The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.

1. VDJ amplificación 1.1) La extracción de ADN a partir de muestras de tumores <ol><li> Extraer el ADN de las secciones delgadas (10 a 20 micras) de OCT tejidos normales o malignas incrustados congelados. <ol><li> Digerir 10-30 secciones delgadas de tejido embebido cortada por un micrótomo criostato en 4 ml de tampón de lisis nucleico (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; NaCl 0,3 M; 0,002 M Na 2 EDTA) con proteinasa K (0,5 mg / ml, concentración final ) y 0,625% SDS en un tubo de centrífuga de 15 ml en un baño de 37 ° C el agua durante la noche. </li><li> Añadir 1 ml de NaCl saturado (5 M) a la mezcla de digestión y agitar vigorosamente durante 15 s. </li><li> Centrifugar a 1100 xg durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml y añadir dos volúmenes de etanol al 100%. </li><li> Mezclar invirtiendo el tubo 6-8 veces. Centrifugar a 5000 xg durante 60 min a 4 ° C para recoger el ADN precipitado. </li><li> Lavar el sedimento de ADN dos veces con etanol 70%. Centrifuge a 5000 xg durante 15 min cada vez para recoger el sedimento. </li><li> Disolver el ADN en tampón TE de 100-400 l a temperatura ambiente en un agitador durante toda la noche. El rendimiento de ADN es de 5 a 200 g (concentración final de 50-500 entre ng / l), dependiendo del tamaño del tejido </li></ol></li><li> Extraer el ADN de las secciones delgadas (10-20 M) de, incorporado (FFPE) tejido normal o maligno en parafina fijado con formalina. <ol><li> Incubar las secciones de parafina en 1 ml de xileno dos veces a temperatura ambiente durante 10 min cada vez en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para de-paraffinize. Recoger las secciones de tejido haciendo girar a 13.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Incubar las secciones en etanol al 1% dos veces 100 ml a temperatura ambiente, 10 minutos cada vez para eliminar residuos xilenos. Recoger las secciones de tejido haciendo girar a 13.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. La parafina se disuelve completamente en este punto y sólo la sección de tejido restante. </li><li> Seque las secciones en sala de temperatura durante 10-15 min. </li><li> Hacer una solución 0,5 mg / ml de proteinasa K con tampón de PCR 1X (diluido a partir de 10x tampón de PCR con agua libre de nucleasa). Añadir la solución de proteinasa K a las muestras en un volumen final de de 50-100 l e incubar durante la noche a 37 ° C. </li><li> Calentar las muestras a 95 ° C durante 10 min para inactivar la proteinasa K. Nota: En este paso, se disuelve ADN de la muestra en el tampón de PCR y se puede utilizar en los pasos 1.2 y 1.3 directamente. El rendimiento de ADN es de 0,5 a 20 g (concentración final de 10-200 entre ng / l) en función del tamaño del tejido. </li></ol></li></ol> 1.2) Evaluación de la Calidad de ADN <ol><li> Mezclar 0,25 l de ADN polimerasa Taq con 45 l de mezcla maestra del kit escalera comercial en un tubo de PCR. </li><li> Añadir 5 l de ADN preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en el tubo de PCR y mezcle bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. </li><li> Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante7 min; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y mantenga a 15 ° C. </li><li> Preparar un gel de agarosa al 2% en TBE (Tris / borato / EDTA). </li><li> Mezclar 20 l de reacción de PCR con 4 l de colorante de carga 6x, y cargar en un gel de agarosa al 2%. </li><li> Tinción del gel de agarosa con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución / y detectar productos de PCR con un sistema de imaginación gel. Nota: las muestras que producen productos de PCR en 5 tamaños de 100, 200, 300, 400, y 600 pb se continuará para generar amplicones VDJ. PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno potente. Por favor, manejar con extrema precaución con el uso de equipo de protección, es decir, guantes, y disponer en contenedores específicos según las pautas de la institución. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 1 (IgVHFR1) <ol><li> Mezclar mezcla maestra 45 l de la etiqueta del tuboed como &quot;Mix 2&quot; de una somática Hipermutación Ensayo IGH para la detección del gel kit comercial, 0,25 l de ADN polimerasa Taq, y el ADN de la muestra 5 l preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en un tubo de PCR. </li><li> Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante 7 minutos; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y mantenga a 15 ° C. </li><li> Resolver la totalidad del producto de la PCR en un gel de agarosa al 2% por electroforesis. </li><li> Tinción del gel de agarosa con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución / y detectar productos de PCR con un sistema de imágenes de gel. Un amplicón monoclonal se espera que con el rango de tamaño de 310 a 380 pb. </li><li> Extirpar la porción de gel que contiene el amplicón monoclonal entre 310 hasta 380 pb. </li><li> Se purifica el ADN a partir de gel escindido utilizando un kit de extracción en gel estándar de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nota: para muestras que los fragmentos FR1 pudieron obtenerse, no hay necesidad de ampliamente IgVHFR2 y IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 2 (IgVHFR2) <ol><li> Mezclar mezcla maestra 45 l del tubo etiquetado como &quot;Tube B&quot; de un Clonalidad Ensayo IGH gen comercial para el kit de detección de Gel, 0,25 l de ADN polimerasa Taq, y el ADN de la muestra 5 l preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en un tubo de PCR . </li><li> Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante 7 minutos; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y dejar a 15 ° C. </li><li> Resolver la totalidad del producto de la PCR en un gel de agarosa al 2% por electroforesis. </li><li> Visualice producto de PCR (s) en 0,5 g / ml de bromuro de etidio tinción. Un amplicón monoclonal se puede observar dentro de la gama de 250 a 295 pb de tamaño. </li><li> Extirpar la porción de gel que contiene el amplicón monoclonal entre 250-295 pb. </li><li> Se purifica el ADN a partir de gel escindido usando un extracto estándar de Gelion Kit según el protocolo del fabricante. </li></ol> 1.4) Optimizar VDJ PCR <ol><li> Utilice las siguientes condiciones de PCR modificados para amplificar IgVHFR1 y IgVHFR2 utilizando ADN subóptima: 95 ° C por 7 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 60 segundos, 60ºC durante 60 segundos y 72 ° C durante 90 segundos, extensión final a 72 ° C durante 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparación y secuenciación 2.1) Preparación Biblioteca 2.1.1) Fin de reparación <ol><li> Traslado VDJ producto de PCR de 1,3 en un tubo de PCR y añadir tampón de resuspensión de ADN Preparación de muestras Kit para llevar el volumen hasta 60 l. </li><li> Añadir 40 l de reparación Final Mix de Kit de Preparación de ADN de la muestra y mezclar bien. </li><li> Incubar la reacción a 30 ° C durante 30 min en un termociclador precalentado (30 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C. </li><li> Mezclar 136 l perlas magnéticas y 24 g l PCRagua Rade primero en un tubo de 1,5 ml, a continuación, transferir toda la reacción End-reparación de 2.1.1.3 en el tubo de 1,5 ml y mezclar bien con la solución de perlas. </li><li> Colocar los tubos en un soporte magnético durante 2 minutos para permitir la separación de las perlas de la solución. Aspirar el sobrenadante y lavar las perlas con 80% fresca preparada EtOH dos veces mientras el tubo está en el soporte magnético. </li><li> Aspirar la solución de etanol por completo y permitir que las perlas se sequen al aire durante 15 min a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Tome el tubo fuera de la base y volver a suspender las perlas magnéticas en 17,5 l tampón de resuspensión. </li><li> Colocar los tubos de nuevo