We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

NOTA: Siga todas las normativas institucionales con respecto al uso seguro y la eliminación de los materiales radiactivos, incluyendo pero no limitado a, el uso de equipo de protección personal, como guantes, gafas de seguridad, ropa de laboratorio, y escudos de acrílico adecuados. NOTA: El tampón estándar consta de 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM de glutamato de potasio, DTT 5 mM, EDTA 0,1 mM (este tampón se pre-hizo a una concentración 5x) y 0,3 mM de cada dNTP. Proteínas de replicación de T7 se purifican como se describe 8, 9, 10. ADN de una sola hebra que contiene un único sitio de reconocimiento de T7 primasa (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) se pueden adquirir en una variedad de empresas de síntesis de ADN (la longitud de el ssDNA puede depender de la enzima de elección, para primasa T7, un pentámero es la longitud mínima molde para sintetizar un cebador de longitud completa 11, ya que la críptica C es esencial, sin embargo, si el cebador se va a extender por la polimerasa, nucleótidos adicionales deben estar presentes en el extremo 3 &#39;de la plantilla. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de una concentración final de 10 mM MgCl 2 y se incubaron a 25 ° C. El muestreo manual funciona bien para los puntos de tiempo de 5 segundos o más. Si se requieren puntos de tiempo más cortos que eso, se recomienda utilizar un instrumento de flujo rápido de enfriamiento rápido para obtener datos precisos. 1.-rotación múltiple Primer Síntesis de reacción por muestreo manual <ol><li> Antes de iniciar el experimento, alícuota de 2 l de tampón de colorante formamida (93% (v / v) de formamida, EDTA 50 mM, 0,01% xileno cianol y 0,01% de azul de bromofenol) en 8 tubos de polipropileno de 1,5 mL. En general, el número de tubos es igual al número de puntos de tiempo analizados. </li><li> Preparar una mezcla que consiste en 20 l de tampón 1x, 0,1 mM de ATP y CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32 P] CTP, 0,1 M SSDplantilla NA, y 0,1 M gp4 (expresado como concentración hexámero - 0,6 M de monómero). </li><li> Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Retire 2 l de la mezcla usando una pipeta y se mezcla con 2 l de tampón de colorante formamida en un tubo de 1,5 ml preparada en la etapa 1.1 para el control ninguna reacción (tiempo cero). </li><li> Añadir 2 l de 0,1 M MgCl 2 a la mezcla de reacción (a una concentración final de 10 mM). </li><li> Extraiga con las muestras 2 l de las mezclas de reacción utilizando una pipeta en intervalos de 10 s y se mezcla con el tinte de formamida predispensed en tubos de 1,5 ml preparada en el paso 1.1. </li><li> muestras de calor a 95 ° C durante 5 minutos en un bloque de calor. </li><li> Cargar alícuotas de las muestras en un gel desnaturalizante. Los pequeños productos de cebadores tetraribonucleotide sintetizados por la primasa T7 se resuelven bien en un 0,4 mm de espesor 25% de acrilamida: bisacrilamida (19: 1), 3 M de urea, 1x TBE (100 mM Tris-borato, EDTA 1 mM). </li><li> Coloque gel de todo el chromatograPHY papel y la cubierta con una envoltura de plástico. gel seco utilizando un secador de gel. </li><li> Preparar una serie de diluciones del resto de la mezcla de reacción y detectar el mismo volumen cargado en el gel en papel de cromatografía, es decir, detectar 4 l de la dilución si se cargaron 4 l de muestra. NOTA: Esto servirá como la curva estándar para determinar la concentración de los productos formados durante la reacción. Por ejemplo, cinco veces diluciones usando tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) funcionan bien, abarca una gama de 1:25 a 1: 15.625 (5 2 -5 6), pero las diluciones deben ser ajustado en función del nivel de actividad. </li><li> Exponer gel seco y estándar utilizando una pantalla PhosphorImager. Cuantificar la radiactividad en la serie de dilución y construir una curva estándar como se describe 8, 12 NOTA: La inclusión de T7 DNA polimerasa a la mezcla de reacción permite que uno EXAmina el uso de cebadores tetraribonucleotide por esta enzima. De manera óptima, la concentración de la polimerasa debe ser saturando para simplificar la interpretación de los datos. Una concentración de la polimerasa de 0,4 M o superiores da buenos resultados. Además, el efecto de otras proteínas, tales como proteínas de unión al ADN de una sola hebra, ya sea en la síntesis de cebador o retraso-strand iniciación se puede examinar de esta manera. </li></ol> 2. Múltiple-rotación Primer Síntesis de reacción usando un instrumento rápido enfriamiento rápido <ol><li> Preparación de mezclas de reacción <ol><li> Preparar 400 l de solución A, que contiene tampón 1x, 0,2 mM hexámero GP4, 0,2 M plantilla ssDNA, dNTPs 0,6 mM, 0,2 mM ATP y CTP (incluyendo 0,5 mCi / ml [α- 32 P] CTP. </li><li> Preparar 400 l de solución B, que contiene tampón 1x y MgCl 20 mM 2. </li></ol></li><li> El funcionamiento del instrumento de flujo rápido enfriamiento rápido <ol><li> Encienda el rapIdentificación del instrumento de flujo enfriamiento rápido; después de que aparezca el menú principal, tipo 7 en el teclado del instrumento para mover el controlador de la jeringa a la posición inicial. </li><li> posición de la jeringa tampón abierta a &quot;CARGA&quot;. </li></ol></li><li> Jeringas de carga de amortiguamiento <ol><li> Adjuntar un tampón que contiene 10 ml de la jeringa al puerto de jeringa unidad. Cambiar la posición de la perilla de la jeringa para &quot;CARGA&quot;. </li><li> El uso de jeringas de 10 ml, llenar tampón instrumento depósito A y B con Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM y llenar la jeringa C con una solución de enfriamiento rápido (EDTA 250 mM, y 0,2% SDS). Eliminar las burbujas de aire empujando los émbolos de entrada y salida. </li><li> Cambie la posición de la perilla para &quot;disparar&quot;. Tipo 2 para ajustar la posición de la barra de conductor jeringa. Pulse &quot;DISMINUIR&quot; botón para bajar la jeringa hasta tampón sale del bucle de salida: (7-baja de forma continua; 8 a gran paso hacia abajo; 9-pequeño paso hacia abajo). Tipo &quot;ESC&quot; para volver al menú principal. </li></ol></li><li> tubos de lavado <ol><li> attlínea de salida ada a vacío. Cambiar mandos de la muestra a &quot;flush&quot;. Cerrar tampón jeringa mediante el establecimiento de los mandos a la posición horizontal. A su vez en el vacío