We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine L&#233;vesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Qu&#233;bec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Facult&#233; de m&#233;decine of Universit&#233; Laval.

Nota: Todos los experimentos fueron aprobados y realizados bajo las directrices del comité de ética animal institucional, de conformidad con el Consejo Canadiense sobre el manejo de estos animales como administrado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Laval. Se utilizaron ratones macho APP-PS1 entre 4 y 21 meses de edad. Estos animales se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a 22 - 25 ° C, con acceso libre a comida y agua. 1. Metoxi-X04 Preparación de la solución <ol><li> Preparar una solución de 5 mg / ml de metoxi-X04 9 disolviendo metoxi-X04 en una solución que contiene 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO), 45% de propilenglicol, y 45% de solución salina tamponada con fosfato de sodio (0,9% de NaCl en tampón de fosfato 100 mM , pH 7,4). <ol><li> El uso de una microbalanza, pesar 5 mg del compuesto metoxi-X04. Bajo una campana extractora, disolver el metoxi-X04 en DMSO y se agita hasta que se obtiene una solución de color verdoso claro. Sucesivamente añadir propilenglicol y phosphate tampón de solución salina mientras se agitaba con cada adición. </li><li> Se agita la solución a 4 ° C en un rotador O / N. Obtener una emulsión de color verde amarillento. La solución se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de dos meses sin degradación. </li></ol></li></ol> 2. metoxi-X04 Injection Solution <ol><li> 24 horas antes de la perfusión, pesan los ratones y dar a cada ratón una inyección intraperitoneal de metoxi-X04 a una dosis de 10 mg / kg de peso corporal utilizando una aguja de 27 G ½. </li></ol> 3. transcardial perfusión de los ratones inyectados <ol><li> En el día antes de la perfusión, se preparan volúmenes adecuados de las soluciones de 4% de paraformaldehído (PFA) 13 solución salina tamponada con fosfato (PBS), 3,5% de acroleína, y y almacenar a 4 ° CO / N. Nota: Estas soluciones se utilizan tanto para la perfusión y la inmunohistoquímica pre-incrustación. Tenga especial cuidado cuando se trabaja con acroleína, ya que es corrosivo y tóxico tanto paralos investigadores y el medio ambiente. Además, dado que la acroleína es corrosivo para el plástico, siempre el uso de vidrio adecuado para preparar soluciones de acroleína. </li><li> En el día de la perfusión, se filtra la PFA y acroleína mediante el uso de papel de filtro grueso de retención de partículas de 25 micras. </li><li> Durante la perfusión, utilizar una bomba peristáltica para entregar 15 ml de PBS, 75 ml de acroleína y 150 ml de PFA sucesivamente en la circulación de ratón, a un caudal de 25 ml / min. Con precaución. Realizar la perfusión estrictamente dentro de una campana de humos para evitar los humos nocivos de la PFA y acroleína. <ol><li> Para configurar la bomba, inserte un extremo en la solución de PBS, llenar el tubo (que sostiene aproximadamente 15 ml) con PBS, y fijar una aguja de extracción de sangre con alas 25 G al otro extremo. En todo momento, asegúrese de que el tubo esté libre de las burbujas de aire atrapadas. </li><li> Se coloca el tubo directamente en la botella acroleína después de fijar la bomba de perfusión con el tubo lleno de PBS. </li></ol></li><li> Unaesthetize un ratón a la vez con un 90 mg / kg de peso corporal dosis de pentobarbital de sodio inyectados por vía intraperitoneal usando un ½ aguja 27 G. Evaluar las respuestas a pellizcos de la cola / del dedo del pie. Proceder sólo si el ratón no responde a tales estímulos aversivos, dolorosas. </li><li> Asegure el ratón en la posición supina (acostado sobre la espalda con la cara hacia arriba) con cinta adhesiva las patas delanteras y las patas traseras a la superficie de trabajo y exponer cuidadosamente el corazón sin causar daño a otros órganos. Asegúrese de trabajar rápidamente después de la perforación de la membrana. <ol><li> Realizar una incisión a través de la piel con unas tijeras quirúrgicas a lo largo de la línea media dorsal comenzando caudal a la caja torácica y proceder rostral a la clavícula. </li><li> Hacer dos incisiones laterales adicionales a lo largo de la base de la caja torácica ventral. Mueva suavemente y el pin de los dos colgajos de piel, asegurándose para