Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Pekín Unión médica Colegio juventud fondos y los fondos de Investigación Fundamental para las universidades Central (Grant no. 3332015200).

Todos los experimentos en animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices pertinentes, regulaciones y agencias reguladoras. El presente Protocolo se demostró fue realizado bajo la dirección y aprobación de la Instituto de microcirculación Animal ética Comité (IMAEC) en el colegio médico Unión de Pekín (PUMC).
1. los animales
<ol><li>Antes del inicio del experimento, mantener tres ratones BALB/c por jaula, con temperatura controlada (24 ± 1 ° C) y humedad (55 ± 5%), en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Permitir que los ratones libre acceso a agua y comida regular.</li>
	<li>Dividir los ratones, al azar, un grupo de no diabéticas control y un grupo diabético. Con precisión pesan cada ratón individual y calcular el volumen de inyección utilizando la masa corporal de cada ratón.</li>
	<li>Rápidamente los ratones durante 4 horas antes de la inyección del streptozotocin (STZ) y proporcionar agua normal como normal experimental día 1.</li>
	<li>Preparación de buffer de citrato de sodio de 0.1 M a pH 4.3. Poner 1 mL de la solución en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y envuelva el tubo de microcentrífuga en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.</li>
	<li>Disolver el STZ en tampón de citrato de sodio (pH 4.3) a una concentración final de trabajo de 5 mg/mL antes de su uso.</li>
	<li>Dar a los ratones de las inyecciones intraperitoneales de grupo diabético de STZ a dosis de 40 mg/kg utilizando una jeringa de 1 mL y una aguja de 25 G. Inyectar a los ratones del control no diabético con el mismo volumen de buffer de citrato de sodio (pH 4.3).</li>
	<li>Vuelva a colocar los ratones en las jaulas y proporcionarles alimento regular y 10% en agua y sacarosa.</li>
	<li>Repita los pasos 1.3-1.7 días experimentales 2 a 5 (es decir, el próximo 4 días consecutivos).</li>
	<li>Reemplazar el agua de 10% de sacarosa con agua corriente después de la última inyección de STZ.</li>
	<li>Rápidamente los ratones por 6 horas, pero les da libre acceso al agua y mida sus niveles de glucosa en sangre nueve días más tarde (experimental 14). Recoger una muestra de sangre de la vena de la cola para confirmar hiperglucemia utilizando un sistema de monitoreo de glucosa de sangre. Nota: Ratones con sangre glucosa niveles > 200 mg / dL se consideran diabetes.</li>
</ol>2. preparación del instrumento
<ol><li>Limpie las superficies ópticas de la punta de prueba y conector de la sonda del aparato Doppler laser con un paño suave no abrasivo para eliminar polvo o partículas. Enchufe el cable en el puerto del instrumento (figura 1A).</li>
	<li>Montar el soporte de calibración permitiendo el flujo estándar de estar en equilibrio térmico con un entorno experimental (temperatura ambiente, generalmente por 30 min). Agite el flujo estándar suavemente durante 10 s y deje descansar por 2 minutos.</li>
	<li>Coloque el contenedor estándar de flujo en medio de la base de calibración. Ajuste la abrazadera a la altura máxima y fije la sonda en la abrazadera que apunta hacia abajo en el contenedor. Asegúrese de que el estándar de flujo está correctamente colocado debajo de la sonda.</li>
	<li>Lentamente mueva la sonda hacia abajo hasta que la punta esté correctamente sumergida en el estándar de flujo. Seleccione y presione "calibración" en el laser Doppler aparato y elegir el canal de trabajo que la sonda está conectada a. Ejecute el programa de calibración hasta que aparezca un aviso de "Calibración exitosa" en la pantalla del laser Doppler aparato.</li>
	<li>Asegure la sonda con los titulares de la sonda. Asegure manualmente la sonda para evitar el movimiento.</li>
	<li>Mantener la sala experimental a temperatura constante (24 ± 1 ° C) y humedad (~ 50-60%).</li>
	<li>Apague cualquier luz externa (por ejemplo, lámparas fluorescentes y punto) antes de realizar el experimento para evitar el cambio inducido por la luz externo.</li>
</ol>3. preparación de los animales
<ol><li>Autoclave el quirúrgico instrumentos y déjelos enfriar a temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Dar a los ratones 10 min para aclimatarse al ambiente experimental antes de detectar AMPc microvascular islote pancreático por láser Doppler.</li>
	<li>Llene una jeringa de 1 mL con 1 mL de pentobarbital sódico de 3%. Inyecte la solución de pentobarbital sódico (75 mg/kg i.p.) para anestesiar los ratones.</li>
