This work has been financially supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (No. 25248027 to M.S.).

1. Preparación de muestras <ol><li> La purificación de los monómeros sensibles a la temperatura <ol><li> Disolver 20 g de N -isopropylacrylamide (NIPA) en 100 ml de tolueno. </li><li> Se filtra la solución con succión para eliminar el polvo. </li><li> Mezclar el filtrado con 500 ml de éter de petróleo. </li><li> Coloque el recipiente de reacción en un baño de hielo-agua. </li><li> Se agita la solución hasta que los monómeros se precipitan (típicamente 30 min). </li><li> Se filtra la solución con succión para obtener los monómeros de precipitados. </li><li> Secar los monómeros bajo presión reducida (100 Pa) durante la noche. </li></ol></li><li> Preparación de la solución de polímero sensible a la temperatura <ol><li> Degas 20 ml de agua desionizada durante 1,0 min usando una bomba de diafragma. </li><li> Disolver 780,8 mg del ingreso y producción purificado en 9,5 ml de agua desionizada y desgasificada. </li><li> Coloque el recipiente de reacción en un baño de hielo-agua. </li><li> Proteger a la reacción dea la luz cubriendo el aparato con papel de aluminio. </li><li> Se agita la solución suavemente durante 10 min mientras que la introducción de un flujo moderado de gas Ar suavemente a través de una punta de pipeta unida a la botella de gas con un tubo. </li><li> Añadir 11,9 l de N, N, N &#39;, N&#39; tetrametiletilendiamina a la solución a través de una micropipeta. </li><li> Se agita la solución durante 1,0 minutos, mientras que la introducción de gas Ar, tal como se menciona en el paso 1.2.5. </li><li> Mientras se agita la muestra, se disuelven 4,0 mg de persulfato de amonio en 0,5 ml de agua desionizada y desgasificada. </li><li> Mezclar la solución de la muestra (de la etapa 1.2.7) y la solución de persulfato de amonio (de la etapa 1.2.8). </li><li> Se agita la solución durante 30 s, mientras que la introducción de gas Ar, tal como se menciona en el paso 1.2.5. </li><li> Cubrir la solución con papel de aluminio y guardar en el refrigerador (4 ° C) durante la noche. </li></ol></li><li> Preparación de sujeciones de los modelos <ol><li> Colocar 60 l de la solución de muestra (depaso 1.2.11) en una diapositiva cavidad. </li><li> Cubrir la solución con una cubierta de vidrio circular. Tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire. </li><li> Retire el exceso de solución con una micropipeta y de laboratorio toallitas. </li><li> Sellar la muestra con pegamento. Deje que el pegamento se seque a temperatura ambiente (típicamente 6 h). </li><li> Preparar otra diapositiva llena de látex de 0,1% en peso de poliestireno (diámetro de partícula de 100 nm) la suspensión siguiendo los pasos 1.3.1-1.3.4. Esta diapositiva se utiliza como un estándar. </li></ol></li></ol> 2. Tamaño de Partícula de medición con una dispersión microscopio de luz dinámica <ol><li> Optimización del instrumento <ol><li> Colocar el portaobjetos suspensión de látex de poliestireno (de la etapa 1.3.5) en la platina del microscopio invertido. La parte cubierta de vidrio debe quedar hacia abajo. </li><li> Colocar un amortiguador de haz delante del detector (un fotodiodo de avalancha y un autocorrelador). </li><li> Aplicar un haz de láser (láser de estado sólido, λ = 488 nm, 30 mW, continuode onda) a la muestra a través de una lente de objetivo (10 ×). Una parte de la luz reflejada pasa a través de un espejo lanzamiento del microscopio y se observa por una cámara CCD montada en el puerto del lado del microscopio (Figura 1). </li><li> Ajuste la altura de la lente del objetivo para ajustar el punto focal en la suspensión de la muestra al cambiar la altura de la lente del objetivo de la posición de baja a alta. Durante este procedimiento, la imagen reflejada se centra en tres ocasiones: en la superficie del vidrio de cubierta, en la interfaz entre el vidrio de cubierta y la muestra, y en la interfaz entre la muestra y el cristal agujero de diapositivas. Establecer el punto focal entre los puntos segundo y tercero. </li><li> Atenuar la intensidad de la luz dispersada por el cambio de la potencia del láser. </li><li> Introducir la luz dispersada en el detector mediante la eliminación de la compuerta de haz delante del detector. Esta unidad mide la correlación temporal de la intensidad de la luz. </li><li> Establecer un agujero de alfiler (φ = 50 micras) between el microscopio y el detector para lograr el efecto confocal. Ajustar la posición del agujero de alfiler para maximizar la intensidad de la luz en el detector. </li><li> Medir la función de correlación en el tiempo de la intensidad de la luz dispersada durante 30 s mediante el inicio de la operación del correlador través de un ordenador. La función de correlación se mide a menudo se expresa como g (2) (t) - 1, donde t es el tiempo de correlación y 4 <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq1.jpg" /> . Aquí, I (t) es la intensidad de la luz dispersada en el momento t, y (•••) T es un promedio de tiempo. El tiempo de caída será de aproximadamente 0,1 ms. </li><li> Ajustar el punto focal para obtener una amplia gama para la amplitud inicial de la función de correlación en el tiempo (g (2) (t = 0) - 1). NOTA: La amplitud inicial es fuertemente afectada por la cantidad de luz reflejada. Moviendo el punto focal de remolqueARD El interfaz entre el vidrio de cubierta y la muestra, aumenta la cantidad de luz reflejada. Para fuertes dispersores de luz, tales como látex de poliestireno, la amplitud inicial puede ser alterada de 0 a 1. Sin embargo, es difícil establecer la amplitud inicial cerca de 1 para las soluciones de polímero más comunes porque la intensidad de la luz reflejada es mucho mayor que la de la luz dispersada. </li><li> Aplicar la inversa de Laplace de transformación (mediante el programa de regularización limitado CONTIN 13,14) a la función de correlación en el tiempo obtenido para adquirir la función de distribución de tamaño. En los casos en que la amplitud inicial se establece en menos de 0,2, la función de distribución de la radio hidrodinámico mostrará un fuerte pico alrededor de 100 nm, que es dos veces el radio real (véase la discusión para más detalles). </li></ol></li><li> medición de la muestra <ol><li> Ajuste la temperatura de la etapa a 25 ° C. </li><li> Coloque una diapositiva preparada con poli-ingreso y producción solut (PNIPA)ion (etapa 1.3.4) en la platina del microscopio. </li><li> Medir la función de correlación en el tiempo de la intensidad de la luz dispersada por los siguientes pasos 2.1.4-2.1.8. Si la amplitud inicial es mayor que 0,2, ajustar el punto focal para que la amplitud inicial de la función de correlación de tiempo inferior a 0,2 siguiendo el paso 2.1.9. Una pequeña amplitud inicial simplifica el análisis. </li><li> Ajuste la temperatura de la etapa a 35 ° C y espere hasta que la solución se vuelve turbia. La temperatura de solución crítica inferior (LCST) de solución PNIPA es de 32 ° C 15. </li><li> Medir la función de correlación en el tiempo siguiendo los pasos 2.1.4-2.1.8. Si es posible, ajustar la posición del punto focal para hacer la amplitud inicial de la función de correlación de tiempo inferior a 0,2. Para las soluciones turbias, sus amplitudes iniciales tienden a aumentar, ya que la intensidad de los dispersos luz aumenta mientras que la de la luz reflejada se mantiene constante. </li><li> Aplicar la inversa de Laplace Transformatia las funciones de correlación de tiempo obtenidos para obtener las funciones de distribución de tamaño. Tenga en cuenta que el tamaño real es la mitad del valor obtenido en el caso de que la amplitud inicial es menor que 0,2. </li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

La amplitud inicial de la función de correlación de tiempo depende en gran medida del punto focal, tal como se muestra en la Figura 2 (a). Esta aparentemente contradice el hecho de que la solución es homogénea (a excepción de la capa delgada en la interfaz) 8. Esta variación en la amplitud inicial se atribuye a una variación en la cantidad de luz reflejada. La teoría heterodino parcial 16 predice que la amplitud inicial, A, la intensidad de la luz dispersada, yo s, y la intensidad de la luz reflejada, I r, satisface la siguiente ecuación 1 <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq2.jpg" /> Esta ecuación muestra que la mayor I r se convierte, el más pequeño se convierte en A. Por lo tanto, A se reduce en un ajuste de la posición focal cerca de la interfaz. La aparente constante de difusión D A can obtenerse mediante el ajuste de la función de correlación en el tiempo en el caso de soluciones monodispersas: <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq3.jpg" /> dónde <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq4.jpg" /> . Aquí, n es el índice de refracción del disolvente (agua, 1,33), θ es el ángulo dispersa (180 °), y λ es la longitud de onda de la luz (514,5 nm). Desde aplicamos la geometría de retrodispersión, el valor de q es fijo. Sin embargo, este punto se resuelve mediante el uso de diferentes longitudes de onda de la luz. Tenga en cuenta que cualquier tipo de fuente de láser de onda continua está disponible para construir el microscopio DLS. Gracias al pequeño volumen irradiado, el factor de coherencia 17 se estima en más de 0,99 y es insignificante. Para soluciones polidispersos, la función de distribución de D A se obtiene por la transformación inversa de Laplace. º parciales heterodyneEory también predice que D A no es la misma que la constante de difusión real D. Estas dos constantes de difusión satisfacen la siguiente ecuación: <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq5.jpg" /> La constante de difusión D se convierte en el hidrodinámico h radio R utilizando la ecuación de Einstein-Stokes 4. Cuando a = 1, esta relación se convierte en D A = D. En este caso, el proceso de conversión de datos es el mismo que el de la dispersión dinámica de luz común. La línea roja muestra en la Figura 2 (b) corresponde a este caso. Por el contrario, esta relación se convierte en D A = 0,5 D en el límite de A → 0. Por lo tanto, el tamaño se estima que es dos veces mayor que el tamaño real cuando A es pequeña (prácticamente, a menos de 0,2), como se muestra por la línea azul de la figura 2 (b) </strong&gt;. Si se sabe que A es significativamente pequeña, el eje horizontal puede ser desplazado, como se muestra en la Figura 2 (c). En principio, se puede convertir en D A D para cualquier valor de a. En la práctica, sin embargo, es mejor para establecer la amplitud inicial menor que 0,2, ya que la aproximación simple D A ~ 0,5 D es cierto. Las características destacadas de la técnica de dispersión de luz dinámica microscopio se demostró usando una solución PNIPA. La conformación de PNIPA debajo y por encima de la LCST se ha estudiado ampliamente el uso de neutrones de ángulo pequeño de dispersión 15,18. Por el contrario, la dispersión dinámica de la luz no se ha utilizado para el análisis de PNIPA por encima de la LCST debido a su turbidez 19. Este problema se resuelve por el microscopio dispersión de luz dinámica, como se muestra en las figuras 3 (a) y (b). El tamaño de estos agregados es de varios y# 181; m, lo que no puede obtenerse por cualquiera de pequeña rayos X de ángulo / dispersión de neutrones o técnicas de dispersión de luz convencionales. mediciones de tiempo de resolverse utilizando este sistema dan información sobre el proceso de agregación durante el cambio de temperatura. El inconveniente del microscopio dispersión de luz dinámica también se ilustra en la Figura 3. Para el resultado por debajo de la LCST, la función de correlación en el tiempo está fuertemente afectada por la muy pequeña cantidad de polvo presente (las líneas negras en la Figura 3). Por ejemplo, la función de correlación en el tiempo no se descompone por completo, incluso con tiempos de correlación en el orden de 1,0 s. Esto se debe a que el volumen irradiado con este aparato (aproximadamente 1,0 m) es significativamente menor que la irradiada con el aparato de dispersión de luz dinámica habitual (aproximadamente 100 micras). En los casos en que la intensidad de la luz dispersada es débil, la señal es oscurecida por el ruido, como la causada por salameda cantidades de polvo en la solución. Por lo tanto, los tres picos que se muestran en la Figura 3 (b) no pueden tener importancia cuantitativa aunque el orden general de que el tamaño es significativa. Tenga en cuenta que un dispersor tan débil se puede medir mediante un aparato de dispersión dinámica de luz convencional. Hemos demostrado que el microscopio dispersión de luz dinámica nos permite medir muestras tanto transparentes y turbios con la misma configuración. Dado que la longitud del camino óptico en las muestras es corto, esta técnica se puede aplicar a fuertes muestras absorbentes de la luz, tales como suspensiones de nanotubos de carbono 20. Además, debido a su alta resolución espacial, esta técnica se puede aplicar a las células biológicas. Para su aplicación a la biología, este método también se puede combinar con otras técnicas de imagen, tales como la fluorescencia y formación de imágenes Raman. Por lo tanto, creemos que el microscopio dispersión de luz dinámica es una poderosa herramienta para una amplia gama de campos de investigación.

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 &#181;m or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions4. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.
Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy5,6, low-coherence dynamic light scattering7,8, diffusing-wave spectroscopy9,10, and differential dynamic microscopy11,12.
We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope1. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-isopropylacrylamide, 98%</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>I0401</td><td></td></tr><tr><td>toluene, 99%</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>201-01876</td><td></td></tr><tr><td>petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 &amp;deg;C</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-22565</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetramethylethylenediamine, 99%</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate, 98%</td><td>Sigma</td><td>248614</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene latex suspension, 1 wt%</td><td>Duke Scientific Corporation</td><td>3500A</td><td></td></tr><tr><td>argon</td><td>Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.</td><td></td><td>purity &gt; 99.999 vol.%</td></tr><tr><td>cavity slide</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>83-0336</td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Nikon Instech Co., Ltd.</td><td>ECLIPSE Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate</td><td>Tokai Hit CO.,Ltd</td><td>TP-108R-C</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS 488LX</td><td></td></tr><tr><td>avalanche photodiode</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode</td><td></td></tr><tr><td>correlator</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-5000/EPP</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Funciones de tiempo de correlación de la intensidad de la luz dispersada para una suspensión de látex de poliestireno (radio de la partícula: 50 nm) se midieron en diferentes puntos focales, como se muestra en la Figura 2 (a). Estas funciones de correlación se convirtieron en las funciones de distribución del radio hidrodinámico por la transformación inversa de Laplace (se refieren a la figura 2 (b) y (c)). Utilizando el mismo procedimiento, las funciones de correlación de tiempo y funciones de distribución del radio hidrodinámico de la solución PNIPA se obtuvieron a 25 ° C y 35 ° C, respectivamente. Las figuras 3 (a) y (b) muestran las funciones de correlación de tiempo de la intensidad de la luz dispersada y las correspondientes funciones de distribución de tamaño de la solución por debajo de PNIPA (25 ° C) y superior (35 ° C) de la LCST. Las funciones de distribución de tamaño se obtuvieron mediante la transformación inversa de Laplace seguido de lacorrección de la heterodino parcial. El radio hidrodinámico promedio por debajo de la LCST es de varias decenas de nanómetros, lo cual es típico para las soluciones de polímero. En contraste, el radio hidrodinámico por encima de la LCST es de aproximadamente 1,0 micras. Este resultado es consistente con el hecho de que la solución está turbia por encima de la LCST. Las líneas rojas y azules en la Figura 3 representan la distribución del tamaño de las soluciones PNIPA obtiene inmediatamente después y 20 minutos después de que la solución se volvió turbia, respectivamente. La Figura 3 (b) indica claramente el crecimiento de la agregación. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema del microscopio dispersión de luz dinámica. Pinhole (PH), divisor de haz (BS), polarizador (Pol) y un fotodiodo de avalancha (APD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver</a>una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig2.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos para una suspensión de látex de poliestireno. (A) Tiempo de funciones de correlación de la intensidad de la luz dispersada por la suspensión de látex de poliestireno. El radio nominal es 50 nm y la concentración es 0,1% en peso. Dos conjuntos de datos se obtuvieron a partir de diferentes puntos de dispersión. (B), (c) correspondientes funciones de distribución de tamaño de la suspensión de látex de poliestireno obtenidos por la inversa de Laplace transformación de (a). La línea roja corresponde a la función de correlación en el tiempo cuya amplitud inicial es de aproximadamente 1,0, y la línea azul corresponde a la que con una amplitud inicial que es de aproximadamente 0,2. En el eje horizontal se calcula sin (b) y con (c) teniendo en cuenta el efecto de heterodino parcial (PHD) cuando A &lt;&lt;<html> ; 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig3.jpg" /> Figura 3. Los resultados representativos para una solución PNIPA. (A) Tiempo de funciones de correlación de la intensidad de la luz dispersada por la solución PNIPA. (B) funciones de distribución de tamaño correspondiente para la solución PNIPA obtenido por la transformación inversa de Laplace de (a). En el eje horizontal se calcula teniendo en cuenta el efecto de heterodino parcial para cada conjunto de datos. La línea de color negro representa los datos obtenidos a 25 ° C. La línea roja representa los datos obtenidos a continuación de la solución se volvió turbia (35 ° C). La línea azul representa los datos obtenidos después de una medición de 20 min de la línea roja./54885/54885fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Se presenta un protocolo para la medición directa de la distribución del tamaño de partícula en soluciones concentradas utilizando microscopía de dispersión de luz dinámica.

Medición de Tamaño de Partícula de distribución en turbias Soluciones por Dynamic Light Scattering Microscopía

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

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14.3K vistas.  University of Tokyo.  Se presenta un protocolo para la medición directa de la distribución del tamaño de partícula en soluciones concentradas utilizando microscopía de dispersión de luz dinámica. 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Investigación

Bioingeniería

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Dispersión de los nanomateriales en medios acuosos: hacia la optimización del Protocolo

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Medio ambiente

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this work, we use single particle tracking of fluorescently labeled PNIPAM microgels as a showcase for tuning microgel size by a rapid non-stirred precipitation polymerization procedure. This approach is well suited for prototyping new reaction compositions and conditions or for applications that do not require large amounts of product. Microgel synthesis, particle size and structure determination by dynamic and static light scattering are detailed in the protocol. It is shown that the addition of functional comonomers can have a large influence on the particle nucleation and structure. Single particle tracking by wide-field fluorescence microscopy allows for an investigation of the diffusion of labeled tracer microgels in a concentrated matrix of non-labeled microgels, a system not easily investigated by other methods such as dynamic light scattering.

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform PolyN-isopropylacrylamide Microgels

Non-stirred precipitation polymerization provides a rapid, reproducible prototyping approach to the synthesis of stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) microgels of narrow size distribution. In this protocol synthesis, light scattering characterization and single particle fluorescence tracking of these microgels in a wide-field microscopy setup are demonstrated.

Síntesis controlada y de seguimiento de la fluorescencia de muy uniforme de poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) microgeles

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this ...

Química

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Aplicación de voltaje en el análisis de tamaño de partículas de dispersión de luz dinámica

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful platform for exploring the physics of polyelectrolyte interactions and also offer a promising solution to the pressing problem of delivering therapeutic oligonucleotides in vivo. Developing predictive structure-property relationships for PCMs has proven difficult, in part due to the presence of strong kinetic traps during nanoparticle self-assembly. This article discusses criteria for choosing polymers for PCM construction and provides protocols based on salt annealing that enable assembly of repeatable, low-polydispersity nanoparticles. We also discuss PCM characterization using light scattering, small-angle X-ray scattering, and electron microscopy.

We provide protocols and representative data for designing, assembling, and characterizing polyelectrolyte complex micelles, core-shell nanoparticles formed by polyelectrolytes and hydrophilic charged-uncharged block copolymers.

Montaje y caracterización de micelas complejas de polielectrolitos

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood banks. Cells fragment off microparticles (MP) when they are stressed. Blood and blood components may contain cellular fragments from a variety of cells, most notably from activated platelets. When performing their roles as innate immune cells and major players in coagulation and hemostasis, platelets change shape and generate microparticles. With dynamic light scattering (DLS)-based microparticle detection, it is possible to differentiate activated (high microparticle) from non-activated (low microparticle) platelets in transfusions, and optimize the use of this scarce blood product. Previous research suggests that providing non-activated platelets for prophylactic use in hematology-oncology patients could reduce their risk of becoming refractory and improve patient care. The goal of this screening method is to routinely differentiate activated from non-activated platelets. The method described here outlines the steps to be performed for routine platelet inventory management in a hospital blood bank: obtaining a sample from a platelet transfusion, loading the sample into the capillary for DLS measurement, performing the DLS test to identify microparticles, and using the reported microparticle content to identify activated platelets.

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative in hospital blood banks. The goal is to differentiate activated from non-activated platelets to optimize the use of platelets. Providing non-activated platelets to hematology-oncology patients might reduce their high risk to become refractory.

Rutina de detección del método de micropartículas en las transfusiones de plaquetas

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Medicina

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal biopolymers may lead to a host of active and adaptable materials. However, engineering such materials with precisely tuned properties requires measuring how the dynamics depend on the network composition and synthesis methods. Quantifying such dynamics is challenged by variations across the time, space, and formulation space of composite networks. The protocol here describes how the Fourier analysis technique, differential dynamic microscopy (DDM), can quantify the dynamics of biopolymer networks and is particularly well suited for studies of cytoskeleton networks. DDM works on time sequences of images acquired using a range of microscopy modalities, including laser-scanning confocal, widefield fluorescence, and brightfield imaging. From such image sequences, one can extract characteristic decorrelation times of density fluctuations across a span of wave vectors. A user-friendly, open-source Python package to perform DDM analysis is also developed. With this package, one can measure the dynamics of labeled cytoskeleton components or of embedded tracer particles, as demonstrated here with data of intermediate filament (vimentin) networks and active actin-microtubule networks. Users with no prior programming or image processing experience will be able to perform DDM using this software package and associated documentation.

Differential dynamic microscopy (DDM) combines features of dynamic light scattering and microscopy. Here, the process of using DDM to characterize reconstituted cytoskeleton networks by quantifying the subdiffusive and caged dynamics of particles in vimentin networks and the ballistic motion of active myosin-driven actin-microtubule composites is presented.

Cuantificación de la dinámica del citoesqueleto mediante microscopía dinámica diferencial

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Biología

Dynamic Light Scattering Analysis for the Determination of the Particle Size of Iron-Carbohydrate Complexes

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally heterogeneous nanoparticle complexes, which exhibit varying sensitivity to the conditions required for the methodologies available to physicochemically characterize these agents. Currently, the critical quality attributes of iron-carbohydrate complexes have not been fully established. Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a fundamental method to determine intact particle size and distribution. However, challenges still remain regarding the standardization of methodologies across laboratories, specific modifications required for individual iron-carbohydrate products, and how the size distribution can be best described. Importantly, the diluent and serial dilutions used must be standardized. The wide variance in approaches for sample preparation and data reporting limit the use of DLS for the comparison of iron-carbohydrate agents. Herein, we detail a robust and easily reproducible protocol to measure the size and size distribution of the iron-carbohydrate complex, iron sucrose, using the Z-average and polydispersity index.

Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a suitable assay for evaluating the particle size and distribution of intravenously administered iron-carbohydrate complexes. However, the protocols lack standardization and need to be modified for each iron-carbohydrate complex analyzed. The present protocol describes the application and special considerations for the analysis of iron sucrose.

Análisis dinámico de dispersión de luz para la determinación del tamaño de partícula de complejos hierro-carbohidratos

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally ...

Medición de Tamaño de Partícula de distribución en turbias Soluciones por Dynamic Light Scattering Microscopía

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