en el soporte magnético durante 2 minutos para cuentas separadas de la resuspensión de búfer. Retire la resuspensión Buffer (producto final de reparación se vuelve a suspender en el tampón de resuspensión ahora) en un tubo de PCR limpio. </li></ol> 2.1.2) A-tizón <ol><li> Añadir 12,5 l mezcla A-tizón en el tubo de PCR que contiene el producto final de reparación y mezclar bien. </li&gt; <li> Incubar el tubo de PCR a 37 ° C durante 30 min en un termociclador precalentado (37 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adaptador Ligadura <ol><li> Añadir 2,5 l tampón de resuspensión, 2,5 l Ligadura Mix, y 2,5 l Índice adaptador de ADN en la reacción A-tizón. </li><li> Incubar la reacción a 30 ° C durante 30 minl en un termociclador precalentado (30 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C. </li><li> Añadir 5 l Detener Ligadura de búfer en cada reacción y mezclar bien. </li><li> Mezclar 42,5 perlas magnéticas l bien mezclados para limpiar la reacción siguiendo los pasos 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Añadir 50 l tampón de resuspensión para eluir el producto ligado al adaptador. </li><li> Limpiar el producto ligado al adaptador para un segundo tiempo mediante el uso de 50 l bien mezclados perlas AMPure XP, y eluir el producto en 25 l tampón de resuspensión en un tubo de PCR limpio. </li></ol> 2.1.4) Los fragmentos de ADN Amplify <ol><li> Añadir 5 l PCR Primer Cóctel y 25 l PCR Master Mix al tubo de PCR que contiene el producto ligado al adaptador y mezclar bien. </li><li> Realizar la amplificación en un termociclador pre-programado con las siguientes condiciones: 98 ° C durante 30 s; 10 ciclos de 98 ° C durante 10 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos; luego 72 ° C durante 5 minutos y mantenga a 10 ° C. </li><li> Limpiar la reacción mediante el uso de perlas magnéticas 50 l bien mezclados, y eluir el producto final en 30 l tampón de resuspensión. </li></ol> 2.1.5) Biblioteca de Validación <ol><li> Cuantificar el producto final con un fluorómetro utilizando el protocolo del fabricante. Concentración biblioteca final está entre 2.5 a 20 ng / l. </li><li> Evaluar la calidad del producto final mediante el uso de un instrumento analítico con el chip de ADN de alta sensibilidad de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuente con una sola banda con el tamaño esperado para cualquiera IGVHFR1, IGVHFR2 o IGVHFR3. Texpected tamaño del producto biblioteca es igual al tamaño del amplicón VDJ original más el tamaño de los adaptadores (~ 125 pb). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling y secuenciación <ol><li> Calcular la molaridad de cada fracción biblioteca utilizando la siguiente fórmula: nM = [(ng / 1.000) / BP * 660] x 10 9 donde ng es la concentración de la biblioteca VDJ-PCR medida en la etapa 2.1.5.1 y BP es el pico tamaño de la biblioteca VDJ-PCR medida en la etapa 2.1.5.2. </li><li> Diluir la biblioteca para 2 nM (10 l en total) con agua libre de DNasa. </li><li> Combinar los 10 l de las bibliotecas diluidas 2 nM juntos en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Añadir un volumen igual de control de espiga-en PhiX en el tubo de 1,5 ml. </li><li> Cargue la piscina en la concentración de 19:00 en una celda de flujo. </li><li> Secuenciar las bibliotecas utilizando un secuenciador de ciclo de gama emparejado 150 según el protocolo del fabricante. </li></ol> Análisis 3. Datos Nota: Un summario de los guiones bioinformáticos utilizados en esta sección se puede encontrar como un Código Archivo suplementario. 