Name: porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells
Uploaded: 2015-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells at JoVE.com

We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Los siguientes protocolos se describen métodos para el cultivo y el estudio de la invasión por las especies anaerobias, P. gingivalis; sin embargo, estos protocolos pueden ser utilizados para una serie de patógenos anaerobios. Aunque se utilizan HUVECs, este protocolo puede ser utilizado para otras células eucariotas, tanto inmunes y no inmunes. 1. anaeróbico Cámara de uso y mantenimiento Nota: P. gingivalis es un anaerobio sensible a los niveles normales de oxígeno encontrado en el aire ambiente. Un ambiente anaeróbico controlado es vital para el cultivo de P. gingivalis. <ol><li> Aquí, mantener una atmósfera artificial designado como gas anaeróbico mixta (80% N 2, 10% H 2, 10% de CO 2) en una cámara anaeróbica de vinilo (Figura 1A). Utilice una esclusa de aire (Figura 1B) para la transferencia de los artículos en el entorno del laboratorio a la cámara anaeróbica. La esclusa de aire opera manualmente, twpurga hielo con gas N2 antes de introducir el gas anaeróbico mixta. </li><li> Utilice una columna de eliminación de sulfuro de hidrógeno (Figura 1C) para la eliminación libre de mantenimiento del sulfuro de hidrógeno indeseable. Coloque un deshumidificador dentro de la cámara para eliminar el H 2 O creado por el catalizador y para evitar los aerosoles que facilitan la dispersión de la contaminación. Nota: El sulfuro de hidrógeno es un subproducto metabólico natural de muchas bacterias anaerobias y su acumulación es tóxico para las bacterias y puede resultar en el daño a la electrónica y disminuir el tiempo de vida de un catalizador. </li><li> Utilice una caja de ventilador para hacer circular la atmósfera de la cámara a través de un catalizador de paladio, que elimina el oxígeno en presencia de hidrógeno (Figura 1D). Nota: Un atmosférica (HEPA) elimina la recirculación de contaminantes en el aire con un tamaño de 0,22 micras o más grandes. </li><li> Bacterias anaerobias Cultura en una incubadora a 37 ° que se encuentra dentro del anaeróbicocámara. Utilizar técnicas asépticas estándar cuando se trabaja dentro de la cámara anaeróbica. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figura 1. cámara anaeróbica de vinilo y sus componentes. (A) una cámara anaeróbica de vinilo sellada completamente de oxígeno atmosférico proporciona espacio de trabajo para dos personas a la vez (32 x 78 en in). Contiene una incubadora a 37 ° C (media de la espalda). (B) Una esclusa de aire se utiliza para la transferencia de los artículos en el entorno de laboratorio a la cámara anaeróbica. En la foto, una esclusa de aire automático operado a través de un controlador que puede ser programado para realizar automáticamente los procedimientos de vacío y purga necesarios para crear un ambiente anaerobio. (C) Un sulfuro de hidrógeno Columna Remoción proporciona la eliminación de gran capacidad sin necesidad de mantenimiento de sulfuro de hidrógeno indeseable. (D) Dos cajas de ventiladores catalizador soncolocado en toda la cámara anaeróbica para ayudar a circular la atmósfera de la cámara a través de catalizador de paladio, el cual, en presencia de hidrógeno, elimina el oxígeno. La cámara anaeróbica está configurado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. Preparación de bacterias anaerobias Nota: P. gingivalis es aerotolerant y puede ser almacenado en condiciones aeróbicas pero no va a crecer en la presencia de oxígeno a niveles superiores a 6% 17,18. Una cámara anaeróbica es necesario para el cultivo apropiado de P. gingivalis y otras especies anaerobias (Figura 1). Se requiere capacitación adecuada y la educación sobre el uso de cámara anaeróbica antes de trabajar con microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrar todos los medios líquidos y placas a Condit anaeróbicoiones durante al menos 12 horas antes de la experimentación para eliminar el oxígeno residual. </li><li> Traslado P. gingivalis desde -80 ° C congelador para cámara anaeróbica, permiten deshielo. </li><li> Streak P. gingivalis en placas de agar sangre tripticasa de soja (TSA II con 5% de sangre de oveja). Envuelva las placas en parafina y se almacena a 37 ° C en una incubadora anaeróbico durante 4-7 días. </li><li> Inocular P. gingivalis en 3 ml de infusión de cerebro