud completa del ARN genómico poliovirus se infecciosas cuando se transfecta en células de mamífero y capaz de producir viriones infecciosos 3 En este enfoque &quot;DNA-puesto en marcha&quot;, los ADNc clonados deben ser transcritas intracelularmente para iniciar la replicación del ARN viral.;Sin embargo, no está claro cómo se inicia la transcripción y cómo las transcripciones se procesan a la secuencia viral correcta. Esta preocupación ha llevado al desarrollo de un &quot;RNA-lanzado&quot; enfoque alternativo, en el que se clona una copia completa de ADNc del genoma de ARN viral bajo un promotor reconocido por una E. coli o ARN polimerasa del fago para la producción de RNAs sintéticos in vitro con definido 5 &#39;y 3&#39;, que se someten al ciclo de replicación viral completa cuando se introduce en células huésped. 4,5 El primer éxito con este enfoque se informó para el virus del mosaico del bromo 6,7, un virus de ARN de cadena positiva de las plantas. Desde entonces, el enfoque de ARN-lanzado ha sido desarrollado para una amplia gama de virus de ARN de cadena positiva, incluyendo calicivirus, flavivirus, alfavirus, arterivirus y coronavirus. 1,4,5,8 Tanto en el ADN y ARN-lanzado sistemas de genética inversa, la construcción de un full de longitud clon de ADNc es la clave para la generación de ADN o ARN infecciosa de los virus de ARN de cadena positiva, pero se convierte en un considerable reto técnico como el tamaño de los aumentos del genoma viral. 9-17 En particular, un gran genoma de ARN de ~ 10 -32 kb presenta tres principales obstáculos para la clonación de un ADNc funcional de cuerpo entero. 18 La primera dificultad es la síntesis de una fiel copia de ADNc, ya que la fidelidad de RT-PCR es inversamente proporcional a la longitud del ARN viral. El segundo obstáculo es la presencia de secuencias potencialmente tóxicos, ya que las moléculas de ARN largas son más propensas a contener secuencias inesperadas capaces de hacer que el fragmento de ADNc en los plásmidos inestables en E. coli. La tercera y más importante problema es la disponibilidad de un vector adecuado, ya que es difícil encontrar un vector de clonación que puede albergar un inserto de ADNc viral de&gt; 10 kb. Durante las últimas tres décadas, estas barreras han sido superadas por varios avances en enzimología, la metodología, un. d vectorología 1,4,5,8 De éstos, el desarrollo más prometedor e innovador es la clonación de grandes virus de ARN de cadena positiva cromosomas artificiales bacterianos (BAC como infecciosas). El vector de BAC es un plásmido de bajo copia clonación (1-2 copias / célula) basado en el E. factor de fertilidad coli, con un tamaño medio de inserto de ADN de ~ 120-350 kb 19 a 21 Un fragmento de ADN se inserta en el vector de BAC en una manera similar a la clonación en vectores de clonación generales.; los clones BAC resultantes son estables a lo largo de muchas generaciones en E. . coli 22,23 Hasta la fecha, la tecnología BAC se ha utilizado para crear clones de cDNA infecciosos para&gt; 10 miembros de tres familias de virus de ARN de cadena positiva, es decir, Flaviviridae, 24-29 de Arteriviridae, 30 y Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 El uso de virus de la encefalitis japonesa (JEV) como ejemplo, el presente trabajo presenta los procedimientos detallados que pueden serutilizado para construir un integral BAC infeccioso genéticamente estable para una variedad de virus de ARN de cadena positiva. JEV es un flavivirus zoonótica 33 que se transmite en la naturaleza entre las aves, cerdos y otros huéspedes vertebrados por mosquitos vectores 34,35. En los seres humanos, la infección por JEV puede causar la enfermedad neurológica encefalitis japonesa a menudo fatal grave (JE), 36 que se produce en Asia y partes del Pacífico occidental, 37,38, con una incidencia anual estimada de ~ 50,000-175,000 casos clínicos. 39,40 El genoma de JEV es un ~ 11 kb, de sentido positivo molécula de ARN de cadena simple y consiste en termina un solo marco de lectura abierto (ORF) flanqueada por dos regiones no codificantes (NCR) en los extremos 5 &#39;y 3&#39;. 41,42 El ORF codifica una poliproteína que se escinde por el anfitrión y proteasas virales para generar 10 proteínas individuales, designada C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5 en el N- a la dirección C-terminal. 34,43,44 Además, un correoforma Xtended de NS1 (NS1) se expresa por -1 frameshifting ribosomal en los codones 8-9 de NS2A. 45,46 De estas 11 proteínas, las tres proteínas estructurales (C, prM y E) son esenciales para la formación de infecciosa viriones, 47,48 y los restantes ocho proteínas no estructurales (NS1 a NS5 y NS1 &#39;) son cruciales para la replicación viral ARN, ensamblaje de partículas 49-51, 52-56 y evasión de la inmunidad innata. 57-59 Tanto el 5&#39; y 3 &#39;NCR contienen conservan secuencias primarias y las estructuras de forma de ARN secundarias / terciarias, 60-62, que son importantes para la modulación de la replicación del ARN viral. 63,64 Este protocolo describe las herramientas, métodos y estrategias para la generación de un larga duración infecciosa BAC de JEV SA 14 -14-2. 