3.1) Alineación y control de calidad <ol><li> Mapa secuenciación de extremo emparejado lee contra un IGH humana V, D y J de base de datos región descargado desde el sitio web de IMGT 11 utilizando un algoritmo explosión de nucleótidos adaptada basada en &#39;blastn&#39; disponible de NCBI con brecha pena de abierto de 2, penalización de extensión de 1, longitud de palabra de 7, y el umbral de e-valor de 10 -4. Deseche el par leer no asignar a la vez un IGH V y una región J. </li><li> Cuente los restantes pares de leer que tienen IGH V y J asignaciones para obtener las frecuencias de juego combinaciones VJ en todos leen pares obtenidos de la ejecución de secuenciación en la muestra. Cuente un par de lectura si se asigna a la vez un IGH V y J gen, y luego añadir su alelo a la cuenta correspondiente a la combinación VJ particular. </li><li> Clasifique los recuentos para cada región VDJ recombinado obtenido a partir de 3.1.2 de la altaest al más bajo. La región VDJ tiene el más alto recuento de lecturas se define como importante combinación reordenamiento. </li><li> Deseche secuencias alineadas que cubren menos del 35% de la importante reorganización de dominio identificado en 3.1.3. </li></ol> 3.2) SHM Perfil de Identificación <ol><li> Cuente todos los patrones SHM través de las lecturas de la etapa 3.1.3. Definir cada patrón SHM como un subclon. </li><li> Cuente el número de los subclones que se corresponden a diferentes patrones únicos SHM, y el número de lecturas que se asigna a subclones individuales. </li></ol> 3.3) La representación gráfica de los resultados <ol><li> Lleve a cabo el análisis filogenético de los subclones utilizando sus correspondientes patrones SHM utilizando un barrio método de unión del paquete R &quot;mono&quot;, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Calcula una matriz de distancia de las alineaciones distintas individuales para recrear la filogenia subclone arraigada a la secuencia de la línea germinal del VJ combinación en cuestión para cada conjunto de muestras pareadas. </li><li> Utilice la secuencia de nucleótidos de cada subclon como vector de caracteres y calcular la distancia cadena aproximada entre todos los subclones en los principales reordenamiento VJ tanto para el diagnóstico y las muestras de recaída correspondientes utilizando una medida de distancia Levenshtein donde matemáticamente la distancia entre dos alineaciones está dada por d x, y (i, j), donde d x, y (i, j) = 1 si i ≠ j y 0 de otro modo, y luego esta función resumen sobre la longitud de la cadena correspondiente a secuencias de nucleótidos i y j. </li><li> Gráficamente mostrar la matriz resultante de las distancias subclone y su población en subclone correspondientes en las siguientes dos maneras: <ol><li> Utilice el paquete R &quot;MASA&quot;, de acuerdo con el protocolo del fabricante para aplicar escalamiento multidimensional a la matriz de distancia subclone y generar un principio de dos dimensiones coordenadas mapa, que luego se traza junto con el logaritmode los recuentos de subclonales como el radio del círculo. </li><li> Construir un grafo no dirigido basado en la distancia Levenshtein, donde los vértices corresponden a cada subclon distinta que surge de la gran reordenamiento VJ. Nota: Si la distancia entre dos clones distintos es igual a uno entonces existe un borde entre estos dos vértices. Si la distancia es mayor que uno, entonces no hay ningún borde de conexión ellos. </li><li> Trazar la gráfica de 3.3.3.2 utilizando la función tkplot en el paquete R &quot;IGRAPH&quot; con la disposición Kamada Kawai según el protocolo del fabricante. El radio de los vértices es proporcional a la raíz al cubo del número total de clones mapeadas a la misma y el sombreado utiliza una gama de color rojo y azul para indicar la proporción de clones que o bien pertenecen al diagnóstico (azul) o recaída (rojo) muestras . </li></ol></li></ol> 3.4) La heterogeneidad (entropía) Medición <ol><li> Examine los números y cuenta subclone delpatrones individuales de hipermutación somática que ocurren en el reordenamiento VJ importante para cada una adscrita conjunto de muestras. </li><li> Calcular la entropía y la entropía empírica empírica residual ajustado por el número de clones distintos en cada muestra utilizando la estimación entropía basado en histograma estándar. </li></ol>