corazón (BHI) suplementado con hemina y menadiona, un enriquecidos medios líquidos no selectivos para el aislamiento y cultivo de anaerobios y microorganismos exigentes, utilizando bucles estériles. Nota: Para el almacenamiento a largo plazo, mezclar cultivos bacterianos preparados en BHI con glicerol o DMSO (concentración final 10 a 20%), y meterlo en un congelador a -80ºC. </li><li> Preparar un cultivo iniciador de P. gingivalis haciendo una dilución 1:10 y permitiendo que las bacterias crecen hasta la fase semilogarítmica. </li></ol> Nota: La densidad óptica de la bacsuspensión terial se determina y la concentración bacteriana para cada cepa ser examinado se ajusta. Para P. gingivalis una suspensión a una DO 660 de 0,7 corresponde a la fase semilogarítmica y ~ 7 x 10 8 células / ml. Las condiciones de crecimiento descritas en el protocolo anterior son específicos para P. gingivalis y pueden necesitar ser adaptado para otras cepas bacterianas. 3. Cultivo Celular Endotelial Nota: Compra agruparon HUVECs primarias y cultivo en medio basal que contienen factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a 37 ° C en 5% de CO 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> HUVECs de semillas en matraces T-75 en 2.5 x 10 5 células / matraz de 15 ml en los medios de comunicación VEGF. Nota: Consulte la viabilidad a través de una dilución 1: 1 con 4,0% de azul de tripano. Las células con una membrana comprometida retendrá azul tripán, aparecerá blanco células sanas con membranas intactas cuando se observa bajo un microscopio óptico binocular. CounT 100 células, asegúrese de que más del 80% de las células son viables 20. </li><li> Reemplace los medios cada 2 días con pre-calentado medios VEGF fresca hasta que las células alcanzan ~ 80% de confluencia. </li><li> Lavar las células una vez con PBS pre-calentado. Libera a las células del matraz T75 mediante incubación con 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 5 min seguido de una solución neutralizante 2 ml de tripsina. </li><li> Recoger HUVECs en suspensión en un tubo cónico de 50 ml. Lavar las células adicionales de T-75 frascos con PBS y transferir a 50 ml tubos cónicos. </li><li> Células centrifugar a 200 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante, suspender el sedimento celular en 10 ml de medio de VEGF pre-calentado. </li><li> Determinar la concentración de células utilizando un hemocitómetro o un dispositivo de recuento de células similar. </li><li> Calcular la cantidad de suspensión celular para agregar a cualquier placa de 6 pocillos (400.000 / pocillo) o una placa de 12 pocillos con cubreobjetos (50.000 / pocillo). HUVECs estará listo para la experimentación el día siguiente. </li></ol> 4. Supervivencia ensayo de invasión / Interacción(Enchapado) Nota: Al realizar este ensayo, se preparan dos placas de 6 pocillos de células endoteliales sembradas a 400.000 células / pocillo. Una placa se usa para evaluar las bacterias unidas a y internalizados por células huésped. La otra placa dará cuenta de bacterias intracelulares. La placa de 6 pocillos permite triplicados de dos muestras que se realizan en un solo experimento. Para una descripción de este protocolo por favor refiérase al diagrama de flujo ensayo de supervivencia (Figura 2). <ol><li> Preparar las bacterias anaerobias como se describió anteriormente (véase la sección 1) hasta que alcancen un crecimiento semilogarítmica (OD 660 0,5-0,7). </li><li> Bacterias centrifugar a 5000 xg durante 10 min. Nota: Si centrífuga es cámara anaeróbica exterior, llevar muestras de bacterias en un tubo de 15 ml cerrado herméticamente, envuelva la tapa con parafilm para evitar la fuga de oxígeno. </li><li> Coloque granulado P. gingivalis atrás en la cámara, se descarta el sobrenadante. Lavar con PBS, las bacterias de pellets de nuevo antes de la resuspensión de VEGF mídia. Preparar suspensiones para todas las cepas bacterianas a ensayar a una DO 660 de 0,7 que corresponde a la fase semilogarítmica (~ 7 x 10 8 células / ml). Las bacterias están ahora listos para la infección. </li><li> Transferencia de placas de 6 pocillos que contienen HUVECs de cultivo de tejidos incubadora en la cámara anaeróbica. Retire los medios de comunicación y lavar tres veces con PBS anaeróbico. Añadir 2 ml de medio anaeróbico VEGF a cada pocillo y colocar las placas a 37 ° C en la incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar la temperatura para la infección. Nota: Las bacterias de la placa sobre placas de agar sangre para garantizar las utilizadas para la infección son homogéneos y no contaminada tras la infección. </li><li> Infectar células huésped con bacterias a una multiplicidad de infección (MOI: bacterias anfitrionas) de 100: 1. Nota: el número de células HUVEC se determina mediante la realización de una prueba de exclusión tripano en un solo pozo antes de la infección. El número de células bacterianas se determina mediante densidad óptica (por ejemplo, OD de 0,5 x 5 = 10 8 células / ml). segundoconcentración acterial se ajusta a MOI adecuado basado en la concentración HUVECs 21. </li><li> Colocar placas de 6 pocillos con HUVECs infectadas en incubadora anaeróbica y permiten que las bacterias interactúan con las células huésped durante 30 min. </li><li> Preparar saponina en BHI (1,0% w / v) dentro de la cámara anaeróbica y filtrar a través de un filtro de 0,2 micras. </li><li> La supervivencia de ambas bacterias adheridas y internalizados. <ol><li> Retire las placas de la incubadora, los medios de aspirado, lavado tres veces con PBS y anaeróbico añaden 2 ml filtran 1,0% saponina (preparado como se describe en el paso 4.8). Incubar durante 15 min para permitir la lisis de la célula huésped. </li><li> Raspar el fondo de cada pocillo con rascador de células. Recoger la mezcla de células de cada pocillo y hacer una dilución 1: 1 en BHI. </li><li> Proceda a realizar diluciones seriadas de la muestra. Dependiendo de las especies bacterianas y concentración, ajuste diluciones en serie. Comience con 1: 100 o 1: 1000 diluciones. </li><li> Placa 200 l de la dilución deseada sobre placas de agar sangre. Wrap tél placas en parafina y el lugar en la incubadora anaeróbica a 37 ° C. </li><li> Después de siete días de incubación a 37 ° C, retirar las placas y contar unidades formadoras de colonias (UFC) utilizando una caja de luz para contar manualmente colonias. Nota: UFC se enumeran. Para cantidades más grandes de UFC, las imágenes pueden ser tomadas y los programas informáticos se pueden utilizar para facilitar el recuento de UFC. </li></ol></li><li> La supervivencia de las bacterias internalizadas. <ol><li> Retire las placas de la incubadora. Lavar tres veces con PBS anaerobio y añadir 2 ml de medios suplementados con VEGF antibióticos (300 g / ml de gentamicina y 400 g / ml de metronidazol). </li><li> Incubar durante 1 hora. Asegúrese de probar los antibióticos por lo que son 100% eficaz en matar la cepa bacteriana deseado y asegurarse de que no penetran en las células huésped 22,23. </li><li> Aspirar los medios de comunicación, añadir 2 ml de filtrada 1,0% saponina. Incubar durante 15 min para permitir la lisis de la célula huésped. </li><li> Raspe parte inferior de cada well con rascador de células. Recoger la mezcla de células de cada pocillo y hacer dilución 1: 1 en BHI. </li><li> Preparar diluciones seriadas de la muestra (1: 100, 1: 1000). </li><li> Placa 200 l de la dilución deseada sobre placas de agar sangre. Envuelva las placas en parafina y colocar en la incubadora anaeróbico. </li><li> Después de siete días de incubación a 37 ° C eliminar los platos y contar UFC. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figura 2. Representación esquemática de un protocolo utilizado para la supervivencia de las bacterias anaerobias con células eucariotas. Ambos ensayos para una supervivencia total de bacterias y la supervivencia de las bacterias internalizadas se pueden realizar al mismo tiempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 5. La internalización de bacterias en Host CeLLS (fluorescente Microscopy) Nota: P. gingivalis se etiqueta con 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo (BCECF-AM). BCECF-AM es un colorante de la membrana permeable no fluorescente; su conversión a BCECF fluoresceína a través de la acción de esterasas intracelulares puede indicar la viabilidad celular. P. gingivalis se etiqueta con el BCECF-AM colorante y luego se usa para infectar células eucariotas. Después de la infección, las células se fijan y se marcaron con DAPI y TRITC-faloidina. La mancha DAPI se utiliza para teñir el núcleo de la célula eucariota también etiquetar núcleo de la célula bacteriana, que proporciona una contramedida para identificar bacterias no viables que pueden no metabólicamente pegue BCECF-AM. Las células huésped se destacan con