28 Este clon BAC funcional contiene una copia completa de ADNc del ARN genómico JEV, 65 que está rodeada por un promotor para la ARN polimerasa SP6 aguas arribadel viral extremo 5 &#39;y un sitio de restricción Xba I único aguas abajo del extremo 3&#39; viral para la transcripción in vitro de escorrentía. Esta tecnología BAC es aplicable a la construcción de un clon de ADNc molecular totalmente funcional para una gran variedad de virus de ARN de cadena positiva.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Molecular Cloning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>50 ml Tube</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Bottle</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Low Melting Point)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cesium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>DE-81 Filter Paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10B&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Toxic and highly mutagenic</td></tr><tr><td>Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Irritating</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>High-fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl Alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Isopropanol&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Mung Bean Nuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Needle (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>Biohazardous (Sharps waste)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom Oligonucleotide Synthesis</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Phenol (Buffer-Saturated)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Toxic and highly corrosive</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Toxic and highly corrosive</td></tr><tr><td>Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Toxic, corrosive, and irritating</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Acetate</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Sealable Polypropylene Tube (16 &amp;times; 76 mm)&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (yeast)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Cell Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (150 mm)&amp;nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette (2-mm Gap)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Toxic and carcinogenic</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Six-Well Plate</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Gel Electrophoresis System</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Desktop Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Para todos los virus de ARN de cadena positiva, la fiabilidad y la eficiencia de un sistema de genética inversa dependen de la estabilidad genética de un ADNc de longitud completa clonado, cuya secuencia es equivalente a la secuencia consenso de ARN genómico viral. 27 La figura 1 muestra un anillo de cinco estrategia de paso para la construcción de un cDNA infeccioso de longitud completa como un BAC para JEV SA 14 -14-2 28: Paso 1, la purificación de ARN viral a partir del sobrenadante de cultivo celular de células BHK-21 infectadas por el JEV (Figura 1A); Paso 2, la síntesis de cuatro amplicones de ADNc superpuestas (F1 a F4) que abarcan todo el genoma viral (Figura 1B); Paso 3, la subclonación de cada uno de los cuatro fragmentos de ADNc contiguas en un vector BAC, creando pBAC / F1 a pBAC / F4 (Figura 1C); Paso 4, la modificación de los ADNc clonados para la transcripción in vitro el escurrimiento con SP6 ARN polimerasa, es decir, la colocación de un SP6secuencia del promotor inmediatamente corriente arriba del extremo 5 &#39;viral (pBAC / F1 SP6), la eliminación de una pre-existente sitio interno Xba I en el nucleótido 9131 mediante la introducción de una mutación puntual silenciosa, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), y la inserción de un sitio de escorrentía nueva Xba artificial inmediatamente aguas abajo de la viral extremo 3 &#39;(pBAC / F4 RO) (Figura 1 D); y el Paso 5, el montaje de un álbum SA 14 -14-2 ADNc BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (Figura 1E) Tabla. 1 se enumeran los oligonucleótidos utilizados en este procedimiento de clonación. 28 Para la construcción de un ADNc JEV funcional, el primer paso importante es la síntesis de los cuatro fragmentos de ADNc solapados utilizando el ARN viral purificado como molde para la RT-PCR. La Figura 2 proporciona un resultado representativo para los cuatro productos de RT-PCR que eran electroforesis en un 0,8%gel de agarosa. Este gel demuestra claramente que un ADNc de longitud completa JEV se amplifica en cuatro fragmentos de ADNc que se solapan. Ocasionalmente, las reacciones de RT-PCR podrían producir uno o más productos específicos del virus o no específicos que son en su mayoría más pequeño que el producto esperado, debido a la hibridación no específica de los cebadores durante la síntesis de ADNc / amplificación. Por otro lado, poca o ninguna espera que el producto de RT-PCR se amplificó debido a la contaminación accidental RNasa durante el aislamiento de ARN viral o impropio rendimiento RT-PCR. El siguiente paso clave es la clonación y la modificación de una de longitud completa parcial- o ADNc JEV en BAC, que es un procedimiento relativamente sencillo que utiliza técnicas estándar de ADN recombinante. 