One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) para todos los materiales y reactivos antes de su uso (es decir, Pedidos de metanol). Asegurar el uso de todas las prácticas apropiadas de seguridad al manipular disolventes y cromatografía líquida de eluyente alta resolución (HPLC). Asegurar el uso apropiado de los controles de ingeniería de HPLC, balanza analítica y un detector de instrumentación, y asegurar el uso de equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados). Nota: Este protocolo contiene instrucciones sobre cómo utilizar una columna CF en un sistema de HPLC acoplado con un detector UV-Vis. El protocolo ha sido escrito asumiendo que el lector tenga conocimientos básicos y experiencia en cromatografía. 1. Configuración del Instrumento HPLC Nota: En esta sección se puede modificar para adaptarse a las necesidades de los analistas, es decir, la elección de disolventes, detector de longitud de onda y el caudal queson apropiadas para la muestra de interés. <ol><li> Preparar el instrumento de HPLC con agua ultrapura 100% (por ejemplo, agua Milli-Q) para la línea A y metanol al 100% para la línea B como la fase móvil y purgar las bombas según el requisito del fabricante. </li><li> Ajuste el detector de UV-Vis a 254 nm. </li><li> Elija un modo de división de flujo pre-inyección de puesta a punto, o una de doble flujo de la bomba puesta a punto. Para el modo de flujo dividido continúe en el paso 2, para el modo de doble bomba continúe con el paso 3. </li></ol> 2. Configuración del sistema Split-flujo <ol><li> Desconecte la línea de bomba de la válvula del inyector del muestreador automático. </li><li> Coloque una pieza en T a la línea de la bomba. </li><li> Coloque una pieza de 15 cm de tubo de Identificación de 0,13 mm a cada puerto de la pieza en T. </li><li> Conecte un tubo a partir de la pieza en T al inyector de la válvula de muestreador automático. </li><li> Poner la bomba en 1,0 ml min-1. </li><li> Antes de conectar las líneas de bomba a la entrada de la columna de la CF, ajustar la relación de segmentación del flujo de 40%: 6<html> 0% (línea central: línea periférica) de la siguiente manera en el paso 2.7. </li><li> Ajuste de la relación de entrada CF en el sistema de flujo dividido <ol><li> Medir la masa de los dos recipientes de recogida vacíos usando una balanza analítica y la etiqueta de un recipiente de recogida central y otro periférico (una para la línea del muestreador automático para centrar el puerto y otro para la línea de la pieza en T al puerto de periféricos) . </li><li> Para 1,0 min, recoger la fase móvil que sale de la línea que viene del inyector (en el punto que se conectará a la columna) en el recipiente de recogida, cuya masa se midió en 2.7.1. </li><li> Volver a pesar el recipiente de recogida en la escala de análisis y determinar la masa de la fase móvil recogido. </li><li> Repetir los pasos 2.7.2 a 2.7.3 para el eluyente que sale de la línea de la pieza en T que ha de ser conectado al puerto periférico. </li><li> Determinar el porcentaje de flujo (ml min -1) de cada línea de flujo de acuerdo con las siguientes ecuaciones: 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Ajustar la relación de flujo al 40%: 60% (± 2%) (línea de inyector de puerto central: línea de pieza en T de puerto de periféricos). Si la línea desde el inyector al porcentaje de flujo de puerto central está por encima de 40%, aumentar la caída de presión por la disminución del diámetro interno de la tubería, o el aumento de su longitud. Si la línea de inyector al porcentaje de flujo de puerto central está por debajo de 40%, aumentar el diámetro interno de la tubería o disminuir la longitud