TRITC-phalloidin, un tinte rojo actina. <ol><li> Cubreobjetos autoclave. Añadir asépticamente cubreobjetos a placas de 12 pocillos antes de la siembra de células endoteliales a 5 x 10 4 células / pocillo. (Preparado días antes de experimento) </li><li&gt; tienen células endoteliales preparadas en 18 mm (# 1.5) de espesor cubreobjetos circulares en placas de 12 pocillos como se describió anteriormente. </li><li> Preparar bacterias anaeróbicas que crecen a mediados de la fase de registro (OD 660 = 0,5 a 0,7) como se describe en el apartado 1. </li><li> Bacterias Lavar 2 veces con PBS anaerobio por centrifugación a 5000 xg y se suspende el sedimento en PBS a 5-7 x 10 8 células / ml. </li><li> Añadir 20 l de 0,2 mM BCECF-AM a 2 ml de suspensión bacteriana (5-7 x 10 8 células / ml) a una concentración final de BCECF-AM de 2 mM. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. </li><li> Placas de transferencia con las células endoteliales sembradas en 18 mm (# 1.5) de espesor cubreobjetos circulares de cultivo de tejidos incubadora en la cámara anaeróbica. Lavar con PBS y el intercambio con los medios de comunicación VEGF anaeróbico. Nota: Verifique que HUVEC están sanos bajo un microscopio óptico. HUVECS debe ser ~ 80% de confluencia, la morfología debe ser comparable a los fabricantes. </li><li> Centrifugar etiquetados bacterias en5.000 xg durante 10 min para eliminar residual colorante BCECF-AM. Suspender en 2 ml de medio VEGF anaeróbico. </li><li> Infectar células huésped con bacterias marcadas en MOI de 100: 1 (bacterias: host). </li><li> Incubar en cámara anaeróbica a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Después de la infección las células de lavado con PBS tres veces y fijar en recién preparada 4,0% de paraformaldehído durante 10 min. Nota: Después de fijar las células, el experimento puede llevarse a cabo fuera de la cámara anaeróbica. </li><li> Wash cubreobjetos con PBS tres veces. </li><li> Añadir 1 ml de 0,2% Triton X-100 durante 10 min. </li><li> Wash cubreobjetos con PBS tres veces. </li><li> Añadir 50 l de TRITC faloidina (50 g / ml) a cubreobjetos durante 45 min. </li><li> Lave cubreobjetos tres veces, retirar de la placa de 12 pocillos y el lugar en un portaobjetos con medio de montaje-set blanda que contiene DAPI. Selle los lados con esmalte de uñas. Nota: Las diapositivas se puede conservar durante un par de meses en la oscuridad. Evitar exposición a la luz para evitar la foto-blanqueo. </li><li> Ver diapositivasutilizando un microscopio confocal. <ol><li> En este caso, utilizar un sistema de 34 canales espectrales (detector de red de 32 canales y dos detectores PMT lado, además de un detector de luz transmitida) configurado en torno a un AxioObserver (invertida) de pie con una etapa de XY motorizado. El sistema cuenta con cinco rayos láser: diodo azul (405 nm), varias líneas de argón (458, 488, 514 nm), el diodo verde (561 nm), HeNe rojo (633 nm) y un láser pulsado nm 440. Equipa un sistema de imágenes de vida de fluorescencia con 2 detectores híbridos GaAsP (para FRET Flim). </li><li> Detectar la fluorescencia de DAPI y TRITC en un canal utilizando un filtro de doble banda con longitudes de onda de excitación de 340-380 nm y 540-560 nm, y un filtro de emisión de 435 a 485 nm y 570 a 590 nm, respectivamente. Detectar fluorescencia de BCECF-AM utilizando un filtro con excitación longitud de onda de 440 a 500 nm y un filtro de emisión de 510 a 590 nm. Nota: Los controles para BCECF-AM se debe hacer en cada cepa bacteriana siendo estudiado para garantizar el etiquetado adecuado de bacterias viables. Primero validar que nonviabbacterias le son DAPI-positivas y BCECF negativo. En segundo lugar, asegúrese de que las bacterias vivas pueden metabolizar BCECF-AM en BCECF fluoresceína. Concentraciones variables de las bacterias o BCECF-AM tinte pueden necesitar ser probado para el etiquetado óptimo. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Todos los métodos anteriores se pueden utilizar para diseñar ensayos específicos para evaluar la interacción de las bacterias anaeróbicas con células eucariotas. Sin embargo, hay varias consideraciones para realizar con éxito los experimentos. Primero están los cepas microbianas para ser utilizados en un estudio. Es crucial en la comparación de dos cepas tanto con el ensayo de supervivencia así como por análisis de microscopía de que están en fases de crecimiento similares y alc...