69 Figura 3 presenta un resultado representativo para la purificación del clon BAC que contiene un ADNc de longitud completa de JEV SA 14 -14-2 por bandas en un gradiente de CsCl-EtBr.En este experimento, después de centrifugación durante 16 horas a 401.700 xg, dos bandas distintas, es decir, el E. coli ADN cromosómico anterior y el plásmido de ADN superenrollado BAC a continuación, son visibles en el centro del tubo bajo luz ultravioleta de onda larga. Un volumen mínimo (~ 400 l) de la banda de ADN BAC inferior se recogió cuidadosamente por hacer un agujero con una jeringa en el lado del tubo. Posteriormente, el EtBr se extrajo a partir del ADN de BAC por extracción butanol, y el ADN BAC-EtBr libre se concentró por precipitación con etanol. El paso final es la determinación de la infectividad específica de los RNAs sintéticos transcritas in vitro a partir de longitud completa SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) después de transfección de ARN en las células permisivas (Figura 4). Este paso consiste en tres pasos secuenciales: Paso 1, linealización de los de larga duración SA 14 -14-2 cDNA en el 3 &#39;-end del genoma viral (Figura 4A); Paso 2, la producción de los ARN sintéticos a partir del ADNc linealizado por escorrentía de transcripción (Figura 4B); y el Paso 3, rescate de los virus recombinantes en células BHK-21 transfectadas con los ARN sintéticos (Figura 4C). Experimentalmente, dos clones independientes de pBAC / SA 14 -14-2 fueron linealizados con la digestión XbaI y tratados con MBN para quitar los cuatro-base 5 &#39;saliente generado por la digestión XbaI. Los BAC linealizadas se limpiaron mediante extracción con fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol. La linealización de los dos BAC purificados se demostró en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 5A). La extracción con fenol-cloroformo debe hacerse con cuidado para asegurarse de que la BAC linealizadas son RNasa libre. Cada uno de los dos BAC linealizadas sirvió como molde de ADNc para la transcripción run-off usando SP6 RNA polimerasa en presencia de la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un análogo de tapa. La integridad de los ARN sintéticos se demostró mediante la ejecución de partes alícuotas de las dos mezclas de reacción de transcripción en un gel de agarosa al 0,6%, junto con una referencia 1 kb escalera de ADN (Figura 5B). En este sencillo ensayo, la banda principal de ARN prominente siempre migra justo por debajo de los 3 kb referencia banda de ADN y que parecía ser agudo. Sin embargo, la degradación de ARN tendría una apariencia manchada en el mismo gel. Un ensayo de centro infeccioso es el estándar de oro para determinar la infectividad específica de los ARN sintéticos. Este ensayo se realizó por electroporación células BHK-21 con muestras de ARN, la siembra de la igualdad de alícuotas de las 10 veces las células diluidas en serie a electroporación en placas de 6 pocillos que contienen células ingenuas BHK-21 (3 × 10 5 células / pocillo), y la superposición de agarosa sobre las monocapas de células. Después de la incubación durante 4 días, las células supervivientes se fijaron con formaldehído y se tiñeron con cristal violeta s unaolución para cuantificar el número de centros infecciosas (placas), que corresponde al número de moléculas de ARN infecciosos entregado en las células (Figura 6A). Puesto que el molde de cDNA usado para la transcripción in vitro se ha demostrado ser no infecciosa, 27 una parte alícuota de la mezcla de reacción de transcripción se usó directamente para la electroporación. La electroporación es el método preferido para la transfección de ARN; Alternativamente, los ARN se pueden transfectar por otros métodos que utilizan liposomas DEAE-dextrano y catiónicos. RNA electroporación es muy eficaz, pero &quot;arco&quot; del pulso eléctrico se produce raramente, si sales están presentes en la reacción de electroporación o si la cubeta de electroporación se reutiliza. La expresión de proteínas virales en las células transfectadas con ARN se examinó mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 (Figura 6B). La producción de partículas virales acumulados en los sobrenadantes de células transfectadas con ARN fue unaalyzed por ensayos de placa (Figura 6C). Los resultados de estos experimentos muestran claramente que los RNAs sintéticos derivados de cDNA son infecciosos en células permisivas BHK-21, generando un alto título de virus recombinantes. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucleótido </td><td> Secuencia A (5 &#39;a 3&#39;) </td><td> Posición b </td><td> Polaridad </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1.22 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> HormigaIntuyo </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10952-10977 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956 a 10977 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ejército de reserva </td><td></td><td> Sentido </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 01.14 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670 hasta 10694 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10954 hasta 10.977 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td colspan="4"> unas secuencias JEV se muestran en letras mayúsculas, y las secuencias de BAC se indican en letras minúsculas. posición b nucleótidos se refiere a la secuencia completa del genoma de JEV SA 14 -14-2 (número de acceso GenBank JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Los oligonucleótidos utilizados para la síntesis de ADNc, amplificación por PCR, y mutagénesis de BAC. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figura 1.0; Estrategia para la construcción de un ADNc de longitud completa de JEV SA 14 -14-2 como BAC (A) Aislamiento de ARN viral de partículas JEV.. Se muestra un diagrama esquemático del ARN genómico de JEV SA 14 -14-2. (B) Síntesis de cuatro fragmentos de ADNc superpuestas (F1 a F4) que cubre la totalidad del genoma viral. (C) Subclonación de cuatro fragmentos de ADNc solapados en un vector BAC, creando pBAC / F1 a pBAC / F4. (D) La modificación de los ADNc clonados para la transcripción de escorrentía in vitro. pBAC / F1 SP6 es un derivado de pBAC / F1 que contiene la secuencia del promotor SP6 aguas arriba del extremo 5 &#39;viral. pBAC / F3 KO es un derivado de pBAC / F3 que contiene una mutación silenciosa punto (A → T 9134, asterisco). pBAC / F4 RO es un derivado de pBAC / F4 que contiene un sitio Xba I artificial escorrentía de aguas abajo del extremo 3 &#39;viral. (E </<html> strong&gt;) Asamblea de un álbum SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figura 2. Síntesis de cuatro fragmentos de ADNc superpuestas (F1 a F4) que abarca la longitud completa de ARN genómico de JEV SA 14 -14-2. Los cuatro productos de RT-PCR se evaluaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. M, escalera de ADN de 1 kb. Los tamaños esperados de los cuatro fragmentos de ADNc se indican en la parte inferior de la imagen de gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. La purificación del BAC que contiene un ADNc de longitud completa de JEV SA 14 -14-2. El plásmido BAC está aislado de E. coli DH10B por el método de lisis alcalina y SDS-purificó adicionalmente por bandas en un gradiente de CsCl-EtBr. Se presenta un ejemplo de la gradiente de CsCl-EtBr usando un tubo de polipropileno sellable 16 × 76 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figura 4. Visión general de la recuperación de los virus infecciosos de un álbum JEV SA 14 -14-2 ADNc montado en un BAC. (A) Linealización de la plantilla de cDNA. La larga duración JEV BAC se corta conXba I y se trató con MBN. (B) Síntesis de los transcritos de ARN. El ADNc linealizado se transcribe por la ARN polimerasa SP6 en presencia del 7 m G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un análogo de tapa. (C) La recuperación de la JEVs sintético. Los in vitro ARN transcritos se transfectaron en células BHK-21 mediante electroporación, que genera un alto título de virus sintético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figura 5. Síntesis de los ARN por transcripción in vitro utilizando un JEV BAC de longitud completa como una plantilla de ADNc. (A) Generación de los de larga duración linealizado JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Dos clones independientes de pBAC/ SA 14 -14-2 (CL.1 y CL.2) se linealizadas por digestión con Xba I y posterior tratamiento con MBN. Los BAC linealizadas se examinan por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. (B) Producción de los ARN sintéticos mediante transcripción escorrentía. Cada uno de los dos BAC linealizadas se usa como una plantilla para la transcripción de ARN polimerasa SP6 escorrentía. Las alícuotas de las dos reacciones de transcripción se ejecutan en un gel de agarosa al 0,6%. M, 1 kb escalera del ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figura 6. infectividad específica de los RNAs sintéticos transcritos a partir de un BAC JEV de longitud completa y la recuperación de virus sintético. Células BHK-21 son de forma simulada a electroporación (Mock) o electroporación con los transcritos de ARN derivados from cada uno de los dos clones independientes de los de larga duración JEV BAC (CL.1 y CL.2). (A) la infectividad del ARN. Las células se recubrieron con agarosa y se tiñeron con violeta cristal a los 4 días después de la transfección. RNA infectividad se determina mediante ensayos de centro infecciosas para estimar la cantidad de ARN infecciosa electroporación en las células (panel izquierdo). Además, se muestran imágenes representativas de centros infecciosos (panel derecho). (B) Expresión de proteínas. Las células se cultivan en portaobjetos de cámara de 4 pocillos. Expresión de la proteína viral en células de ARN-a electroporación en 20 horas después de la transfección (hpt) se analizó mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 primaria y una cabra conjugado con Cy3 secundario IgG anti-conejo (rojo). Los núcleos se contratiñeron con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (azul). Las imágenes de inmunofluorescencia se superponen en sus diferenciales correspondientes imágenes de contraste de interferencia. (C) de rendimiento Virus. Las células se cultivaron en 150 mm cultura platos. La producción de viriones infecciosos acumulados en los sobrenadantes de cultivo de células de ARN-electroporación en 22 y 40 hpt es examinado por ensayos de placa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.3K vistas.  Utah State University. Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

