En primer lugar, agradecemos sinceramente a las madres que participaron en este proyecto. A continuación, reconocemos todo el personal que asistió y facilitó el procedimiento de muestreo, el Anestesiólogo, la enfermera anestesióloga y las enfermeras quirúrgicas. El proyecto no habría sido posible sin el financiamiento de la Autoridad Regional de Salud de la Región Sudoriental de Noruega y de la Unidad Asesora Noruego de Salud de la Mujer, la Universidad de Oslo y el financiamiento local proporcionado por el Hospital Universitario de Oslo.

El estudio fue aprobado por los funcionarios de protección de datos del Hospital Universitario de Oslo y del Comité Regional de Ética en Investigación Médica y Sanitaria del sur de Noruega 2419/2011. Todos los participantes firmaron un consentimiento informado por escrito en la inclusión. 1. Preparaciones NOTA: En la Figura 1 se describe un cronograma para los procedimientos. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" /> Figura 1 : Diagrama de flujo que describe el tiempo y el personal involucrado en el procedimiento de muestreo de 4 vasos. Un color representa a una persona. La descripción detallada del método se da en el protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Personal <ol><lI&gt; Asegúrese de que todo el personal necesario esté disponible: un especialista en Medicina Fetal altamente cualificado que realiza las mediciones de ultrasonido, dos obstetras que realizan la cirugía, uno de los obstetras y dos enfermeras que recogen las muestras, un asistente que Otras muestras consecutivas e inmediatamente después de la recolección. NOTA: En casos de recolección más avanzada de tejido placentario, se requiere una persona adicional. </li></ol></li><li> Equipo <ol><li> Preparar el equipo, 50 ml de solución salina tamponada con fosfato 1 M (PBS) helada, 25 ml de solución estabilizadora de ARN frío y 5 x 0,5 ml de compuesto óptimo de temperatura de corte (OCT). Etiquete los vacutainers y los tubos. Ver lista tentativa de equipos. </li></ol></li></ol> 2. Características maternas <ol><li> Registre las características clínicas y no clínicas maternas en la inclusión y repita las preguntas pertinentes y yoPeso, en el momento de la entrega. Anote la duración del período de ayuno antes de la cesárea y cualquier episodio hipotensivo que ocurra durante la cirugía. Nota: Incluya el conjunto de datos clínicos maternos mínimos reportados en una publicación reciente de Global Labour Pregnancy CoLaboratory (COLAB). Este artículo también incluye algunos aspectos muy importantes en la elección de las poblaciones de estudio y debe ser abordado durante la planificación del estudio [ 18] . </li><li> Considere la posibilidad de registrar características paternales, incluyendo etnicidad, edad e índice de masa corporal (IMC). </li></ol> 3. Ultrasonido <ol><li> Realizar el examen de ultrasonido Doppler el día del parto, con las mujeres en estado de ayuno. Realizar el examen durante un período de reposo fetal, con la mujer en posición semi-supina, inclinada ligeramente lateralmente opuesta a la región de interés para evitar la compresión de la aorta y la vena cava. Supervisar la salida enTensión por los índices mecánicos y térmicos en la pantalla. </li><li> Vena umbilical <ol><li> Visualice la vena umbilical en una transección sagital u oblicua del abdomen fetal. Mida el diámetro interno del vaso en la porción recta de la vena umbilical intraabdominal, antes de cualquier rama visible. Utilice el modo B normal y visualice el vaso en un ángulo de insonación perpendicular para las mediciones de diámetro y mantenga varios marcos óptimos para mediciones posteriores para minimizar el efecto de los cambios de diámetro pulsátil. <ol><li> Repetir las mediciones de cinco a diez veces 19 . </li></ol></li><li> En el mismo sitio, use ultrasonido Doppler y ajuste la sonda para obtener un ángulo de insonación lo más bajo posible (siempre &lt;30 °) para medir la velocidad máxima programada en el tiempo (TAMX). Obtener la velocidad durante un período de 3 - 5 s (flujo no pulsante). </li></ol></li><li> Arteria uterina <ol><li> Utilizar DopplerUltrasonido para visualizar la arteria uterina al cruzar la arteria ilíaca externa, inmediatamente después de que se ramifica desde la arteria ilíaca interna. Ajuste la sonda en este sitio para obtener un ángulo de insonación bajo (siempre &lt;30 °) y mida el TAMX. Obtener la velocidad como la velocidad media de tres ciclos del corazón. </li><li> Como es poco probable que obtenga un ángulo perpendicular en el mismo sitio en que se mide TAMX, siga el vaso distalmente para obtener un ángulo correcto para las mediciones de diámetro tan cerca de los sitios de las mediciones de diámetro como sea posible. Excluya las mediciones de diámetro si algún vaso visible se ramifica antes de este sitio, evaluado por ecografía Doppler color. <ol><li> Utilice el modo B normal y visualice el vaso en un ángulo de insonación perpendicular para las mediciones de diámetro y mantenga varios marcos óptimos para mediciones posteriores para minimizar el efecto de los cambios de diámetro pulsátil. </li><li> Repetir las mediciones de cinco a diez veces 19 . </li></ol></<html> Li </ol></li><li> Observe la posición de la placenta. </li></ol> 4. Muestreo de sangre de 4 vasos NOTA: La línea de tiempo para los procedimientos se describe en la Figura 1 y en la Figura 2 se ilustra un resumen de las muestras. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" /> Figura 2 : Ilustración esquemática de la vasculatura placentaria y los sitios de muestreo. En el método de muestreo de 4 vasos se extraen muestras de sangre de la vena uterina, la arteria radial (como un sustituto de la arteria uterina) y las arterias y venas umbilicales. El flujo sanguíneo en la arteria uterina y la vena umbilical se mide por ultrasonido. Se recogen muestras de tejidos de la placenta. Ilustración: Øystein H. Horgmo, Universidad de Oslo.5847fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <ol><li> Procedimientos de seguridad <ol><li> Proporcionar a todo el personal en el teatro de operaciones con guantes, trajes quirúrgicos, máscaras y sombreros. </li><li> Proporcionar a los cirujanos y personal de investigación en contacto con el campo de la operación con trajes quirúrgicos de fregado, máscaras, headwear, batas y guantes dobles. Las gafas son opcionales. </li><li> Proporcionar al personal que manipula las muestras de sangre con guantes. </li><li> Proporcionar al personal que maneja las muestras de placenta con guantes y máscara quirúrgica. La homogeneización requiere el uso de campanas. </li></ol></li><li> Preparación en el teatro de operaciones <ol><li> Dar un briefing y entregar el equipo a todo el personal que ayudará al muestreo antes del inicio de la cirugía. </li><li> Dirigirse al anestesiólogo ya la enfermera de anestesiología que le ayudarán con el necesario acceso arterial y venoso periférico y asegurar queNo se administran líquidos por vía intravenosa antes del muestreo. </li><li> Administre tres jeringas (10 ml) sin agujas a la persona que asiste con la muestra de vena antecubital y dos jeringas (una de 20 ml y una de 10 ml) y una jeringa de gas de sangre (con heparina) a la persona que asiste con la arteria radial. </li><li> Prepare dos jeringuillas estériles (20 ml), cinco jeringas estériles (10 ml), tres &quot;agujas de mariposa&quot; y dos jeringas de gas en sangre para el campo de operación. </li></ol></li><li> Acceso a los vasos sanguíneos. <ol><li> Siga el procedimiento estándar antes de la cesárea para asegurar el acceso intravenoso periférico (iv). NOTA: La vena antecubital es preferible porque es más fácil extraer muestras de este sitio. </li><li> Localizar la arteria radial en la muñeca por ultrasonido o por palpación. Después de 0,5 ml de analgesia subcutánea de lidocaína, coloque una línea arterial en la arteria radial. Abandone el muestreo de este sitio en caso de tres inserciones fallidas, oSi la mujer experimenta dolor durante la inserción. NOTA: Realizar el procedimiento quirúrgico de la cesárea según el procedimiento estándar. Sólo los ajustes necesarios para el procedimiento de muestreo se subrayan a continuación. </li></ol></li><li> Muestras de sangre materna NOTA: Obtenga las tres muestras de sangre materna (vena uterina, arteria radial y vena antecubital) simultáneamente antes de la incisión uterina. <ol><li> Para la vena uterina, después de abrir la cavidad abdominal, use un retractor para levantar la pared abdominal y exponer las ramas principales de las venas uterinas en los lados anterolaterales del útero. Obtenga sangre de las ramas de la vena uterina en el mismo lado que la placenta siempre que sea posible o use el plexo venoso más prominente si la placenta se encuentra en la línea media uterina. <ol><li> Inserte una aguja de mariposa en una jeringa de gas en la vena uterina en un ángulo de aproximadamente 30 grados y recoger sangre a través de la aspiración suave para evitarHemólisis Mientras asegura cuidadosamente la posición iv de la aguja de mariposa, reemplace la jeringa de gas de sangre llena por una jeringuilla de 20 ml y una de 10 ml consecutivamente. NOTA: El mejor acceso se garantiza cuando se está de pie sobre el lado contralateral de la vena uterina elegida. </li></ol></li><li> Para la arteria radial, aspirar desde la línea intraarterial. Deseche los primeros 5 mL, y luego aspirar 3 mL en jeringa de heparina para análisis de gas en sangre, seguido de 3 mL en dos jeringas (20 + 10 mL). </li><li> Para la vena antecubital, aspirar suavemente del catéter intravenoso. Deseche los primeros 5 mL, y luego aspirar 30 mL en tres jeringas (10 mL). </li><li> Realizar una inspección final del sitio de muestreo en la vena uterina antes de comenzar a cerrar el abdomen. </li></ol></li><li> Muestras de sangre fetal <ol><li> Cuando el niño nace, aspire inmediatamente la sangre de la arteria umbilical, sin apretar el cordón umbilical ni entregar la placenta. Empezar ingenioH la jeringa para el análisis de gas en sangre, y siga con tres jeringas de 10 ml si es posible. </li><li> Cuando las muestras arteriales estén aseguradas, sujete el cordón y entregue al niño a la partera antes de tomar muestras de la vena umbilical (gas en sangre y jeringas de 20 + 10 ml). NOTA: Obtenga todas las muestras umbilicales dentro de los segundos del parto y con la placenta in situ a menos que se haya separado espontáneamente. </li><li> Siga las recomendaciones de Noruega sobre el pinzamiento tardío del cordón umbilical. En caso de un niño en dificultades, abrazadera y cortar el cordón inmediatamente y la mano del niño a la partera y neonatólogo. </li></ol></li><li> Manejo de muestras de sangre <ol><li> Coloque las jeringas de gas en el hielo mientras prepara el resto de las muestras de sangre, y analizarlas en un analizador de gases en 5 minutos. </li><li> Transferir las muestras de sangre inmediatamente a vacutainers y colocar los tubos de plasma en un balancín de 1 - 2 min antes de ponerlos en el hielo. Dejar los tubos de suero en la mano de obraAtory banco para resolver durante 30 minutos. NOTA: Este es un paso crítico en el procedimiento que necesita atención adicional porque las muestras de los cinco sitios deben prepararse simultáneamente para asegurar una buena calidad. </li><li> Centrifugar las muestras de plasma lo antes posible, y en 30 minutos, a 6 ° C, 2.500 xg durante 20 min. </li><li> Después de 30 min, centrifugar las muestras de suero a temperatura ambiente durante 10 min a 2.500 x g. </li><li> Alícuota de los sobrenadantes cuidadosamente a 2 ml de tubos cryo, dejando 0,5 ml del sobrenadante por encima del pellet para asegurar plasma libre de plaquetas. </li><li> Almacenar las muestras a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Recolección de tejido placentario <ol><li> Coloque la placenta plana sobre una bandeja de disección enfriada con hielo lo más pronto posible después de haber sido entregada. Fotografíe y mida el diámetro más largo y el diámetro a 90 grados. </li><li> Pesar la placenta. </li><li> Registre el peso, los dos diámetros, cualquier gRoss patología, el número de vasos en el cordón y el intervalo de tiempo desde la entrega a la placenta se colocó en hielo. NOTA: Envíe la placenta al examen patológico si está clínicamente indicado. </li><li> Colocar la placenta con la superficie materna hacia arriba e identificar 4 - 5 sitios de muestreo situados aleatoriamente en cada cuadrante de la placenta, evitando áreas de patología franca. Retire la decidua con unas tijeras para cortar a 3 - 5 mm de la superficie materna. Recoger un pedazo de 1 - 2 cm 3 de tejido villoso de cada sitio. </li><li> Lave el tejido recolectado suavemente en 50 mL de PBS 1M frío. Divida en varias piezas de cada sitio de muestreo y alícuota. Nota: El tamaño de las piezas de placenta dependerá de los análisis planificados. </li><li> Añadir alícuotas de 0,1 - 0,5 cm 3 muestras de tejido a 5 tubos cryo y congelación rápida en nitrógeno líquido. </li><li> Añadir pequeños trozos de 0,1 - 0,2 cm 3 al tubo con 25 ml de solución de estabilización de ARN. Tienda a las 46; C durante 24 h, desechar la solución de estabilización de ARN y reemplazarla. Congelar. </li><li> Añadir trozos de 0,5 cm 3 a los 5 tubos cryo con 0,5 mL de OCT, rellenar con OCT, mezclar y congelar. </li><li> Almacene las muestras a -80 ° C hasta su análisis. NOTA: Burton et al. Proporciona una excelente visión general de los aspectos prácticos del muestreo placentario en función de los análisis previstos. 20 considerar para preparar el tejido restante para el aislamiento de las membranas de microvellosidades y basal, y para recoger el tejido decidual por la técnica de succión de vacío. 21 , 22 </li></ol> 6. Características Neonatales <ol><li> Anote las características neonatales, incluyendo Apgar-score (1, 5 y 10 min), sexo, peso, longitud, edad gestacional y admisión a la Unidad de Cuidados Intensivos de Recién Nacidos (duración y resultado de la estancia). </li><li> Considere la posibilidad de medir la composición corporal neonatal mediante medidas antropométricas, desplazamiento de airePletismógrafo o doble absorciometría de rayos X. 23 , 24 </li></ol> 7. Cálculos <ol><li> Suponga una composición sanguínea similar en la arteria radial y uterina y calcule la diferencia de concentración arteriovenosa uteroplacentaria. Diferencia de la concentración arteriovenosa uteroplacentaria = C A - C V Diferencia de la diferencia venoso - arterial umbilical = C v - C a Donde C es concentración con subíndices: A, la arteria radial; V, la vena uterina; V la vena umbilical y a, la arteria umbilical. </li><li> Calcular el volumen de flujo sanguíneo, ml / min (Q): <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" /> Donde D es el diámetro del recipiente (cm), TAMX es la velocidad máxima promediada en el tiempo y h es el coeficiente para el perfil espacial de la velocidad de la sangre. Utilizar 0,5 como coeficiente para la vena umbilical y0,6 para la arteria uterina 25 , 26 . </li><li> Calcular la captación y liberación placentaria según el principio de Fick: Captación uteroplacentaria = ( C A - C V ) x Qm Captación fetal = ( C v - C a ) X Q f Subíndices: m, materna y f, fetal. </li></ol>

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C., Meschia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+effect+on+fetal+glucose+utilization.">Insulin effect on fetal glucose utilization.</a> Pediatr Res. 12 (2), 90-92 (1978).</li><li>Bujold, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+supporting+that+the+excess+of+the+sVEGFR-1+concentration+in+maternal+plasma+in+preeclampsia+has+a+uterine+origin.">Evidence supporting that the excess of the sVEGFR-1 concentration in maternal plasma in preeclampsia has a uterine origin.</a> J Matern Fetal Neonatal Med. 18 (1), 9-16 (2005).</li><li>Jansson, T., Aye, I. L., Goberdhan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+mTORC1+signaling+in+placental+nutrient-sensing.">The emerging role of mTORC1 signaling in placental nutrient-sensing.</a> Placenta. 33, 23-29 (2012).</li><li>Cetin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+transport+of+amino+acids+in+normal+and+growth-restricted+pregnancies.">Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, 50-54 (2003).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> El método de muestreo de 4 vasos de placenta es relevante para tres propósitos principales. En primer lugar, puede utilizarse para estudiar cómo las sustancias específicas son absorbidas por la placenta en el lado materno y posiblemente transferidas a la circulación umbilical y al feto, como lo demuestran nuestros estudios sobre glucosa y aminoácidos. En segundo lugar, el método es altamente relevante para estudiar las sustancias producidas por la placenta y liberadas a las circulaciones materna o fetal, co...

Según los Institutos Nacionales de Salud, Estados Unidos, la placenta es el órgano menos comprendido en el cuerpo humano 1 , 2 , 3 . Es difícil acceder y estudiar la placenta humana in vivo sin imponer riesgos no éticos en el embarazo en curso. Los estudios de la función placentaria en humanos se basan en gran medida en modelos in vitro y ex vivo . La mayoría de los estudios previos in vivo del transporte placentario y del metabolismo se han realizado en animales 4 , 5 , 6 . Sin embargo, como la estructura y las funciones de la placenta varían considerablemente entre las especies, la extrapolación de los resultados de los animales a los seres humanos debe hacerse con precaución. Sólo unos cuantos estudios humanos in vivo más pequeños han investigado la captación y el transporte fetal y placentario bajo condiciones fisiológicas normalesY ninguno ha explorado la transferencia integrada de varios compuestos 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Estos estudios fundamentales ilustran que los estudios in vivo de la placenta humana son factibles y que pueden servir a varios propósitos. En primer lugar, los conceptos actuales de las funciones placentarias derivadas principalmente de estudios in vitro , ex vivo y en animales pueden ser probados en un entorno humano y, por lo tanto, proporcionar una visión nueva y más específica de la placenta humana. En segundo lugar, se pueden caracterizar mejor las propiedades de la placenta disfuncional asociada con el crecimiento fetal aberrante, la preeclampsia, la diabetes materna, el síndrome metabólico y otras alteraciones metabólicas maternas. En tercer lugar, los estudios humanos in vivo ofrecen la oportunidad deTicas y predictivas de la función placentaria. En este contexto nos propusimos establecer una colección completa de datos fisiológicos para investigar la función placentaria humana in vivo. Durante una cesárea planificada, explotamos el acceso intraabdominal a la vena uterina para recolectar muestras de sangre de los vasos entrantes y salientes en los lados materno y fetal de la placenta (el método de muestreo de 4 vasos). Estas muestras se utilizan para calcular las diferencias de la concentración arteriovenosa pareada de nutrientes y otras sustancias [ 14] . Además, medimos el flujo sanguíneo de volumen a ambos lados de la placenta por ultrasonido. En consecuencia, la cuantificación de la absorción placentaria y fetal de cualquier compuesto puede ser cuantificada. Además, es posible determinar las sustancias liberadas por la placenta a las circulaciones materna y fetal 15 , 16 , 17 . Cuando combineD con los parámetros clínicos de la madre y el niño, y análisis de placenta y otros tejidos relevantes, este método tiene el potencial emocionante para integrar muchos aspectos de las funciones placentarias in vivo en el mismo par madre-feto.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Maternal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impedance scale</td><td>Tanita</td><td></td><td>or similar</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ultrasound measurements&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512 ultrasound machine</td><td>Acuson</td><td></td><td>equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Blood samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arerial cannula</td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>or similar</td></tr><tr><td>20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>or similar. 3 needed.</td></tr><tr><td>10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>or similar. 9 needed.</td></tr><tr><td>5 cc 6% Luer Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>or similar. 2 needed.</td></tr><tr><td>Arterial blood gas syringe&amp;nbsp;</td><td>Radiometer Medical</td><td></td><td>or similar. 4 needed.</td></tr><tr><td>Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td><td>(intended for single use).3 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL EDTA&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>or similar. Label with sample site. 10 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 3 mL&amp;nbsp; 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed.</td></tr><tr><td>Marked trays to transport the syringes</td><td></td><td></td><td>to transport the blood samples in the operation theatre</td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td>for gentle mixing of the samples</td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Placenta samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal ruler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>or similar. Dilute 10 M to&amp;nbsp; 1 M before use</td></tr><tr><td>RNA stabilization solution</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&amp;nbsp;</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>vwr</td><td>361603E</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>or similar. Label with &quot;RNA later&quot;, sample site and ID. 2 needed.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fetal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Measuring tape</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the 4-vessel sampling approach to integrative studies of human placental physiology in vivo

La placenta humana es altamente inaccesible para la investigación mientras todavía en el útero . Por lo tanto, la comprensión actual de la fisiología placentaria humana in vivo se basa en gran medida en estudios con animales, a pesar de la alta diversidad entre las especies en anatomía placentaria, hemodinámica y duración del embarazo. La gran mayoría de los estudios de placenta humana son estudios de perfusión ex vivo o estudios de trofoblastos in vitro . Aunque los estudios in vitro y los modelos animales son esenciales, la extrapolación de los resultados de tales estudios a la placenta humana in vivo es incierta. Nuestro objetivo es estudiar la fisiología de la placenta humana in vivo a término, y presentar un protocolo detallado del método. Aprovechando el acceso intraabdominal a la vena uterina justo antes de la incisión uterina durante la cesárea planificada, recolectamos muestras de sangre de los vasos entrantes y salientes en los lados materno y fetal de la placenta. Cuando se combina conCentración de las muestras de sangre con el volumen de las mediciones de flujo sanguíneo, somos capaces de cuantificar la absorción placentaria y fetal y la liberación de cualquier compuesto. Además, las muestras de tejido placentario de los mismos pares madre-feto pueden proporcionar mediciones de la densidad y actividad del transportador y otros aspectos de las funciones placentarias in vivo . A través de este uso integrador del método de muestreo de 4 vasos podemos probar algunos de los conceptos actuales de transferencia de nutrientes placentarios y metabolismo in vivo , tanto en embarazos normales como patológicos. Además, este método permite la identificación de sustancias secretadas por la placenta a la circulación materna, lo que podría ser una importante contribución a la búsqueda de biomarcadores de disfunción placentaria.

El método de muestreo de 4 vasos es aplicable en la práctica clínica y hemos obtenido con éxito muestras de sangre de 209 pares madre / bebé. En 128 de estos también se logró medir el volumen de flujo sanguíneo. Se obtuvieron muestreos completos de 4 recipientes y mediciones de flujo de buena calidad de ambos vasos maternos y fetales en 70 pares madre-feto ( Figura 3 ). Además, hasta ahora hemos recogido sangre y muestras de placenta de 30 pacientes...

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The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Presentamos un método detallado para estudiar la fisiología placentaria humana in vivo a término. El método combina el muestreo de sangre de los vasos entrantes y salientes en los lados materno y fetal de la placenta con medidas de ultrasonido del volumen de flujo sanguíneo y el muestreo de tejido placentario.

El Método de Muestreo de 4 Barcos para Estudios Integrativos de la Fisiología Placentaria Humana<em&gt; In Vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

10.5K vistas.  Oslo University Hospital.  Presentamos un método detallado para estudiar la fisiología placentaria humana in vivo a término. El método combina el muestreo de sangre de los vasos entrantes y salientes en los lados materno y fetal de la placenta con medidas de ultrasonido del volumen de flujo sanguíneo y el muestreo de tejido placentario. 

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Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC twin pregnancies develop complications arising from the shared placenta and associated vascular connections1. Severe twin-to-twin syndrome (TTTS) is reported to account for approximately 20% of these complications2,3. Inter-twin vascular connections occur in almost all MC placentas and are related to the prognosis and outcome of these high-risk twin pregnancies. The number, size and type of connections have been implicated in the development of TTTS and other MC twin conditions. Three types of inter-twin vascular connections occur: 1) artery to vein connections (AVs) in which a branch artery carrying deoxygenated blood from one twin courses along the fetal surface of the placenta and dives into a placental cotyledon. Blood flows via a deep intraparenchymal capillary network into a draining vein that emerges at the fetal surface of the placenta and brings oxygenated blood toward the other twin. There is unidirectional flow from the twin supplying the afferent artery toward the twin receiving the efferent vein; 2) artery to artery connections (AAs) in which a branch artery from each twin meets directly on the superficial placental surface resulting in a vessel with pulsatile bidirectional flow, and 3) vein to vein connections (VVs) in which a branch vein from each twin meets directly on the superficial placental surface allowing low pressure bidirectional flow. In utero obstetric sonography with targeted Doppler interrogation has been used to identify the presence of AV and AA connections4. Prenatally detected AAs that have been confirmed by postnatal placental injection studies have been shown to be associated with an improved prognosis for both twins5. Furthermore, fetoscopic laser ablation of inter-twin vascular connections on the fetal surface of the shared placenta is now the preferred treatment for early, severe TTTS. 
Postnatal placental injection studies provide a valuable method to confirm the accuracy of prenatal Doppler ultrasound findings and the efficacy of fetal laser therapy6. Using colored dyes separately hand-injected into the arterial and venous circulations of each twin, the technique highlights and delineates AVs, AAs, and VVs. This definitive demonstration of MC placental vascular anatomy may then be correlated with Doppler ultrasound findings and neonatal outcome to enhance our understanding of the pathophysiology of MC twinning and its sequelae. Here we demonstrate our placental injection technique.

Vascular mapping of monochorionic (MC) twin placentas after birth provides a means for detailed demonstration of vascular connections between the twins&#x2019; circulations. 
Imbalance of these connections is thought to play a pivotal role in the development of complications of MC twinning including twin-to-twin transfusion syndrome.

Guía de alambre cateterismo asistida y de inyección de tinte de color de mapa vascular de Monocoriónico placentas Gemelas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Investigación

Medicina

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biología

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo perfusión placentaria humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Bioingeniería

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Biología del Desarrollo

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Ex vivo perfusion de la placenta de roedores

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Inmunología e Infección

Mejora del cultivo de explantes placentarios ex vivo mediante un enfoque basado en el flujo

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

Autor destacado: Avance de la investigación a través de la secuenciación de células individuales y la histología espacial en tejidos placentarios 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

El Método de Muestreo de 4 Barcos para Estudios Integrativos de la Fisiología Placentaria Humana

Resumen

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