Las bacterias anaerobias colonizan casi todas las superficies del cuerpo humano. Aunque predominante en la flora de los tractos intestinales y genitourinarias, donde las concentraciones de oxígeno son bajos, sino que también existen en altos niveles en la piel, la boca, la nariz y la garganta 1. Las bacterias anaerobias son una causa común de infecciones endógenas y se aíslan con frecuencia de sitios enfermos. Sin embargo, debido a su naturaleza fastidioso, anaerobios pueden ser difíciles de aislar y cultivar. Los estudios que incluyen bacterias anaerobias deben realizarse bajo condiciones restringidas. Técnicas anaeróbica de cultivo modernos permiten a los investigadores para imitar la configuración anaeróbicas necesarias para estudiar muchas cepas de laboratorio anaeróbico o incluso aislados clínicos 2,3. Bacterias anaerobias patógenas han desarrollado una relación dinámica y co-evolución con las células huésped en las que residen. La mayoría de los anaerobios son susceptibles a la destrucción por la respuesta inmune del huésped antes de llegar a infectiniveles sas. Sin embargo, algunas bacterias patógenas han desarrollado mecanismos para escapar de o subvertir el respuesta inmune del huésped. Logran este objetivo a través de mecanismos tales como la evasión de reconocimiento inmune, la neutralización de mediadores inmunes, alteración de la inmunidad celular, la invasión de las células huésped, y la alteración de inmune de señalización 4. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativas implicado en tanto oral como enfermedades extraorales, es un ejemplo de un patógeno bacteriano altamente adaptada capaz de causar cambios patógenos en el hospedador 5-7. Los bolsillos de la placa de biofilm devengan en profundas grietas que se forman entre los dientes y la mucosa gingival tejido pueden albergar bacterias anaerobias que están protegidos de oxígeno atmosférico 8. Estas bolsas periodontales sirven como un nicho para diversos patógenos anaerobios, tales como P. gingivalis 9. P. gingivalis es un patógeno piedra angular que es capaz de remodelacióning la comunidad microbiana oral en formas que promuevan el desarrollo y la progresión de las enfermedades periodontales 10. Produce un gran número de factores de virulencia que son activos contra un amplio espectro de proteínas del huésped y proporciona mecanismos para la evasión de las defensas del huésped 11. También es capaz de invadir células epiteliales, endoteliales, fibroblastos, y células del ligamento periodontal in vitro 12-14 in vivo 15. Al invadir con eficacia las células huésped, P. gingivalis puede escapar la inmunidad del huésped. Invasión eficaz de las células huésped no sólo permite la bacteria para escapar de las defensas del huésped sino que también sirve como un depósito para futuras re-infección, así como altera la célula huésped. Se necesitan estudios de los mecanismos moleculares implicados en la adhesión y la internalización de la bacteria por células huésped. La investigación en varios laboratorios se centra en la comprensión de los eventos moleculares asociados con la internalización de P. gingivalis por las células huéspedasí como los mecanismos utilizados para reprimir y secuestrar la respuesta inmune y sobrevivir a los mecanismos de defensa del huésped hostiles. Hay muchos ensayos capaces de identificar y caracterizar los agentes patógenos que son capaces de invadir células huésped. Sin embargo, los estudios in vitro con patógenos anaeróbicos plantean muchos problemas experimentales para el investigador principalmente porque es difícil llevar a cabo estudios que se basan en instrumentos voluminosos en la ausencia de oxígeno. Esto se ve agravado por el hecho de que las células eucariotas requieren oxígeno para crecer y por lo tanto deben ser preparados por separado en incubadoras de cultivo de tejidos. Una forma de evitar estos obstáculos sería realizar los estudios con el oxígeno del aire, pero eso haría que el crecimiento de las bacterias anaerobias imposible. Otro método sería utilizar bacterias muertas por calor para infectar y estudiar las interacciones de la célula huésped. Sin embargo, existen diferencias entre las bacterias muertas por calor y viables que disminuyen la relevancia de la interacti huésped-patógenoel 16. Es fundamental para estudiar bacterias viables con la expresión inalterada la interacción con las células huésped; por lo tanto, métodos para el cultivo de P. se dan gingivalis en un entorno anaeróbico. También, dos protocolos rentables simples se demuestran para la evaluación de la capacidad de P. gingivalis a ser internalizado por las células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC). El primer protocolo se basa en el ensayo de protección populares antibiótico. Aunque el ensayo es sencillo, se dan consideraciones al utilizar microorganismos anaerobios. El segundo protocolo requiere el uso de un microscopio de barrido fluorescente para visualizar la interacción e internalizado P. gingivalis. Cada ensayo tiene sus limitaciones y ventajas que se tratarán de proporcionar al investigador un esquema para el estudio de la invasión de bacterias anaerobias. Aunque el manuscrito actual estudia P. gingivalis y HUVECs, estos protocolos se pueden utilizar para muchas otras bacterias anaerobias, asíEn cuanto a otros tipos de células huésped.