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Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

Simple y robusto En vivo Y In vitro Enfoque para el estudio de ensamblaje del virus

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Investigación

Inmunología e Infección

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA viruses. By integrating a full RNA genome error-prone PCR and reverse genetics, random genome-wide substitution mutagenesis can be induced. We have developed a method using this technique to synthesize diverse libraries to identify viral mutants with phenotypes of interest. This method, called full-length mutant RNA synthesis (FL-MRS), offers the following advantages: (i) the ability to create a large library via a highly efficient one-step error-prone PCR; (ii) the ability to create groups of libraries with varying levels of genetic diversity by manipulating the fidelity of DNA polymerase; (iii) the creation of a full-length PCR product that can directly serve as a template for mutant RNA synthesis; and (iv) the ability to create RNA that can be delivered into host cells as a non-selected input pool to screen for viral mutants of the desired phenotype. We have found, using a reverse genetics approach, that FL-MRS is a reliable tool to study viral-directed evolution at all stages in the life cycle of the hepatitis C virus, JFH1 isolate. This technique appears to be an invaluable tool to employ directed evolution to understand adaptation, replication, and the role of viral genes in pathogenesis and antiviral resistance in positive-sense RNA viruses.

The protocol describes a method for introducing controllable genetic diversity in the hepatitis C virus genome by combining full-length mutant RNA synthesis using error-prone PCR and reverse genetics. The method provides a model for phenotype selection and can be used for 10 kb long positive-sense RNA virus genomes.

Genética inversa para diseñar variantes de virus de ARN de sentido positivo

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA ...

Genética

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and assay development in virology. The RNA template of nonsegmented negative-sense (NNS) RNA viruses, such as the respiratory syncytial virus (RSV), is not an RNA molecule alone but rather a nucleoprotein (N) encapsidated ribonucleoprotein complex. Despite the importance of the authentic RNA template, the generation and assembly of such a ribonucleoprotein complex remain sophisticated and require in-depth elucidation. The main challenge is that the overexpressed RSV N binds non-specifically to cellular RNAs to form random nucleocapsid-like particles (NCLPs). Here, we established a protocol to obtain RNA-free N (N0) first by co-expressing N with a chaperone phosphoprotein (P), then assembling N0 with RNA oligos with the RSV-specific RNA sequence to obtain virus-specific nucleocapsids (NCs). This protocol shows how to overcome the difficulty in the preparation of this traditionally challenging viral ribonucleoprotein complex.

For in-depth mechanistic analysis of the respiratory syncytial virus (RSV) RNA synthesis, we report a protocol of utilizing the chaperone phosphoprotein (P) for coexpression of the RNA-free nucleoprotein (N0) for subsequent in vitro assembly of the virus-specific nucleocapsids (NCs).

Generación Y Ensamblaje De Nucleocápsides Específicas Del Virus Respiratorio Sincitial

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Bioquímica

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modelado El ciclo de vida de Ebola Virus Bajo Nivel de Bioseguridad 2 Condiciones Con-Virus como partículas que contienen Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Rescate del virus del Zika recombinante de un clon de ADNc cromosómico artificial bacteriano

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

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