del tubo. </li><li> Una vez que las relaciones de flujo están sintonizados gire el caudal de la bomba fuera. </li><li> Conecte la línea desde el inyector al puerto central de la entrada de la columna y la línea de la pieza en T al puerto de periféricos de la entrada de la columna. </li><li> La rampa lentamente la velocidad de flujo de 1,0 ml min-1 a 100% la línea B. </li><li> Equilibrar la columna (4,6 mm DI x 100 mm de longitud) al permitir100% de metanol (línea B) de la fase móvil fluya por la columna a 1,0 ml min-1 durante 10 min. Esta vez se escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear. </li><li> Para la puesta a punto de la salida CF vaya al paso 4. &#39;Ajuste de flujo de salida CF&#39;. </li></ol></li></ol> 3. Configuración del sistema de dos bombas <ol><li> Conectar la bomba del sistema HPLC para el inyector y luego conectar la línea desde el inyector al puerto de entrada central de la columna. </li><li> Conectar la bomba adicional directamente al puerto de periféricos de entrada de la columna. Tenga en cuenta que esta segunda bomba-inyector pasa. </li><li> Rampa la velocidad de flujo de la bomba del sistema conectado al puerto central en 0,4 ml min -1 (representante del 40% de la velocidad de flujo total de 1,0 ml min -1) a 100% de metanol (línea B). </li><li> Al mismo tiempo que la Etapa 3.3, rampa la velocidad de flujo de la bomba periférica a 0,6 ml min -1 (representante del 60% de la velocidad de flujo total de1,0 ml min-1) a 100% de metanol (línea B). </li><li> Equilibrar la columna (4,6 mm DI x longitud 100 mm), permitiendo% metanol 100 (línea B) de la fase móvil a fluir a través de la columna a 1,0 ml min-1 durante 10 min. Esta vez se escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear. </li><li> Para la puesta a punto de la salida CF vaya al paso 4. &#39;Ajuste de flujo de salida CF&#39;. </li></ol> 4. Ajuste de CF flujo de salida <ol><li> Conectar el puerto de salida central para el detector de UV-Vis utilizando una pieza 15 cm de tubo de Identificación del 0,13 mm. </li><li> Conectar una pieza 15 cm de tubo de Identificación del 0,13 mm al orificio de salida periférica de la columna de la CF. </li><li> Se pesa la masa de dos recipientes de recogida vacíos en la balanza analítica y etiquetar un recipiente central y otro periférico. </li><li> Durante 1,0 min, recoger la fase móvil que sale del detector (flujo central) UV-Vis en la etiqueta recipiente de recogida central, cuya masa se midió en 4,2. </li><li> Volver a pesar el recipiente de recolección que contiene el eluyente recogido en la escala de análisis y determinar la masa de fase móvil recogido. </li><li> Repetir los pasos 4.4 a 4.5 para el eluyente que sale de la línea desde el puerto de salida periférica. </li><li> Determinar el porcentaje de flujo de cada línea de flujo de acuerdo con las siguientes ecuaciones: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/53471/53471eq2.jpg" /></li><li> Ajustar la relación de flujo a 21%: 79% (± 2%) (flujo de salida central de UV-Vis: flujo de salida periférica de la línea). Si el porcentaje de flujo central de la UV-Vis está por encima de 21%, aumentar la caída de presión al disminuir el diámetro interno de la tubería unida a la salida del detector de UV-Vis, o el aumento de su longitud. Si el porcentaje de flujo central de la UV-Vis está por debajo de 21%, aumentar el diámetro interno del tubo conectado a la salida del detector de UV-Vis, o disminuir la longitud del tubo. Cada vez que la longitud del tubo ha sido cambiado, repeticiónpasos 04.03 a 04.07. Nota: La columna CF en el modo de Identificación &quot;virtual&quot; de 2,1 mm está listo para su análisis. </li></ol>