<ol>
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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+recurrence+5+years+or+later+following+diffuse+large+B-cell+lymphoma:+clinical+characteristics+and+outcome.">Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome.</a> J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).</li><li>Friedberg, J. 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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Debido al número casi ilimitado de iteraciones de información de la secuencia codificada por VDJ reordenamiento y SHM en el locus IGH de células B humanas, el examen de todo el repertorio IGH por alto rendimiento en alta secuenciación demostró ser una forma eficaz y completa para delinear clonal y las poblaciones de células B sub-clónicas. Además, esta estrategia se puede utilizar para estudiar la ruta de evolución clonal de desarrollo de células B tumor, remisión y recaída mediante la comparación de las ar...

El cáncer es una enfermedad clonal. Desde hace treinta años, cuando Peter C. Nowell propuso el modelo de evolución clonal del cáncer 1, muchos estudios han tratado de diseccionar poblaciones clonales dentro de las muestras tumorales y reconstruir los patrones de expansión y evolución clonal que subyacen en el proceso de tumorigénesis 2. Recientemente, la secuenciación del genoma ha permitido a los investigadores a tener una mirada profunda a la heterogeneidad clonal y evolución 3,4. Sin embargo, debido a la falta de marcadores tratables en muchos tipos de células, es difícil para inferir la arquitectura clonal precisa y la ruta evolutiva. Afortunadamente hay un marcador clonalidad natural en células B maduras de las que muchas neoplasias linfoides, incluyendo DLBCL, originan. En respuesta a la estimulación antigénica, cada una de las células B puede formar una sola productiva secuencia IgH VDJ uniéndose a un V H (variable), un D (diversidad) y J H (unión) segmento juntos desde un gran número de estos segmentos. Durante este proceso, pequeñas porciones de la secuencia original pueden ser borrados y los nucleótidos no moldeados adicionales pueden añadirse para crear un reordenamiento VDJ único. Este reordenamiento VDJ específico puede ser heredado en toda la progenie de esta célula B, por lo tanto, el etiquetado de las células B individuo maduro y su descendencia 5. Además, SHM se produce en las secuencias VDJ recombinados en la reacción subsiguiente del centro germinal (GC) para introducir mutaciones adicionales para la expansión de la piscina de anticuerpos y la mejora de la afinidad de anticuerpos 6. Por lo tanto, comparando y contrastando los patrones de muestras de linfoma que se han sometido a estos procesos VDJ y SHM, la heterogeneidad intra-tumor podría ser delineado y ruta de evolución clonal de la enfermedad puede ser deducida. Anteriormente, VDJ reordenamiento y SHM podrían ser identificados por PCR amplificando las regiones recombinados, la clonación de los productos de PCR, y posteriormente secuenciación de Sanger para obtener información de la secuencia. Este enfoque is de bajo rendimiento y bajo rendimiento, la recuperación de sólo una muy pequeña parte de todo el repertorio VDJ recombinado, y dificultando la caracterización de la representación general de la población clonal dentro de una muestra dada. Un enfoque modificado fue creado mediante la generación de bibliotecas de secuenciación NGS indexadas a partir de productos de PCR VDJ y la realización de PE secuenciación pb 2x150 para obtener más de medio millón de secuencias VDJ recombinados por muestra. Además, una canalización personalizada fue desarrollado para llevar a cabo control de calidad (QC), alinear, secuenciación VDJ filtro lee para identificar reordenamientos y SHMS de cada lectura, y llevar a cabo el análisis filogenético en la arquitectura clonal de cada muestra. Además, un nuevo enfoque ha sido establecido para caracterizar adicionalmente los patrones de evolución clonal para las muestras recogidas en diferentes etapas de la enfermedad. Hemos aplicado esta técnica para las muestras de pacientes con DLBCL. DLBCL es una forma agresiva de linfoma no Hodgkin con recaídas frecuentes en hasta un ªIRD de los pacientes 7. Recaídas DLBCL normalmente ocurren temprano, en un plazo de 2 a 3 años del diagnóstico inicial, aunque algunos no se dan después de 5 años 8. El pronóstico para los pacientes con recidiva es pobre, con sólo el 10% el logro de 3 años la supervivencia libre de progresión, debido a las opciones de tratamiento limitadas. Esta es la base de la urgente necesidad de nuevos enfoques para el tratamiento de la recaída DLBCL 9,10. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados con DLBCL recaídas siguen siendo en gran parte desconocido. En particular, el papel de la heterogeneidad clonal el momento del diagnóstico y la evolución clonal durante el desarrollo de recaídas DLBCL son actualmente no caracterizado, por lo que es difícil definir un biomarcador precisa y útil para predecir la recaída. Para abordar estas cuestiones, hemos aplicado nuestro enfoque VDJ-secuenciación de múltiples pares de diagnóstico de recaída primaria pares de muestras DLBCL emparejados. Dos escenarios de evolución clonales distintas de recaída surgieron de la comparación de las arquitecturas clonales entre el diagnóstico y samp recaídales sugiere que múltiples mecanismos moleculares puede estar implicada en DLBCL recaída.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89125-170</td>
			<td style="width:197px;">200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">TE buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12090-015</td>
			<td style="width:197px;">10 mM Tris&#183;Cl, pH 8.0; 10mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-XX0055-6</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">U1515</td>
			<td style="width:197px;">10 mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PCR Buffer&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11699105001</td>
			<td>Without MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td style="width:123px;">4311806</td>
			<td>50 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Specimen Control Size Ladder</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>2-096-0020</td>
			<td>33 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:359px;">IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td style="width:123px;">5-101-0030</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>1-101-0020</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">M8291</td>
			<td>20 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Corning (cellgro)</td>
			<td style="width:123px;">46-011-CM</td>
			<td style="width:197px;">6x1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50X TAE BUFFER&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101414-298</td>
			<td style="width:197px;">1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:197px;">10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">25 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10597011</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15628-019</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td style="width:197px;">500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610144</td>
			<td style="width:197px;">500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:197px;">50 columns</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A63881</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">Q32854</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:123px;">5067-4626</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">MiSeq</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Magnetic stand</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4457858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:359px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>170-8370</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vdj-seq: deep sequencing analysis of rearranged immunoglobulin heavy chain gene to reveal clonal evolution patterns of b cell lymphoma

Clonalidad tumor comprensión es fundamental para la comprensión de los mecanismos implicados en la tumorigénesis y la progresión de la enfermedad. Además, la comprensión de los cambios en la composición clonal que se producen dentro de un tumor en respuesta a ciertos micro-entorno o tratamientos puede conducir al diseño de los enfoques más sofisticados y eficaces para erradicar las células tumorales. Sin embargo, el seguimiento de tumores clonales subpoblaciones ha sido difícil debido a la falta de marcadores distinguibles. Para abordar este problema, un protocolo VDJ-ss fue creado para rastrear los patrones de evolución clonal de linfoma de células grandes B (DLBCL) recaída difusa mediante la explotación de recombinación VDJ e hipermutación somática (SHM), dos características únicas de los linfomas de células B. En este protocolo, la secuenciación de próxima generación (NGS) bibliotecas con potencial de indexación se construyeron a partir de la cadena pesada de inmunoglobulina amplificado reordenado (CIB) región VDJ de pares de diagnóstico primario y la recaída samp DLBCLles. En promedio se obtuvieron más de medio millón de secuencias VDJ por muestra después de la secuenciación, que contienen tanto VDJ reordenamiento e información SHM. Además, se desarrollaron tuberías bioinformática personalizadas para utilizar plenamente la información de secuencia para la caracterización de CIB-VDJ repertorio dentro de estas muestras. Además, la tubería permite la reconstrucción y la comparación de la arquitectura clonal de los tumores individuales, lo que permite el examen de la heterogeneidad clonal dentro de los tumores de diagnóstico y deducción de los patrones de evolución clonal entre diagnóstico y pares de recaída del tumor. Al aplicar este análisis a varios pares diagnóstico de recaída, descubrimos evidencia clave de que múltiples patrones evolutivos tumorales distintivo podrían llevar a DLBCL recaída. Además, este enfoque se puede ampliar a otros aspectos clínicos, como la identificación de la enfermedad residual mínima, seguimiento de los avances recaída y la respuesta al tratamiento y la investigación de repertorio inmunológicoes en contextos no-Hodgkin.

El procedimiento general de secuenciación VDJ (VDJ-SEC), incluyendo la extracción de ADN, recombina VDJ región de amplificación y purificación, la construcción de bibliotecas de secuenciación, se lee en el procesamiento y el análisis filogenético, está representado en la Figura 1. Rutinariamente de 5-200 g de ADN puede ser recuperada a partir de secciones de tejido sólido congelado o 0,5 a 20 g de ADN a partir de secciones de tejidos embebidos en parafina fijado en formol. De...

Watch this Scientific Journal Video about VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma at JoVE.com

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

VDJ-Sec: Análisis de secuenciación profunda del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina reordenados para revelar clonal Evolución Patrones de linfoma de células B

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

JoVE Journal

Medicine

26.5K vistas.  Weill Cornell Medical College. This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes. 

Video: VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

La disección de los elementos humanos Cuerpo Vítreo para el análisis proteómico

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Investigación

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cánceres

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

ADN vectorial basado en el ARN de interferencia para estudiar la función génica en el cáncer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Deep Neuromuscular Blockade Leads to a Larger Intraabdominal Volume During Laparoscopy

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that lowering the insufflation pressure during surgery may reduce the risk of post-operative pain. In this pilot study, a method is presented for measuring the intra-abdominal space available to the surgeon during laproscopy, in order to examine whether the relaxation produced by deep neuromuscular blockade can increase the working surgical space sufficiently to permit a reduction in the CO2 insufflation pressure. Using the laproscopic grasper, the distance from the promontory to the skin is measured at two different insufflation pressures: 8 mm Hg and 12 mm Hg. After the initial measurements, a neuromuscular blocking agent (rocuronium) is administered to the patient and the intra-abdominal volume is measured again. Pilot data collected from 15 patients shows that the intra-abdominal space at 8 mm Hg with blockade is comparable to the intra-abdominal space measured at 12 mm Hg without blockade. The impact of neuromuscular blockade was not correlated with patient height, weight, BMI, and age. Thus, using neuromuscular blockade to maintain a steady volume while reducing insufflation pressure may produce improved patient outcomes.

This article presents a method for measuring the working abdominal volume during laproscopic myomectomy using the surgical grasper, and applies this technique to obtain pilot data on whether deep neuromuscular blockade (NMB) can enable the use of lower insufflation pressure. Reduced insufflation pressure during laproscopic surgery has been shown to reduce post-operative pain, and thus the use of NMB during surgery may enable improved patient outcomes.

El bloqueo neuromuscular profundo lleva a un volumen intraabdominal más grande durante la laparoscopia

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that ...

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of breast tissue patterns in mammograms. We hypothesize that architectural distortion modifies the normal orientation of breast tissue patterns in mammographic images before the formation of masses or tumors. In the initial steps of our methods, the oriented structures in a given mammogram are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect node-like sites of radiating or intersecting tissue patterns. Each detected site is then characterized using the node value, fractal dimension, and a measure of angular dispersion specifically designed to represent spiculating patterns associated with architectural distortion.
Our methods were tested with a database of 106 prior mammograms of 56 interval-cancer cases and 52 mammograms of 13 normal cases using the features developed for the characterization of architectural distortion, pattern classification via quadratic discriminant analysis, and validation with the leave-one-patient out procedure. According to the results of free-response receiver operating characteristic analysis, our methods have demonstrated the capability to detect architectural distortion in prior mammograms, taken 15 months (on the average) before clinical diagnosis of breast cancer, with a sensitivity of 80% at about five false positives per patient.

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms. Oriented structures are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect sites of radiating tissue patterns. Each site is characterized and classified using measures to represent spiculating patterns. The methods should assist in the detection of breast cancer.

La detección de la distorsión de la arquitectura en las mamografías previas<em&gt; Vía</em&gt; Análisis de los patrones Orientadas

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Modelos De Interacción Gen-Ambiente Para Desenmascarar Los Mecanismos De Susceptibilidad En La Enfermedad De Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Enfoque Formación: Un análisis basado en células para determinar el potencial oncogénico de un gen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

La secuenciación profunda imparcial de virus de ARN de muestras clínicas

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. However, a specific immunoglobulin E (IgE) measurement system with a high price-performance ratio is lacking in mainland China, especially in the primary care hospitals. This paper describes the principle and operation procedures of using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system to detect allergen-specific IgE in serum. The results were compared with those from ImmunoCAP (System 1), the industrial standard, and the reproducibility of the system to detect patients sensitized to common allergens is evaluated. The results showed that in comparison with ImmunoCAP (System 1), the BioIC System (System 2) has good precision and sensitivity in detecting serum-specific IgE against various inhalant and food allergens but with a significantly lower cost. It can serve as a good alternative to System 1 in primary care hospitals in mainland China who have lower financial affordability.

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

This paper presents a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E with a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system and the evaluation of its usefulness in allergy diagnoses.

Aplicación de la tecnología de microfluidos Biochip para detectar suero alergénico-específicos de la inmunoglobulina E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...