exponer toda la cavidad torácica. </li><li> Mantenga el proceso xifoides con unas pinzas romas para exponer la cavidad torácica y estabilizar la punta de tijeras. Corte a través de la membrana y la caja torácica, teniendo cuidado de no perforar los pulmones, y continuar con la rostral incisión para las clavículas. Asegúrese de trabajar rápidamente después de la perforación de la membrana. </li></ol></li><li> romper suavemente el saco pericárdico con unas pinzas romas. Mantenga la constante del corazón con unas pinzas romas, cortar la aurícula derecha, y comenzar la infusión de PBS. Inmediatamente inserte la aguja de recogida de sangre en el ventrículo izquierdo. </li><li> Perfundir el ratón con PBS (en el tubo) seguido de la acroleína para 3 min (correspondiente a 75 ml) y luego cambiar a PFA para 6 min (correspondiente a 150 ml). Asegúrese de hacer una pausa en el flujo de la bomba antes de solución de conmutación para evitar que las burbujas entren en el tubo. </li><li> Decapitar al ratón y extraer el cerebro fijo y colocarlo directamente en un vial de vidrio que contiene PFA al 4% durante al menos 2 horas a 4 ° C. <ol><li> Para extraer el cerebro, utilizar tijeras y pinzas para cortar a través de la piel para exponer el cráneo. romper cuidadosamente el cráneo opes entre los ojos, y el chip de pequeñas piezas de la misma para exponer el cerebro subyacente. </li><li> Retirar con cuidado el cerebro y post solución expuesta con PFA al 4% durante 2 horas más antes de proceder a vibratome seccionamiento. </li></ol></li></ol> 4. El uso de un cerebro seccionamiento Vibratome <ol><li> Se lava el cerebro fija 3 veces con PBS enfriado. Utilizando una hoja de afeitar afilada, retire el bulbo olfatorio (a menos que esta región se encuentra bajo investigación) y cortar el cerebro transversalmente en 2 - 3 piezas de aproximadamente la misma altura, todo lo cual puede ser seccionada de manera simultánea con el fin de acelerar el procedimiento. </li><li> Pegar las piezas de tejido cerebral verticalmente sobre la placa de muestra asegurado en la bandeja. Asegúrese de que la superficie de corte lisa se adhiere firmemente a la placa de muestra y no se desprendió durante el procedimiento de corte. Agregar suficiente solución de PBS en la bandeja hasta que toda la superficie del cerebro está completamente sumergido. Es importante mantener THpiezas cerebrales e y secciones posteriores sumergen totalmente en PBS a lo largo de este paso. </li><li> Colocar la bandeja en el vibratome, ajustar la velocidad de corte de 0,5 mm / seg, la frecuencia de corte de 90 Hz, y el grosor de alimentación de 50 micras a fin de producir 50 micras de grosor. A continuación, traslado de las secciones en viales de vidrio de 20 ml que contienen solución de crioprotector (40% PBS, 30% de glicol de etileno, y 30% de glicerol) con un pincel fino. Almacenar los viales a -20 ° C hasta su uso posterior. Alternativamente, mantener las secciones en PBS para la detección inmediata como se describe en los siguientes pasos. </li></ol> 5. La sección de detección de la presencia de placas teñidas-metoxi-X04 <ol><li> Con la ayuda de un cerebro de ratón estereotáxico atlas 14, secciones seleccione cerebrales contienen la región de interés, por ejemplo, el hipocampo CA1 como se usa en el presente ejemplo. Colocar cada sección en un pozo dentro de una placa de cultivo de 24 pocillos que contiene suficiente solución crioprotectoraa fin de evitar que las secciones se sequen. </li><li> Examinar cada sección sucesivamente, para evitar la desecación de las secciones, usando el siguiente procedimiento: <ol><li> Añadir una gota de PBS a un portaobjetos de microscopio con una pipeta desechable, y coloque la sección sobre la gota. </li><li> Examine la sección bajo un microscopio de fluorescencia para identificar las regiones que contienen placas de Aß metoxi-X04 etiquetados. Nota: metoxi-X04 puede ser visualizado fácilmente usando un filtro de fluorescencia ultravioleta (UV) (excitación 340 a 380 nm). </li></ol></li><li> Capturar imágenes de las regiones de interés (ROI) en el campo brillante, así como en el modo de fluorescencia sin mover la platina del microscopio, ya que cada imagen debe mostrar la misma región en ambos campos con el fin de correlacionar la presencia de las placas directamente a la región estructural de la sección de tejido. </li><li> Guardar y nombrar las imágenes