	<li>Cubrir los ojos del ratón con una gasa médica previamente humedecido para evitar la sequedad.</li>
	<li>Asegúrese de que el ratón pierde totalmente la conciencia y ya no responde a la cola o retropié pellizca con fórceps. Monitor de la anestesia durante todo el evento anestésico e intraoperatoria cada 15 minutos mantener la anestesia complementando con el 10% del volumen inicial de la inyección de la solución de pentobarbital cuando sea necesario.</li>
	<li>Coloque una almohadilla de calefacción con una capa de semi aislamiento debajo del animal y colocar el animal en posición supina y traslado a la estación de trabajo del laser Doppler aparato. Fijar el ratón a la plataforma de trabajo con cinta quirúrgica.</li>
	<li>Torunda la piel abdominal de ratón con betadine y luego el etanol del 75% se utiliza para limpiar la zona abdominal limpia.</li>
	<li>Inyectar por vía subcutánea 2% lidocaine/0.5% bupivacaína mezcla (50/50).  Cortar un ~ 3 cm-orificio de diámetro en el centro de una esponja de Gasa. Cubren la región abdominal con la esponja de la gasa.</li>
	<li>Levante la piel abdominal con pinzas y hacer una incisión vertical inicial a lo largo de la línea media del abdomen usando una tijera bisturí o la piel.</li>
	<li>Sujete el músculo subyacente con pinzas e incisión para entrar en la cavidad abdominal. No dañar cualquier órgano. Plegar la piel y el músculo subyacente del pecho a la cavidad abdominal. Exponer suavemente el cuerpo del páncreas y el bazo usando un par de pinzas de punta Roma.</li>
</ol>4. adquisición de datos para el análisis
<ol><li>Ejecutar el software del aparato Doppler láser haciendo clic en "Archivo" → "Nuevo" para crear un nuevo archivo de medición. Para configurar a los monitores conectados, en la pestaña "General", establecer la duración de vigilancia realizar "gratis." Utilizar los valores predeterminados de fábrica para la ficha de "Monitor LDF" haga clic en "Siguiente".</li>
	<li>Configurar la pantalla de gráfico en el "configuración cuadro de diálogo visualización." Seleccionar los canales de "Velocidad de flujo, Conc," marcando las respectivas casillas. Seleccione los siguientes parámetros: "Origen de datos para el canal" y "etiqueta, unidades y Color". Haga clic en "Siguiente".</li>
	<li>Ingrese la información del usuario sobre el tema y la medida (es decir, nombre y número de tema, operador, control de tiempo, comentarios, etc.) en el "cuadro de diálogo de información archivo" y haga clic en "Siguiente" para finalizar la configuración de medida. Nota: Una ventana de medición se crea automáticamente por el software (figura 1B).</li>
	<li>Avanzar manualmente el electrodo al páncreas. Asegúrese de que la distancia entre la sonda y páncreas tejido es dentro de 1 mm. Una distancia inadecuada da una lectura de flujo sanguíneo artificialmente aumentada o disminuida.</li>
	<li>Haga clic en el icono de barra de herramientas de "Inicio" para iniciar la grabación de los datos de unidades (PU) de perfusión microvascular de la sangre. Recoge los datos de PU continuamente durante 1 minuto cada. Haga clic en "Stop" para detener la medición. Seleccione "Archivo" → "Guardar como" nombre y guarde el archivo de medición final.</li>
	<li>Manualmente volver a colocar la sonda después de cada carrera para evitar efectos aditivos y el agotamiento localizado de contráctil y la capacidad de relajación. Repita los pasos 4.1-4.4 para cosechar datos de PU microvasculares múltiples puntos (es decir, tres puntos elegido al azar del tejido pancreático) para cada ratón. Medir los datos de la PU de una placa no reflexiva como un control de línea de base.</li>
	<li>Cerca de la capa del músculo abdominal y la capa de la piel con una sutura. Colocar los animales en jaulas limpias después de los experimentos.</li>
	<li>Mantener el animal caliente colocando la jaula de recuperación media-en la almohada. Nota: Preste atención al calor, higiene, fluido y consumo de alimentos y la infección. Administrar ratones con 2 mg/kg de carprofeno durante 48 h como tratamiento del dolor postoperatorio.  Realizar la eutanasia por inyección i.p. de pentobarbital sódico de 150 mg/kg cuando los ratones se observan en un estado de dolor o angustia que no puede ser aliviado.</li>
</ol>5. cálculo de los parámetros de AMPc Microvascular
<ol><li>Utilice el comando "Exportar" del laser Doppler software para exportar el tiempo y los datos primarios de PU como archivo *.xlsx y abra el archivo en una hoja de cálculo.</li>