y moja los bucles 2 ras en H2O durante 10 s, luego sumerja en MeOH durante 10 s. bucles secos por succión de aire para ~ 15 s, o hasta que se seque. </li></ol></li><li> carga de muestras <ol><li> posición de la perilla del cambio de la muestra de &quot;CARGA&quot;. Coloque la solución A en 1 ml de la jeringa. Enchufe jeringa en uno de los puertos de carga de la muestra. Repita el procedimiento para la solución B, y el lugar en el puerto de carga de la muestra opuesta. </li></ol></li><li> Colección de puntos temporales <ol><li> En el menú principal, tipo 1 para la corrida de flujo de enfriamiento. Introduzca el tiempo (s) de reacción y de prensa, &quot;ENTER&quot;. El número de bucle de reacción a utilizar será mostrado. Cambiar al circuito de reacción requerida. Repita el procedimiento de lavado en el paso 2.2.4. </li><li> Vueltas a los botones de muestra &quot;cargar&quot;. Cargar reacción se mezcla en los bucles de muestra hasta justo fuera del compartimiento central de mezcla. Gire todas las perillas de &quot;FIRE &quot;. Confirmar que todos los mandos estén en la posición correcta. </li><li> Colocar tubo de 1,5 ml en el extremo del lazo de la salida. Pulse el botón &quot;GO&quot; para realizar la reacción. Repita el procedimiento de lavado en el paso 2.2.4. Actualizar jeringas tampón A y B hasta que lleguen al conductor. </li><li> Repita los pasos 2.2.6.2-2.2.6.3 para cada punto de tiempo deseado. Excepción: No cargue solución que contiene el reactivo de partida (es decir, MgCl 2 en este caso) cuando apagar el control de tiempo de punto cero. </li><li> Cuando haya terminado la recogida de muestras, introduzca &quot;ESC&quot; para volver al menú principal. Pulse la tecla &quot;7&quot; para volver conductor jeringa búfer a su posición inicial. </li></ol></li><li> Instrumento de limpieza <ol><li> Retire las jeringas mezcla de reacción. Girar el botón de carga de la muestra a la posición &quot;LOAD&quot;. Bajo vacío, lavar cada bucle de muestra con 10 ml de NaOH N 0,2, seguido de 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 y 10 ml de MeOH. </li><li> Gire las perillas de jeringa a la posición &quot;LOAD&quot;. Presione hacia abajo en los 3 SYRémbolos inge para recuperar reacción y enfriamiento rápido tampones. Lavar jeringas con 5 ml de H2O al menos dos veces. </li><li> Llenar jeringas de nuevo con 5 ml de H2O y girar las perillas a la posición de &quot;disparo&quot;. Cambiar las posiciones de perilla y encienda el vacío para eliminar el H 2 O. rasante como en el paso 2.2.4. Apaga instrumento. NOTA: Los productos se analizaron como se describe en los pasos 1.7-1.12. Además, ADN polimerasa de T7 y otras proteínas de replicación se pueden añadir en la mezcla de reacción para analizar su efecto sobre la síntesis del cebador o la extensión. </li></ol></li></ol> 3.-rotación con cebador único Síntesis de Reacción NOTA: Single-rotación de los ensayos de imprimación síntesis / extensión se llevan a cabo de manera similar a las reacciones de múltiples volumen de negocios, con algunas diferencias importantes: estos ensayos siguen la conversión de ATP radiomarcado en cebadores o de extensión productos, sin embargo la concentración de sustratos y proteínas son consideraBly superior. Además, con el fin de alcanzar una resolución de milisegundos para permitir el análisis de la reacción de síntesis del cebador, se debe utilizar una máquina de flujo rápido enfriamiento rápido. <ol><li> Preparación de mezclas de reacción. <ol><li> Preparar 400 l de la solución A, que contiene tampón 1x, 3 M hexámero GP4, 6 M ssDNA plantilla, dNTPs 0,6 mM, CTP, 1 y 2 nM de [γ- 32P] ATP. Preparar 400 l de solución B, que contiene tampón 1x y MgCl 20 mM 2. </li></ol></li><li> Operación de flujo rápido enfriamiento rápido <ol><li> Llevar a cabo reacciones como se describe en el paso 2.2. Si se desea, añadir ADN polimerasa de T7 o proteína de unión de T7 sola-ADN de cadena a una concentración de 15 mM y 20 mM, respectivamente. En este caso, los productos de extensión se acumulan en un régimen de tiempo que permite la toma de muestras manual de la reacción. </li></ol></li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Fit curvas de progreso de producto a lo menos- no linealcuadrados modelos que utilizan el software disponible en el mercado capaces de mínimos cuadrados ajustes y / o integración numérica. Los detalles de la operación variará con el software empleado, pero a continuación son formas generalizadas de ecuaciones utilizadas para el montaje de los datos. </li><li> Determinar la tasa de formación de producto de múltiples reacciones de síntesis de imprimación rotación mediante el ajuste de las curvas de progresar a una ecuación lineal. Si hay curvatura significativa, utilice el método de la tasa inicial de 13, 14 ajustando los datos a una función de un solo exponencial: y = A (e - k t), donde y es la concentración de producto, A es la amplitud de reacción, k se la constante de velocidad observada, t es el tiempo, en segundos. La pendiente de la recta tangente en el tiempo = 0 es la velocidad inicial. NOTA: Ajuste pre-estacionario reacciones de síntesis de imprimación estado a una ecuación lineal o de la ecuación de estado pre-estacionario estallar y = a (e - k buprimer t) + tasa ss t, donde A es la amplitud de reacción, k ráfaga es la constante de velocidad observada para la ráfaga estado pre-estacionario, ss tasa es la ss tasa = k gato de estado estacionario [Enzima]), t es el tiempo , en segundos. Encajan solo volumen de negocios reacciones de síntesis de imprimación curvas a una sola función exponencial y = A progresan (e - k t). En el caso de GP4, ajustar los datos por integración numérica 15, a un modelo con tres etapas de condensación NTP, donde cada intermedio se encuentra en equilibrio con la enzima, el uso de software disponible en el mercado. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El factor más importante en la realización de estos experimentos es la disponibilidad de enzima purificada de gran actividad. Durante nuestro trabajo con GP4, por ejemplo, se encontró que el almacenamiento de la enzima purificada en tampón (20 mM de fosfato de potasio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) que contiene 50% de glicerol a -20 ° C conduce a una reducción en la actividad específica del preparado durante unos meses. Por lo tanto, ahora flash congelación pequeñas alícuotas de gp4 purificada en 25 mM Tris-H...