tomadas en función del número de animales. Asimismo, registre el número pocillo de la placa y el campo de las imágenes taconocido. Por ejemplo, Ex: 9978A1B; Número de animales: 9978; número así: A1; Campo: brillante. Coloque la parte trasera en su designado bien una vez que se complete la formación de imágenes. Nota: Al final, para cada sección examinada, se obtienen dos imágenes, una en campo claro y otro en el campo de los rayos UV. </li><li> Abra las dos imágenes de la misma ROI (uno en campo claro y el otro en el campo UV) en la imagen J, y usando el plugin MosaicJ, alinear los bordes de las dos imágenes y guardar la imagen alineada y combinado de acuerdo con el número de bien vino de. </li><li> Guardar la imagen en una carpeta separada con el número del animal en particular. Se combinan las imágenes para identificar y localizar las placas en la sección de tejido, y tener una visión completa de toda la sección en los dos campos diferentes (brillante y UV). </li><li> Una vez completado el proceso de selección, almacenar las secciones examinadas a -20 ° C en una placa de cultivo de 24 pocillos que contenía crioprotector hasta inmunotinción o de su procesamiento es carried a cabo. </li></ol> 6. Pre-incrustación de inmunotinción para Iba1 Nota: Realizar la inmunotinción para Iba1 en secciones de libre flotación seleccionados mediante la colocación de la placa en un agitador se mueve lentamente a temperatura ambiente. <ol><li> Es necesario lavar las secciones 3 veces con aproximadamente 1 ml de PBS, cada lavado una duración de 10 min. </li><li> Quench peroxidasas endógenas con peróxido de hidrógeno 0,3% en solución de PBS durante 10 min. Este paso evita la actividad de peroxidasa no específica, que es importante para evitar la tinción de fondo. </li><li> Lavar el tejido en PBS 3 veces durante 10 min cada uno. </li><li> Incubar las secciones de borohidruro de sodio 0,1% en solución de PBS durante 30 min. Este paso es importante para reducir cualquier aldehídos restantes de la etapa de fijación, y es especialmente importante si la acroleína se utiliza en la fijación del tejido. </li><li> Lavar el tejido en PBS 3 veces durante 10 minutos cada vez y asegúrese de eliminar todas las burbujas. </li><li> Bloquear las secciones durante 1 hora.Diferentes anticuerpos pueden requerir diferentes tiempos y las soluciones de bloqueo. Para Iba1, preparar tampón que contiene 10% de suero fetal bovino, 3% de albúmina de suero bovino, y 0,01% de Triton X-100 en solución salina tamponada con 50 mM de Tris de bloqueo (TBS; pH 7,4). Nota: La etapa de bloqueo es evitar la unión no específica del anticuerpo primario. La baja concentración de Triton X-100 permite ligera permeabilización de membranas para eliminar mejor las manchas, y es lo suficientemente baja para preservar la mayoría de las características ultraestructurales de tejido bajo EM. </li><li> Retire el tampón de bloqueo a partir del tejido, e incubar en solución de anticuerpo primario (anti-conejo Iba1, diluido [1: 1000] en tampón de bloqueo) a 4 ° CO / N. </li><li> Lavar en TBS 3 veces durante 10 min cada vez. </li><li> Incubar en anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo conjugado con biotina) [1: 200] en 0,05 M TBS durante 90 min. </li><li> Lavar en TBS 5 veces durante 5 minutos cada vez. </li><li> Incubar en solución de complejo de avidina-biotina (avidina [1: 100], biotina [1: 100]) en TBSsolución durante 1 hr. </li><li> Lavar en TBS 5 veces durante 5 minutos cada vez. </li><li> Revelar la tinción Iba1 con 0,05% de diaminobencidina (DAB) y peróxido de hidrógeno 0,015% en TBS durante 8 min. Nota: El tiempo de desarrollo de DAB puede variar de un protocolo a otro y debe ser determinada mediante el examen de forma rápida las secciones teñidas con un microscopio óptico. Nota: Para Iba1, uno debe ser capaz de visualizar con claridad los cuerpos celulares y los procesos de la microglia Iba1-manchada en 20X (véase la Figura 2, por ejemplo representativo). Sea cauteloso utilizando DAB, ya que es un carcinógeno conocido. </li><li> Evitar el exceso de desarrollo, controlando cuidadosamente las secciones (como se describe arriba) durante este paso. Detener la reacción por lavado de las secciones en PB refrigerada 5 veces durante 5 min cada vez. </li></ol> 7. Proceso de Microscopía Electrónica <ol><li> Preparar la solución de tetróxido de osmio 1% en PBS en un vial de vidrio. El