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	<li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+parallel+segmented+outlet+flow+columns+for+enhanced+mass+spectral+sensitivity+at+high+chromatographic+flow+rates.">The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates.</a> Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology:+Parallel+segmented+outlet+flow.">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr. A. 1232, 47-51 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. 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J. 111, 3-7 (2013).</li><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection.">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li><li>Kocic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+through-put+and+highly+sensitive+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+separations+of+essential+amino+acids+using+active+flow+technology+chromatography+columns.">High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns.</a> J. Chromatogr. 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A. 122, 129-145 (1976).</li><li>Miyabe, K., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+column+radial+heterogeneity+from+an+analysis+of+the+characteristics+of+tailing+peaks+in+linear+chromatography.">Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).</li><li>Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+and+radial+diffusion+coefficients+in+a+liquid+chromatography+column+and+bed+heterogeneity.">Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity.</a> J. Chromatogr. 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This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific.

Este estudio incluyó el análisis entre laboratorios de columnas de cromatografía CF para probar el funcionamiento analítico en términos de eficiencia y sensibilidad. La columna CF se creó con un sistema de bombeo de doble tal como se describe en la sección &quot;3. sistema de bomba dual establecido &#39;para lograr una relación de flujo de 40:60 (centro: periférica) en la entrada de la columna de la FQ. El 40:60 (centro: periférica) relación de flujo se consigue mediante el ajuste del caudal de cada bomba par...

En los últimos años la tecnología de la columna de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ha avanzado mucho; capacidades de pico han aumentado considerablemente en gran parte gracias a la utilización de tamaños de partículas más pequeñas y las partículas de núcleo y corteza más eficientes. Desde separaciones son en general más eficientes, un flujo en efecto ha sido un aumento en la sensibilidad desde picos son ahora más nítida y por lo tanto más alto 1-8. Sin embargo, la heterogeneidad radial cama sigue siendo un factor limitante en el desempeño de todas las columnas, pero esto no es una nueva historia desde cromatógrafos lo saben desde hace muchos años. Camas de columna son heterogéneos tanto en la dirección radial 9-12, y a lo largo de la columna eje 10,12-15. La pared de efecto especial es un importante contribuyente a la pérdida de 7,16-18 rendimiento de separación. Shalliker y Ritchie 7 recientemente revisado los aspectos de la heterogeneidad lecho de la columna y por lo tanto no es preciso referirnosd aquí aún más. Aunque basta con decir, que la variación en la columna de densidad de empaquetamiento de cama y los efectos de pared conducen a una deformación del enchufe soluto, de tal manera que las bandas eluyen a través de la columna en tapones que se asemejan parcialmente lleno de sopa cuencos en lugar de discos sólidos finos planos 7 que están representada generalmente en los textos básicos de enseñanza. Cuando los experimentos se llevaron a cabo de tal manera que la migración de soluto a través de la cama podría ser visualizado los perfiles de enchufe dentro de la columna fueron parcialmente hueco y la sección del tizón de la banda es en gran medida el componente de la pared del tapón de muestra. El resultado final es que se necesitan muchos más placas para separar estos tapones &#39;&#39; parcialmente hueco del que sería necesario si los discos eran sólida y plana 12,14,17. Para superar la banda ampliando problemas asociados a los efectos de la pared y la variación en la densidad de empaquetamiento radial, una nueva forma de tecnología de la columna conocida como tecnología activa de flujo (AFT) fue diseñado 7,19. El propósito de este diseño erapara eliminar los efectos de la pared a través de la separación física de disolvente de elución a lo largo de la zona de la pared, de la de la fase móvil de elución en la región central radial de la columna 19. Hay dos tipos principales de columnas AFT; Segmentado Flow (PSF) y columnas paralelas cortina de flujo (CF) 7 columnas. Dado que este protocolo está dirigido a la utilización y la optimización de las columnas de CF, no se discutirán más columnas de PSF. Cortina de flujo (CF) formatos de columna cortina de flujo (CF) utilizan finales accesorios de AFT, tanto a la entrada y la salida de la columna. AFT finales accesorios consisten en una frita de anular situada dentro de un adaptador de múltiples orificios. La frita se compone de tres partes: una parte central radial porosa que está alineado con el puerto central del final apropiado, una parte exterior porosa que está alineado con el puerto de periféricos (s) del accesorio en el extremo, y un anillo impermeable que separa las dos partes porosas que impiden cualquier cruz-flow entre las regiones central y exteriores radiales de la frita 19. La figura 1 ilustra el diseño de la frita de AFT y la Figura 2 ilustra el formato de columna CF. En este modo de operación (CF) de la muestra se inyecta en el puerto central radial de la conexión de entrada, mientras que la fase móvil adicional se introduce a través del puerto de periféricos de la entrada de &quot;cortina&quot; la migración de los solutos a través de la región central radial de la columna. Por lo tanto la muestra entra en el lecho en la región central radial de la columna con la región exterior de la columna que tiene fase móvil sólo pasa a través de ella. Los estudios han demostrado que una relación volumétrica velocidad de flujo de alrededor de 40:60 (central: puerto de periféricos) para la entrada de herraje final de una columna de 4,6 mm de diámetro interno (ID) es 6,7,16 óptima. La salida AFT de la columna de CF permite el ajuste del flujo central y periférico para su porción relativa y se puede variar para casi cualquier rati deseadoo mediante la gestión de presión. La optimización de una columna de CF puede mejorar significativamente diferentes aspectos funcionales de la tecnología de la columna, como la eficiencia de separación o sensibilidad de detección. De esta manera se establece un &quot;muro-less &#39;,&#39; infinito de diámetro&quot; o la columna &quot;virtual&quot; 6,10,18,20. El propósito de columnas CF es gestionar activamente la migración de la muestra a través de la columna para evitar que la muestra llegue a la zona de la pared. Por lo tanto, la concentración de soluto a la salida al detector se maximiza, el aumento de sensibilidad de alrededor de 2,5 veces mayor que el formato de columna convencional cuando se utiliza radiación ultravioleta (UV) de detección 16, y aún mayor cuando se utiliza la detección de espectro de masas 6. columnas CF son idealmente adecuados para muestras de baja concentración, ya que se aumenta la sensibilidad de detección. Además, son ideales cuando se acopla a fluir detectores limitadas de tasa, como el espectrómetro de masas (MS) 6. Un Acolumna de FT en un formato de ID 4,6 mm, por ejemplo se puede ajustar para entregar el mismo volumen de disolvente a un detector como una columna estándar de 2,1 mm formato ID cuando funcionan a las mismas velocidades lineales, mediante el ajuste de la salida de flujo central a 21%. Asimismo, la columna AFT también podría ser sintonizado para ofrecer la misma carga de volumen a un detector como una columna de ID 3,0 mm, mediante el ajuste de la salida de flujo central a 43%. De hecho, cualquier formato de columna &quot;virtual&quot; podría ser producido para adaptarse al requisito de análisis 6,18,22. El uso de estos finales accesorios diseñados especialmente en la entrada y la salida se asegura de que se establece una columna verdadera pared menos. Hay dos maneras de configurar el sistema de suministro de disolvente a los puertos centrales y periféricas de la entrada:. Sistema de flujo dividido 6 y dos 6,7 sistema de bombeo La figura 3 ilustra cada uno de estos sistemas CF montajes. Sistema de flujo dividido yona sistema de flujo dividido (Figura 3A) el caudal de la bomba que conduce al inyector es pre-inyector de división utilizando un muerto cero volumen pieza en T, donde una corriente de flujo de la fase móvil está conectado al inyector, que está conectado a continuación, a la puerto central de la entrada de herraje final de la columna. La segunda corriente de flujo de la fase móvil por-pasa el inyector y está conectada al puerto de periféricos en la entrada de la columna. Durante la división del flujo, el porcentaje corriente de flujo se ajusta a 40:60 (centro: periférica) antes de que las líneas están conectadas a la columna, es decir, desde el inyector hasta el centro y la bomba para periférica. Sistema de dos bombas La columna CF requiere dos corrientes de flujo en la entrada de herraje final de la columna. Dependiendo del tipo de inyector automático / inyector del instrumento de HPLC, una fracción de flujo establecido puede no ser posible, y así CF puede ser logrado a través de 2 bombas (Figura 3B 21). Cada bomba se asigna y se conecta a ya sea el puerto central o periférico y el caudal se ajusta para representar 40% del flujo para el puerto central y 60% para el puerto periférico. Por ejemplo, si la velocidad de flujo total es de 1,0 ml min -1, la tasa de flujo de la bomba central se establece en 0,4 ml min -1 y la bomba periférica se establece en 0,6 ml min -1. La elección de qué modo de funcionamiento depende en gran medida de la instrumentación de HPLC y el modo cromatográfico de operación. Por ejemplo, en algunos inyectores automáticos un cambio de presión entre la posición de carga de muestra y la muestra se inyecta posición se puede producir la interrupción de la relación de flujo dividido y por lo tanto en este caso una bomba dual establecido sería recomendable para un rendimiento óptimo CF. Independientemente del sistema de suministro de disolvente configurar elegido para la entrada de la columna de la CF, la optimización de salida CF sigue siendo el mismo. El puerto central de salida de la columna de la CF está unido al detector ultravioleta-visible (UV-Vis) con el smalno sea posible el volumen de la tubería para minimizar los efectos de post-columna volumen muerto. Dado que, columnas CF emulan columnas de pequeño diámetro, volumen muerto entre la salida de la columna y el detector es perjudicial para el rendimiento de separación de la columna de la FQ. Es crítico para asegurar la cantidad más pequeña de volumen de tubo entre el puerto central y el detector de UV-Vis a minimizar los efectos de volumen muerto tales como ensanchamiento de las bandas, la pérdida en la eficiencia y sensibilidad. Por lo tanto, se recomienda el uso de tubos de diámetro estrecho (0,1 mm de diámetro) para permitir fácilmente los ajustes de presión sin añadir volumen muerto apropiado. Tubing también está unido al puerto de periféricos y dirigido a los residuos. A la salida de la columna de la CF, la relación de segmentación se puede ajustar a cualquier relación que se adapte a la finalidad de la analista. Cuando se utiliza un 4,6 mm ID CF, por ejemplo, a menudo es conveniente para ajustar la relación, ya sea como 43:57 o 21:79 (en el centro: periférica) para emular una columna id &#39;virtual&#39; 3,0 mm o una columna ID 2,1 mm,respetuosamente. De esta forma el rendimiento de la separación es fácilmente banco marcados. La relación de segmentación se mide pesando la cantidad de caudal de salida del detector que está conectado al puerto central y flujo que sale del puerto de periféricos durante un período de tiempo. El flujo a través de cada puerto porcentaje se puede determinar entonces y las relaciones se puede ajustar mediante la alteración de la longitud del tubo conectado o el uso de tubos que tiene un diámetro interno diferente (id). Este protocolo de vídeo se describen los procedimientos de operación y optimización de una columna de cromatografía CF para un rendimiento mejorado.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump</td><td></td><td></td><td>Required if 2 pump CF system set up is to be used.</td></tr><tr><td>Curtain Flow HPLC column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Not Defined</td><td>Soon to be commercialized</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Any brand</td><td></td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Any brand</td><td></td><td>Various lengths and i.d.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stop watch</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluent collection vessels</td><td>Any brand</td><td></td><td>1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels</td></tr><tr><td>T-piece</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

curtain flow column: optimization of efficiency and sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

AFT columnas fueron desarrolladas utilizando un diseño especializado frita (Figura 1) en la columna multipuerto finales accesorios para superar la cama heterogeneidad columna y mejorar el rendimiento de separación. Un estudio entre laboratorios en el rendimiento de separación de columnas de cromatografía CF (Figura 2) se llevó a cabo con un sistema de doble bomba de configurar (Figura 3B) como se describe en la sección 3 de este pr...

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Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Cortina Columna de flujo: optimización de la eficiencia y sensibilidad

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

6.5K vistas.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance. 

Video: Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Investigación

Bioingeniería

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Puesta a punto del paralelo Columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Química

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

A Modular Microfluidic Technology for Systematic Studies of Colloidal Semiconductor Nanocrystals

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light emitting diodes (LEDs) and photovoltaics (PVs). Among this material group, inorganic/organic perovskites have demonstrated significant improvement and potential towards high-efficiency, low-cost PV fabrication due to their high charge carrier mobilities and lifetimes. Despite the opportunities for perovskite QDs in large-scale PV and LED applications, the lack of fundamental and comprehensive understanding of their growth pathways has inhibited their adaptation within continuous nanomanufacturing strategies. Traditional flask-based screening approaches are generally expensive, labor-intensive, and imprecise for effectively characterizing the broad parameter space and synthesis variety relevant to colloidal QD reactions. In this work, a fully autonomous microfluidic platform is developed to systematically study the large parameter space associated with the colloidal synthesis of nanocrystals in a continuous flow format. Through the application of a novel translating three-port flow cell and modular reactor extension units, the system may rapidly collect fluorescence and absorption spectra across reactor lengths ranging 3 - 196 cm. The adjustable reactor length not only decouples the residence time from the velocity-dependent mass transfer, it also substantially improves the sampling rates and chemical consumption due to the characterization of 40 unique spectra within a single equilibrated system. Sample rates may reach up to 30,000 unique spectra per day, and the conditions cover 4 orders of magnitude in residence times ranging 100 ms - 17 min. Further applications of this system would substantially improve the rate and precision of the material discovery and screening in future studies. Detailed within this report are the system materials and assembly protocols with a general description of the automated sampling software and offline data processing.

Detailed herein are the operation and assembly protocols of a modular microfluidic screening platform for the systematic characterization of colloidal semiconductor nanocrystal syntheses. Through fully adjustable system arrangements, highly efficient spectra collection may be carried out across 4 orders of magnitude reaction time scales within a mass transfer-controlled sampling space.

Una tecnología de microfluidos Modular para estudios sistemáticos de nanocristales de Semiconductor coloidal

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light ...

Ingeniería

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

Fabricación interna sencilla de columnas capilares de ultra alto rendimiento con el enfoque FlashPack

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

Bioquímica

Design and Optimization Strategies of a High-Performance Vented Box

This study aims to solve the problems of air flow chaos and poor performance in a vented box caused by the heterogeneous distribution of airflow through the design of the internal structure of the vented box with constant energy consumption. The final goal is to evenly distribute the airflow inside the vented box. Sensitivity analysis was performed for three structural parameters: the number of pipes, the number of holes in the middle pipe, and the number of each increment from the inside to the outside pipe. A total of 16 random array sets of three structural parameters with four levels were determined using the orthogonal experimental design. Commercial software was used for the construction of a 3D model for the selected experimental points, and this data was used to obtain the airflow velocities, which were then used to obtain the standard deviation of each experimental point. According to the range analysis, the combination of the three structural parameters was optimized. In other words, an efficient and economical optimization method considering the performance of the vented box was established, and it could be widely used to extend the storage time of fresh food.

Here, we present the range analysis method to optimize the sample points generated by an orthogonal experimental design to ensure that fresh food can be stored in a vented box for a long time by regulating the airflow pattern.

Diseño y estrategias de optimización de una caja ventilada de alto rendimiento

This study aims to solve the problems of air flow chaos and poor performance in a vented box caused by the heterogeneous distribution of airflow through ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

La interacción hidrofóbica automatizada cromatografía en columna de selección para uso en la purificación de proteínas

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Biología

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are essential for predicting responses to climate change. This work describes two high-throughput protocols for measuring insect thermal limits: one for assessing critical thermal minima (CTmin), and the other for assessing heat knock down time (KDT) in response to a static heat stressor. In the CTmin assay, individuals are placed in an acrylic-jacketed column, subjected to a decreasing temperature ramp, and counted as they fall from their perches using an infrared sensor. In the heat KDT assay, individuals are contained in a 96 well plate, placed in an incubator set to a stressful, hot temperature, and video recorded to determine the time at which they can no longer remain upright and move. These protocols offer advantages over commonly used techniques. Both assays are low cost and can be completed relatively quickly (~2 h). The CTmin assay reduces experimenter error and can measure a large number of individuals at once. The heat KDT protocol generates a video record of each assay and thus removes experimenter bias and the need to continuously monitor individuals in real time.

Thermal limits can predict the environments organisms tolerate, which is valuable information in the face of rapid climate change. Described here are high-throughput protocols to assess critical thermal minima and heat knockdown time in insects. Both protocols maximize the throughput and minimize the cost of the assays.

Ensayos de alto rendimiento de límites térmicos críticos en insectos

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

Cross Cylindrical Flow: Measuring Pressure Distribution and Estimating Drag Coefficients

Source: David Guo, College of Engineering, Technology, and Aeronautics (CETA), Southern New Hampshire University (SNHU), Manchester, New Hampshire
The pressure distributions and drag estimations for cross cylindrical flow have been investigated for centuries. By ideal inviscid potential flow theory, the pressure distribution around a cylinder is vertically symmetric. The pressure distribution upstream and downstream of the cylinder is also symmetric, which results in a zero-net drag force. However, experimental results yield very different flow patterns, pressure distributions and drag coefficients. This is because the ideal inviscid potential theory assumes irrotational flow, meaning viscosity is not considered or taken into account when determining the flow pattern. This differs significantly from reality.
In this demonstration, a wind tunnel is utilized to generate a specified airspeed, and a cylinder with 24 ports of pressure is used to collect pressure distribution data. This demonstration illustrates how the pressure of a real fluid flowing around a circular cylinder differs from predicted results based on the potential flow of an idealized fluid. The drag coefficient will also be estimated and compared to the predicted value.

Cross Cylindrical Flow: Pressure Distribution &amp; Drag Coefficients

Flujo cilíndrico transversal: medición de la distribución de la presión y estimación de los coeficientes de arrastre

Source: David Guo, College of Engineering, Technology, and Aeronautics (CETA), Southern New Hampshire University (SNHU), Manchester, New Hampshire
The ...

Educación

JoVE Science Education

Ingeniería aeronáutica

Efficiency of Liquid-liquid Extraction

Source: <a href="https://www.jove.com/author/Kerry+M._Dooley">Kerry M. Dooley</a> and Michael G. Benton, Department of Chemical Engineering, Louisiana State University, Baton Rouge, LA
Liquid-liquid extraction (LLE) is a separation technique used instead of distillation when either: (a) the relative volatilities of the compounds to be separated are very similar; (b) one or more of the mixture components are temperature sensitive even near ambient conditions; (c) the distillation would require a very low pressure or a very high distillate/feed ratio.1The driving force for mass transfer is the difference in solubility of one material (the solute) in two other immiscible or partially miscible streams (the feed and the solvent). The feed and solvent streams are mixed and then separated, allowing the solute to transfer from the feed to the solvent. Normally, this process is repeated in successive stages using counter-current flow. The solute-rich solvent is called the extract as it leaves, and the solute-depleted feed is the raffinate. When there is a reasonable density difference between the feed and solvent streams, extraction can be accomplished using a vertical column, although in other cases a series of mixing and settling tanks may be used.
In this experiment, the operational goal is to extract isopropanol (IPA, ~10 - 15 wt. %, the solute) from a mixture of C8-to-C10 hydrocarbons using pure water as solvent. A York-Scheibel type (vertical mixers and coalescers, one each per physical stage) extraction column is available. Like most extractors, the overall efficiency (number theoretical stages/physical stages) of this column is quite low, especially in comparison to many distillation columns. The low efficiencies arise from both slow mass transfer (two liquid resistances instead of one as in distillation) and often also from maldistribution of the phases. The effect of agitator speed on both the solute recovery in the extract and the overall column efficiency will be evaluated.

Liquid-liquid Extraction and York-Scheibel Column Operation

Eficiencia de la extracción líquido-líquido

Source: Kerry M. Dooley and Michael G. Benton, Department of Chemical Engineering, Louisiana State University, Baton Rouge, LA
Liquid-liquid extraction ...