La replicación del ADN es una característica conservada de toda la vida celular. Mientras que la identidad y el número de componentes de replicación varían ampliamente, los mecanismos generales se comparten a través de la evolución 1. A continuación, describimos, experimentos cinéticos discontinuos a base de gel, utilizando sustratos radiactivos, dirigidas a la comprensión de la cinética de la síntesis de ADN de hebra retrasada in vitro por los componentes de la replisome T7. La maquinaria de replicación del bacteriófago T7 es muy simple, que consiste en sólo cuatro proteínas (la ADN polimerasa, GP5, y su factor de procesividad, E. coli tiorredoxina, los gp4 bifuncionales primase-helicasa, y la proteína de unión de ADN de una sola hebra, GP2. 5) 2. Esta característica lo convierte en un sistema modelo atractivo para estudiar los mecanismos bioquímicos conservados implicados en la replicación del ADN. Se hace especial hincapié en la formación de cebadores de ribonucleótidos por T7 ADN primasa, una critical paso en la iniciación de la síntesis de ADN. Además, también se puede examinar el uso de estos cebadores por ADN polimerasa de T7 o de otras proteínas de replicación mediante su inclusión en la mezcla de reacción. La T7 primasa-helicasa, GP4, cataliza la formación de cebadores para la síntesis de ADN en secuencias específicas de ADN denominadas sitios de reconocimiento primase, o PRS, (5&#39;-GTC-3 &#39;). La citosina en el PRS es críptica, es esencial para el reconocimiento del sitio, pero no se copia en el producto 3. El primer paso en la síntesis de cebador mediante gp4 implica la formación del dinucleótido pppAC, que luego se extiende a un trímero, y eventualmente a cebadores tetranucleotide funcionales pppACCC, pppACCA, o pppACAC dependiendo de la secuencia en la plantilla 4. Estos cebadores pueden usarse entonces por ADN polimerasa de T7 para iniciar la síntesis de ADN, que es también un proceso gp4 asistida 5, 6. En este sentido, la primasadominio estabiliza los tetraribonucleotides extremadamente cortos con la plantilla, lo que impide su disociación, se dedica ADN polimerasa de una manera conducente a asegurar el cebador / plantilla en el sitio activo de la polimerasa 7. Estos pasos (síntesis de ARN del cebador, de traspaso cebador para la polimerasa, y de extensión) se repiten en múltiples ciclos para replicar el filamento de revestimiento y deben coordinarse con la replicación de la hebra que lleva. Los ensayos descritos aquí son altamente sensibles y pueden realizarse en un marco de tiempo moderado. Sin embargo, son relativamente de bajo rendimiento y gran cuidado debe ejercerse en el uso y desecho de materiales radiactivos. Dependiendo de la velocidad a la que transcurre la reacción, se puede emplear un instrumento de rápido enfriamiento para alcanzar muestras a escalas de tiempo susceptibles de un análisis significativo de los cursos de tiempo de reacción, ya sea en la constante o el estado pre-estacionario. Recientemente, hemos utilizado ensayos descritos aquí para proporcionar evidence de la importancia de la liberación de imprimación desde el dominio de primasa de GP4 en la iniciación de los fragmentos de Okazaki. Además, se encontró evidencia de un papel regulador de la proteína T7, gp2.5 de unión al ADN de una sola cadena, en la promoción de la formación y la utilización eficiente de imprimación 8.