tetróxido de osmio es fotosensible; cubrir la glass vial con papel de aluminio para proteger la solución de la luz. Tenga cuidado usando tetróxido de osmio, ya que es un producto químico muy peligroso. Realice este y los siguientes pasos dentro de una campana de humos. </li><li> Retire la PBS de las secciones y repartirlos plana utilizando un pincel fino. Realice este paso un pozo a la vez de mantener las secciones se sequen. Asegúrese de aplanar las secciones inmediatamente antes de la adición de tetróxido de osmio, como pliegues en las secciones conviertan en permanentes y tratar de aplanar el tejido posterior fijación de osmio sólo romper las secciones. </li><li> Sumergir las secciones en tetróxido de osmio durante 30 min a RT, la adición de una gota de tetróxido de osmio a la vez con una pipeta de transferencia, para evitar que las secciones de plegado. Cubrir el pozo con papel de aluminio para proteger las secciones de la luz. Nota: Este paso corrige los lípidos dentro de las secciones. El tejido aparecerá muy oscuro después de osmio posterior a la fijación. </li><li> Mientras que las secciones están en tetro osmioXide, preparar resina de plástico en un vaso de precipitados desechable mediante la mezcla de 20 g del componente A, 20 g del componente B, 0,6 g del componente C, y 0,4 g componente D. Combine los componentes juntos en el orden anterior y se mezclan bien con un 10 ml pipeta serológica hasta que se obtiene un color uniforme. </li><li> Transferir la mezcla preparada a los platos de aluminio que pesa. Ellos recibirán las secciones de tejido una vez que han sido deshidratados. </li><li> Deshidratar las secciones en concentraciones crecientes de etanol durante 2 min en el siguiente orden: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%. </li><li> Para eliminar el etanol residual, sumergir las secciones en óxido de propileno 3 veces durante 2 min cada vez. Retire los deshidratados secciones de la placa de cultivo de 24 pocillos en 20 ml viales de vidrio. Siempre use viales de vidrio cuando se trabaja con óxido de propileno, ya que se disuelve de plástico, y mantener precaución, ya que es peligroso. </li><li> Utilice una punta de pipeta de vidrio doblado o un pincel fino para transferir las secciones de soluti óxido de propilenoen en la resina y dejar O / N para la infiltración a TA. Tenga cuidado de no diluir la resina con óxido de propileno. </li><li> Incrustar la sección con la resina en poli-cloro-tri-fluoro-etileno filmsheets (PCTFE): <ol><li> Colocar las cápsulas de aluminio con un peso que contienen las muestras en un 50 - 60 ° C horno durante 10 - 15 min antes de la incorporación de las secciones sobre filmsheets PCTFE. </li><li> Cuando la incorporación de secciones, trabajar con una lata de aluminio con un peso plato a la vez. El uso de un pincel fino, pintar una fina capa de resina sobre una lámina de película de PCTFE. </li><li> Mover una sección de tejido a la vez desde el pesaje de aluminio plato a la hoja de película de PCTFE. Eliminar el exceso de resina de todo el tejido, teniendo cuidado de no perturbarlo. </li><li> Después de mover todas las secciones de un peso de plato a la hoja de película de PCTFE, colocar una segunda lámina de PCTFE más de la primera, creando un sándwich de tejido y resina en entre 2 hojas. </li></ol></li><li> Polimerizar la resina en una incubadora durante 3 días a 55 - 60 ° C. </li><li> El material ya está listo para la sección ultrafina y el examen ultraestructural, técnicas especializadas que a menudo son realizadas por las instalaciones centrales de EM. Almacenar las muestras entre hojas de película de PCTFE con seguridad a temperatura ambiente sin degradación ultraestructural. Nota: Los pasos posteriores para seccionar ultrafina y transmisión examen de microscopía electrónica se explican en un protocolo separado 13. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo explica un enfoque correlativa para dirigir centros densos placas Aß con EM. Metoxi-X04 en vivo por inyección permite una rápida selección de las secciones del cerebro que contienen placas de Aß en determinadas regiones y capas de interés, por ejemplo, el hipocampo CA1, radiatum estrato, y lacunosum-moleculare. En el presente ejemplo, metoxi-X04 selección previa se combinó con pre-incrustación de la inmunotinción para Iba1 para estudiar cómo los diferentes fenotipos microgliales intera...

Amiloide la formación de placas de Aß es la principal característica distintiva neuropatológico de la enfermedad de Alzheimer (AD). Sin embargo el aumento de la evidencia sugiere importantes funciones del sistema inmune en 1,2 progresión de la enfermedad. En particular, los nuevos datos de los estudios preclínicos y clínicos establecidos disfunción inmune como principal impulsor y colaborador de patología de la EA. Con estos resultados, las células inmunes central y periférico han surgido como dianas terapéuticas prometedoras para AD 3. El siguiente protocolo combina la luz y microscopía electrónica (EM) para generar nuevos conocimientos sobre la relación entre la deposición de Aß placa y alteraciones fenotípicas microgliales en AD. Este protocolo permite el etiquetado de las placas de Aß en modelos de ratón de AD usando en la inyección in vivo del tinte fluorescente metoxi-X04. Metoxi-X04 es un derivado de rojo Congo que cruzan fácilmente la barrera sangre-cerebro para entrar en el parénquima cerebral y se unen hojas de β-plisadas con alta unaffinity. Puesto que el colorante es fluorescente, que puede ser utilizado para la detección in vivo de Aß deposición de la placa con microscopía de dos fotones 4. Una vez unido a Aß, metoxi-X04 no se disocia o redistribuir de distancia de las placas, y que conserva su fluorescencia con el tiempo. Se administra generalmente periféricamente para permitir la formación de imágenes no invasiva de la dinámica del cerebro 5. La fluorescencia también permanece después de la fijación de aldehído, lo que permite el análisis correlativo post-mortem, incluyendo la investigación de la muerte neuronal en la proximidad de las placas de Aß 6. Este protocolo se aprovecha de las propiedades de metoxi-X04 para seleccionar secciones de cerebro de ratones APP SWE / PS1A 246E (APP-PS1; co-expresar una doble mutación en APP gen Lys670Asn / Met671Leu, y la variante de la presenilina PS1-A264E humano) 7 que exhiben Aß placas en regiones específicas de interés (CA1 del hipocampo, radiatum estrato, y lacunosum-moleculare) Antes de comprobar la validez de la incorporación de la inmunotinción contra el marcador microglial ionizado molécula adaptadora de unión de calcio-1 (Iba1) para visualizar los órganos y procesos con EM de células microgliales. Los ratones se les da una inyección intraperitoneal de solución de metoxi-X04, 24 hr antes de la fijación cerebro a través de la perfusión transcardial. secciones de cerebro coronales se obtienen usando un vibratome. Secciones que contienen el CA1 del hipocampo son examinados bajo un microscopio de fluorescencia para la presencia de placas de Aß en radiatum estratos y lacunosum-moleculare. La inmunotinción para Iba1, tetróxido de osmio posterior a la fijación, y la incrustación de resina plástica entonces se realizaron en las secciones del cerebro seleccionados. Al final de este protocolo, las secciones se pueden archivar sin más degradación ultraestructural, listo para la sección ultrafina y el examen ultraestructural. Es importante destacar que las placas están siendo fluorescente después de inmunotinción con anticuerpos diferentes, por ejemplo Iba1 como en el presente protocolo. Ellos se vuelven más oscuras tHan su neurópila circundantes después de tetróxido de osmio posterior a la fijación, de forma independiente de la tinción metoxi-X04, que permite identificar con precisión las regiones de interés, en general, a unos pocos milímetros cuadrados, que se examina con el microscopio electrónico de transmisión. Este enfoque correlativo ofrece una forma eficaz de identificar las secciones específicas del cerebro a examinar en el nivel ultraestructural. Esto es particularmente útil en el estudio de la patología de Alzheimer precoz, dentro de las regiones o capas específicas del cerebro que sólo puede contener unas pocas placas de Aß, presentes en sólo una pequeña fracción de las secciones de tejido. Durante estos tiempos especialmente, sería ineficiente de usar la inmunotinción de Aß (y doble etiquetado para otros marcadores celulares como Iba1) en varias secciones del cerebro simplemente para dar una pequeña fracción que contiene placas de Aß en el lugar correcto. Además, la inyección de ratones vivos con metoxi-X04 antes del sacrificio y procesamiento de tejidos no hace compromise la conservación ultraestructural. Los métodos alternativos tales como la tinción post mortem con Rojo Congo, tioflavina S, tioflavina T o metoxi-X04 en secciones de tejido fijadas requieren la diferenciación tinción en etanol, 8-11 que causa el estrés osmótico y se altera la ultraestructura. Rojo Congo es también un conocido carcinógeno humano 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1006">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Methoxy-X04</td>
			<td style="width:197px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">4920</td>
			<td style="width:167px;">10 mg substrate per tablet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W294004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP153500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrolein&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110221</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Granular</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-790-14F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peristaltic Pump with Tubing</td>
			<td>ColeParmer</td>
			<td>cp.78023-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Winged blood Collection Set Needles 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extrafine Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11152-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hartman Hemostats</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14004-16</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>ROBOZ surgical store</td>
			<td>5818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>74515-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>14047235612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome blades</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>71990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide, 30%</td>
			<td>J.T.BAKER</td>
			<td>cat: 2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C001H24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti IBA1, Rabbit&#160;</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111066046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905-50TAB</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osmium tetroxide, 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44611</td>
			<td>Resin Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44612</td>
			<td>Hardener Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44613</td>
			<td>Plasticizer Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44614</td>
			<td>Accelerator Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>LesAlcoolsdeComerce</td>
			<td>151-01-15N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110205</td>
			<td>Caution: corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70048-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACLAR&#174;&#8211;Fluoropolymer Films</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven/Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light and electron microscopy to study microglial interactions with &#946;-amyloid plaques

Se proporciona un protocolo detallado para identificar amiloide placas Aß en secciones de cerebro de modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer antes de pre-incrustación de la inmunotinción (específicamente para ionizado molécula de unión a calcio adaptador 1 (Iba1), una proteína de unión de calcio expresada por microglia) y el procesamiento de tejido para microscopía electrónica (EM). Metoxi-X04 es un colorante fluorescente que atraviesa la barrera hematoencefálica y selectivamente se une a las hojas plegadas beta que se encuentran en centros densos placas de Aß. La inyección de los animales con metoxi-X04 antes del sacrificio y la fijación del cerebro permite la preselección y selección de las secciones del cerebro que contiene de placa para su posterior procesamiento con manipulaciones que consumen mucho tiempo. Esto es particularmente útil en el estudio de la patología AD temprano dentro de las regiones específicas del cerebro o capas que pueden contener muy pocas placas, presentes en sólo una pequeña fracción de las secciones. procesamiento post-mortem de las secciones de tejido con Rojo Congo, tioflavina S, y ThioflAvin T (o incluso con metoxi-X04) puede etiquetar láminas beta plegadas, pero requiere una amplia compensación con etanol para eliminar el exceso de colorante y estos procedimientos son incompatibles con la conservación ultraestructural. También sería ineficiente para llevar a cabo el etiquetado de Aß (y otros marcadores celulares como Iba1) en todas las secciones del cerebro de las regiones de interés, sólo para dar una pequeña fracción que contiene placas de Aß en el lugar correcto. Es importante destacar que las placas de Aß son todavía visibles después de la elaboración de tejidos para EM, lo que permite una identificación precisa de las zonas (generalmente hasta unos pocos milímetros cuadrados) para examinar con el microscopio electrónico.

Esta sección ilustra los resultados que se pueden obtener en diferentes pasos críticos del protocolo. En particular, los resultados muestran ejemplos de las secciones del cerebro que contienen metoxi-X04 placas teñidas en la región específica y capas de interés: el hipocampo CA1, radiatum estrato, y lacunosum-moleculare. Las placas y la organización regional / laminar del hipocampo se visualizan sucesivamente usando una combinación de UV y filtros de campo claro (Figura 1...

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Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

En este artículo se describe un protocolo para la visualización de las placas amiloides Aß en modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer utilizando metoxi-X04, que cruza la barrera sangre-cerebro y selectivamente se une a ß-plisadas las hojas que se encuentran en centros densos placas de Aß. Permite pre-selección de secciones de tejido que contiene de placa antes de la inmunotinción y el procesamiento para microscopía electrónica.

Correlativa Microscopia óptica y electrónica para estudiar las interacciones microgliales con placas de beta-amiloide

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

correlative-light-electron-microscopy-to-study-microglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K vistas.  CHU de Québec Research Center.  En este artículo se describe un protocolo para la visualización de las placas amiloides Aß en modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer utilizando metoxi-X04, que cruza la barrera sangre-cerebro y selectivamente se une a ß-plisadas las hojas que se encuentran en centros densos placas de Aß. Permite pre-selección de secciones de tejido que contiene de placa antes de la inmunotinción y el procesamiento para microscopía electrónica. 

Video: Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Investigación

Neurociencias

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Ensayo Preferencia luz para estudiar innata y circadiano Photobehavior Regulado de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Un modelo de interfaz de sangre-cerebro humano estudiar cruces de barrera por patógenos o medicamentos y sus interacciones con el cerebro

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Adsorción molecular inducida por la luz de proteínas utilizando el sistema PRIMO para micro-patrones para estudiar las respuestas celulares a las proteínas de matriz extracelular

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales

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Correlativa Microscopia óptica y electrónica para estudiar las interacciones microgliales con placas de beta-amiloide

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