<table><tbody><tr><td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td><td>Coy Laboratory Products</td><td></td><td>Model 2000 incubator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>BBL</td><td>221261</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td><td>LifeLine Technology</td><td>FC-0044</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td><td>LifeLine Technology</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>TrypKit</td><td>LifeLine</td><td>LL-0013</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Riedel-de Haen</td><td>16109</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1264</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3761</td><td></td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>LifeTechnologies</td><td>B1150</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Phalloidin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circular Coverslips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

Las bacterias anaerobias son mucho más numerosos aerobios en muchos nichos humanos, como el intestino, la boca y la vagina. Además, las infecciones anaeróbicas son comunes y con frecuencia de origen indígena. La capacidad de algunos patógenos anaeróbicos para invadir las células humanas les da medidas de adaptación para escapar de la inmunidad innata, así como para modular el comportamiento de la célula huésped. Sin embargo, lo que garantiza que las bacterias anaerobias son en vivo durante la investigación experimental de los eventos puede plantear desafíos. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativas, es capaz de invadir una variedad de células no fagocíticas eucariotas. En este artículo se describe cómo con éxito la cultura y evaluar la capacidad de P. gingivalis para invadir las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Se desarrollaron dos protocolos: uno para medir las bacterias que pueden invadir y sobrevivir con éxito dentro del huésped, y el otro para visualizar las bacterias que interactúan con las células huésped. Estas técnicas requieren el uso de un anaeRobic cámara para suministrar P. gingivalis con un ambiente anaeróbico para un crecimiento óptimo. El primer protocolo se basa en el ensayo de protección a los antibióticos, que se utiliza en gran medida para estudiar la invasión de células huésped por bacterias. Sin embargo, el ensayo de protección de antibiótico es limitada; sólo las bacterias intracelulares que son cultivables tras el tratamiento antibiótico y la lisis de la célula huésped se miden. Para evaluar todas las bacterias que interactúan con las células huésped, tanto vivas y muertas, hemos desarrollado un protocolo que utiliza la microscopía de fluorescencia para examinar la interacción huésped-patógeno. Las bacterias se marcaron fluorescentemente con 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína acetoximetilo éster (BCECF-AM) y se utiliza para infectar las células eucariotas bajo condiciones anaeróbicas. Después de la fijación con paraformaldehído y permeabilización con 0,2% Triton X-100, las células huésped se etiquetan con TRITC faloidina y DAPI para etiquetar el citoesqueleto de la célula y el núcleo, respectivamente. Múltiple images tomadas en diferentes puntos focales (Z-pila) se obtienen para la visualización temporal-espacial de las bacterias. Los métodos utilizados en este estudio se pueden aplicar a cualquier anaerobio cultivable y cualquier tipo de célula eucariota.