<table><tbody><tr><td>Tris pre-set crystals&lt;br/&gt; pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td><td>SIGMA</td><td>G1501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>four dNTPs part of set</td></tr><tr><td>100 mM ATP and CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>part of NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructs</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>SIGMA</td><td>B8026&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&amp;nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&amp;nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Los resultados mostrados en la Figura 1A se obtuvieron como se describe en el paso 1 del protocolo, es decir, mediante el muestreo de forma manual una reacción de síntesis del cebador catalizada por la GP4 en condiciones de múltiples volumen de negocios. Aquí, una gama de productos después de la electroforesis en gel se puede observar mediante el uso de CTP marcada con 32 P en la α-posición en reacciones de síntesis de cebador...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinética de la síntesis de ADN de hebra Quedando<em&gt; In Vitro</em&gt; Por el bacteriófago T7 proteínas de replicación

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

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7.3K vistas.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

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DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Investigación

Bioquímica

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biología

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA polymerase (RNAP) following a head-on collision is unknown. Here, we find that the E. coli replisome stalls upon collision with a head-on transcription complex, but instead of collapsing, the replication fork remains highly stable and eventually resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. We also find that the transcription-repair coupling factor, Mfd, promotes direct restart of the fork following the collision by facilitating displacement of the RNAP. These findings demonstrate the intrinsic stability of the replication apparatus and a novel role for the transcription-coupled repair pathway in promoting replication past a RNAP block.

The fate of the replisome following a collision with a head-on RNA polymerase (RNAP) is unknown. We find that the replisome stalls upon collision with a head-on RNAP, but resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. Mfd promotes replication restart by facilitating displacement of the RNAP after the collision.

Reinicie directa de un Tenedor replicación en punto muerto por una polimerasa de ARN Head-On

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Bioingeniería

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR cuantitativa de bacteriófago T7 de Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Inmunología e Infección

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

Trifosforilación química de oligonucleótidos

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Exploración de la dinámica de los fagos intestinales y las bacterias en modelos murinos utilizando el fago T4

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

Autor destacado: Investigación de las respuestas inmunitarias inducidas por bacteriófagos en ratones gnotobióticos

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Cinética de la síntesis de ADN de hebra Quedando

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Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

Reinicie directa de un Tenedor replicación en punto muerto por una polimerasa de ARN Head-On

Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

PCR cuantitativa de bacteriófago T7 de Biopanning

Trifosforilación química de oligonucleótidos

Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo