La edición del genoma compone de técnicas con la que los investigadores pueden "Editar" o cambiar una secuencia específica de ADN. Estos métodos se basan en la creación de pequeños "cortes" en el ADN, que las células tratan de reparar, a menudo incompleto. De esta manera, los científicos pueden inducir mutaciones en las secuencias específicas con mayor eficacia en comparación con el clásico gene targeting.
En este video, revisaremos los principios detrás de tres técnicas de edición de genoma y uno de ellos, el sistema CRISPR Cas9 discutir un protocolo generalizado. A continuación exploraremos algunas aplicaciones de estos métodos.
En primer lugar, echemos un vistazo a los principios de la edición del genoma.
El método clásico para la introducción de cambios genéticos específicos secuencias en el genoma es gen por recombinación homóloga, donde la incorporación de secuencias homólogas en la construcción de objetivo conduce a la "conmutación hacia fuera" del gen endógeno de una versión modificada.
Como gene targeting, la edición del genoma puede apuntar cambios a regiones específicas de ADN, pero puede hacerlo con mayor eficacia, establecer las mutaciones deseadas en más células en cualquier experimento dado.
Todos los métodos de edición genoma dependen de la capacidad de las células para reparar roturas de doble cadena a su ADN por enzimas de. Este daño puede ser reparado por ensamblar nonhomologous end o NHEJ, donde extremos rotos de ADN son selladas directamente; o reparación dirigida por homología o HDR, donde el daño se fija mediante la copia de una plantilla de homóloga. NHEJ no es generalmente ideal y puede resultar en varias bases de ser borrado o añadido a la DNA reparada, mutando así la secuencia de destino. Por otro lado, HDR permite a los investigadores agregar una plantilla para dirigir cambios específicos al sitio de destino.
Tres técnicas de edición de genoma más importantes se han desarrollado y popularizado en los últimos años.
En un método, dominios investigadores fusible DNA-que atan "zinc finger" de cierto transcripción factores del dominio DNA-Máquinas Hendedoras de FokI endonucleasa. Como cada dominio de dedo de zinc reconoce a un triplete de nucleótidos específicas, estos dominios pueden artificialmente vincular Ingeniero zinc finger nucleasas o ZFNs, dirigidos a secuencias de ADN únicas.
Del mismo modo, nucleasas llamadas "TALENs" join Foka los variable dominios DNA-que atan de proteínas bacterianas llamé a efectores como activador de transcripción, o cuentos. Cada dominio cuento reconoce una base de ADN única, única, dando TALENs su especificidad de secuencia.
Por último, el sistema CRISPR Cas9 utiliza componentes de un sistema inmune procariota que normalmente protege su anfitrión contra incursión de materiales genéticos extraños, como los virus o plásmidos. En este sistema, se incorporan piezas de invasión de ADN extraño, llamado "protospacers" en un locus CRISPR, que se transcribe y procesado por la maquinaria de proteínas-RNA en RNAs pequeño llamado crRNAs.
Los científicos están aprovechando la maquinaria CRISPR para propósitos de edición genómicas mediante el diseño de secuencias de crRNA-como guía, conocidas como "única guía" o sgRNA, que puede utilizarse para apuntar Cas9 para casi cualquier secuencia genética deseada en células de mamíferos, u otros sistemas de interés. La simple personalización del RNA secuencia CRISPR Cas9 sistema ofrece ventajas sobre genoma basados en proteína edición métodos como ZFNs y TALENs.
Ahora que has aprendido sobre los principios de la edición del genoma, vamos a revisar un protocolo típico de usar CRISPR para crear cambios genéticos específicos en células de mamíferos.
En primer lugar, se elige una localización genómica a editarse. Esta región debe ser corta, aproximadamente 20 pares de bases en tamaño y poseen un basepair 3 largo "protospacer adyacentes motivo" o "PAM" en su extremo 3′. El PAM se requiere para Cas9 reconocer y partirá a la región de ADN diana, y la secuencia exacta es específica para el organismo de origen de la Cas9 siendo utilizado. Una vez que un sitio ha sido identificado, se debe buscar contra la secuencia del genoma para que sitios similares no se encuentran en otros lugares en el genoma, y así no se editarán regiones genómicas de objetivo.
Para sintetizar la secuencia de la guía CRISPR, se generan dos oligonucleótidos, una idéntica y complementaria a la secuencia de destino. Secuencias adicionales se incluyen en sus extremos 5′ para compatibilidad con los vectores sgRNA. Estos oligonucleótidos son luego mezclados, desnaturalizados y luego recocidos.
A continuación, un plásmido que contiene un sgRNA "andamio" corte con la enzima de restricción apropiada, con la secuencia de guía CRISPR sintetizada y se incubaron con la enzima ligasa para crear la construcción sgRNA. El plásmido se puede transforma en bacterias y cultivado para la amplificación. Una vez purificado de las bacterias, el constructo CRISPR es co transfected con un constructo Cas9 de codificación en las células cuyo genoma debe ser editado. Estas células transfected se cultivan para formar colonias clonales.
ADN genómico puede ser aislado de cada colonia y analizado por PCR o secuenciación para detectar aquellos en los que el sistema CRISPR ha producido las mutaciones deseadas.
Ahora veamos algunas maneras que los científicos están utilizando técnicas de edición del genoma.
Muchos investigadores utilizan genoma de edición para introducir secuencias de reportero en loci específicos. En este experimento, se utilizaron ZFNs insertar proteína verde fluorescente en un gen que está implicado en la supervivencia y el desarrollo de la neurona. Los investigadores confirmaron que estaban orientadas correctamente este gen dirigir las células madre a diferenciarse en neuronas, y realizando doble inmunofluorescencia para GFP y marcadores neuronales.
La edición del genoma también ha hecho mucho más fácil de generar organismos de "knockout" en la que un gen de interés se representa no funcional. Aquí, los investigadores intentaron crear ratones knockout inyectando embriones con el mRNA TALENs dirigidos a genes específicos de codificación. Tratamiento subsecuente endonucleasa de ADN de los ratones tratados con TALEN permitió que los investigadores a identificar a los animales con mutaciones en ambas copias del gen objetivo.
Por último, la edición del genoma se puede utilizar para crear grandes deleciones genéticas haciendo dos roturas de doble cadena en la misma región cromosómica. Estas deleciones grandes pueden ser necesarios cuando la función de un gen o elemento genético no puede ser noqueada por pequeñas canceladuras creadas con genoma convencional edición de protocolos. Aquí, los investigadores co-electroporated ratón las células cancerosas con un GFP construcción y dos CRISPR construye dirigidos a diferentes áreas dentro de un gen de cáncer de conducción. Células fueron transfectadas con éxito, que así se emiten señal GFP, fueron aisladas por celular activado por fluorescencia, clasificación y posterior PCR y células identificada la secuencia en la que se eliminó la región de DNA entre los dos sitios dirigidos a CRISPR.
Sólo has visto video de Zeus en la edición del genoma. Aquí, hemos analizado los principios ZFNs, TALENs, y CRISPR, exploraron un protocolo general de Cas9 CRISPR y discute cómo los investigadores están usando genoma técnicas de edición hoy. ¡Como siempre, gracias por ver!