Protocolos mencionados anteriormente fueron utilizados en el estudio de la interacción huésped-patógeno entre P. gingivalis y las células endoteliales. P. gingivalis W83 y P. gingivalis V3150 que porta una deleción de PG0228 se utilizaron en el estudio. El PG0228 se prevé para codificar una proteína que puede alterar los niveles de ARN y proteínas, lo que puede afectar en última instancia interacción de P. gingivalis con células huésped. Para investigar el efecto ...

Watch this Scientific Journal Video about Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells at JoVE.com

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

porphyromonas-gingivalis-as-model-organism-for-assessing-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

26.2K vistas.  Virginia Commonwealth University. This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type. 

Video: Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Investigación

Bioquímica

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Un modelo de ratón para Patógenos inducida inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Inmunología e Infección

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

Modelo robusto inducido por la ligatura de la periodontitis murina para la evaluación de los neutrófilos orales

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four women experience bacterial vaginosis, in which a low level of lactobacilli is accompanied by an overgrowth of diverse anaerobic bacteria. This condition has been associated with many health complications, including risks to reproductive and sexual health. While there is growing evidence showing the complex nature of microbial interactions in human vaginal health, the individual roles of these different anaerobic bacteria are not fully understood. This is complicated by the lack of adequate models to study anaerobically grown vaginal bacteria. Mouse models allow us to investigate the biology and virulence of these organisms in vivo. Other mouse models of vaginal bacterial inoculation have previously been described. Here, we describe methods for the inoculation of anaerobically grown bacteria and their viable recovery in conventionally raised C57Bl/6 mice. A new, less stressful procedural method for vaginal inoculation and washing is also described. Inoculation and viable recovery of Gardnerella are outlined in detail, and strategies for additional anaerobes such as Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum are discussed.

The protocol presents a mouse model of vaginal colonization with anaerobically cultured human vaginal bacteria. We focus on Gardnerella vaginalis,&#160;while including suggestions for Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum. This protocol can also be used as a guide for vaginal inoculations and viable recovery of other anaerobically grown bacteria.

Modelos de colonización vaginal murina por bacterias cultivadas anaeróbicamente

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

Sistemas de modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones huésped-patógeno in vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

Establecimiento De Cultivos Binarios Estables De Saccharibacterias Simbióticas De La Cavidad Oral

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Biología

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

<meta charset="utf8"></head><body>Medición de la migración y la formación de biopelículas de diversas bacterias

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

Medición de la migración y la formación de biopelículas de diversas bacterias

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Anti-Infective Efficacy in Cystic Fibrosis with Aggregate Biofilm Models

Cystic Fibrosis Aggregate Biofilm Model to Study Infection-relevant Gene Expression

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not reflect the environmental conditions of the hostile lung niche. Current reductionist testing conditions can lead to the progression of compounds along a preclinical pipeline without evidence of their activity under cystic fibrosis lung niche-appropriate conditions. Several approaches used to study traditional antimicrobials may not be suitable for antibiotic alternatives, including anti-virulence therapeutics like anti-quorum sensing agents and siderophore inhibitors. This protocol documents an aggregate biofilm model of Pseudomonas aeruginosa to compare resistance and infection-relevant gene expression in single-species and multi-species cultures (Staphylococcus aureus and Candida albicans), examining colony-forming unit (CFU) reductions and changes in gene expression, using algD as an exemplar. The model was optimized for small, static volumes of bacterial cultures to allow the study of novel compounds in the discovery phase of the drug development pipeline, where compound quantities may be limited. Single-species P. aeruginosa biofilms were formed in Synthetic Cystic Fibrosis Medium 2 (SCFM2) for 24 h before treatment with meropenem at different concentrations (1, 16, and 256 &#181;g/mL) for a further 24 h. Polymicrobial biofilms were established by growing Staphylococcus aureus and Candida albicans together in SCFM2, then inoculating with P. aeruginosa for an additional 24 h and treating with meropenem. The lack of a direct connection between compound efficacy measures in pre-clinical testing and clinical trial results has cast doubt on the applicability of current laboratory screening tools. This model allows us to understand the impact of relevant factors on P. aeruginosa gene expression, including genes contributing to resistance and virulence, thereby bridging this gap.

This study outlines a framework for developing an aggregate polymicrobial biofilm model and optimizing an RNA extraction protocol to assess Pseudomonas aeruginosa gene expression reflective of the cystic fibrosis lung environment. Applications include evaluating antimicrobial effects and studying antibiotic alternatives under conditions relevant to cystic fibrosis.

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not ...

Visualization of Internalized Anaerobic Bacteria within Host Endothelial Cells

Source: Wunsch, C. M. et. al., <a href="https://app.jove.com/v/53408">Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate a procedure to visualize internalized Porphyromonas gingivalis, an anaerobic pathogenic bacterium, within human endothelial cells using confocal microscopy. The bacteria are stained with a fluorescent dye while the host endothelial cell actin cytoskeleton is labeled with a different fluorescent dye. The internalized Porphyromonas gingivalis inside endothelial cells are visualized using confocal microscopy.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Resumen

Explorar más videos

PLAYLIST