	<li>Calcular la unidad de perfusión basal promedio (PUb) (véase el paso 4.6).</li>
	<li>Calcular el promedio perfusión de la sangre (PUuna) para 1 minuto de la medición como sigue: promedio de perfusión de la sangre (PUun) = PU - PUb (ecuación 1).</li>
	<li>Calcular la frecuencia (ciclos/min) para cada 1 minuto de medición. Nota: La frecuencia de AMPc microvascular se define como el número de picos que se produjeron en una ola de AMPc microvascular por minuto.</li>
	<li>Calcular la amplitud (ΔPU) para cada 1 minuto de medición.<ol>
<li>Calcular la amplitud de la vasomoción microvascular como la diferencia entre el máximo (PUmax) y mínimo (PUmin): amplitud (ΔPU) = PUmax - PUmin (ecuación 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular la velocidad relativa (PU) para cada 1 minuto de medición.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En los casos que implican la disfunción microvascular (p. ej., diabetes, pancreatitis aguda, enfermedades microvasculares periféricas, etcetera), algunas enfermedades llevan a la reducción del flujo sanguíneo. Aparte de cambios en el flujo de sangre, hay indicadores importantes, como el AMPc microvascular, que reflejan el estado funcional de la microcirculación. El indicador específico, AMPc microvascular, se define generalmente como la oscilación del tono microvascular en lechos microvasculares....

Como un parámetro del estado funcional de la microcirculación, AMPc microvascular asume la responsabilidad de la entrega y el intercambio de oxígeno, nutrientes y hormonas y es fundamental para la eliminación de productos metabólicos, tales como dióxido de carbono y residuos celulares 1. microvascular AMPc también regula la distribución del flujo sanguíneo y la perfusión del tejido, afectando microcirculatoria local de la presión arterial y respuestas a los inflamación, que puede inducir edema en muchas enfermedades. Por lo tanto, es extremadamente importante para mantener la función fisiológica de órganos2,3,4, tejidos y células componentes AMPc microvascular. La debilitación de la vasomoción microvascular podría ser uno de los pasos clave en el desarrollo de enfermedades relacionadas con la microcirculación5.
Láser Doppler fue inicialmente desarrollado para la observación y cuantificación en el ámbito de la microcirculación investigación6. Esta técnica, junto con otros enfoques técnicos (p. ej., láser de punto7, oxígeno transcutáneo, etcetera), ha sido considerada como el estándar de oro para evaluar el flujo sanguíneo en la microcirculación. La justificación que la perfusión de sangre de la microcirculación local (es decir, los capilares, arteriolas, vénulas, etc.) puede ser determinada por el aparato equipado con láser Doppler, se basa en el principio de Doppler shift. La longitud de onda y frecuencia de la emisión estimulada de luz cambian cuando partículas ligeras encuentran movimiento glóbulos en microvasos, o permanecen sin cambios. Por lo tanto, en la microcirculación, el número y la velocidad de las células sanguíneas son los factores claves relativos a la magnitud y la distribución de frecuencias de la luz cambió de puesto de Doppler, mientras que la dirección del flujo sanguíneo microvascular es irrelevante. Utilizando diferentes métodos, se han utilizado una variedad de tejidos para estudios micro circulatorio, incluyendo los entresijos y dorsal plicometro cámaras de ratones, ratas, hámsteres e incluso los seres humanos8. Sin embargo, en el protocolo actual, nos centramos en el funcional estado de AMPc microvascular del islote pancreático, que es evaluada usando láser Doppler y un sistema de parámetro de evaluación hecha en casa.
Microcirculación del islote pancreático se compone principalmente de microvasos del islote pancreático y exhibe características distintivas. Una red capilar de islote pancreático muestra una densidad cinco veces mayores que la red capilar de su contraparte exocrine9. Proporcionar un conducto para el suministro de entrada de la glucosa y la insulina difusión, células endoteliales del islote suministrar oxígeno a las células metabólicamente activas en islote las células β. Además, también emergentes evidencia demuestra que islote microvessels están involucrados no sólo en la regulación de la expresión de gene de la insulina y la supervivencia de la célula β, sino también en que afectan a la función de las células β; promover la proliferación de células β; y producir un número de crecimiento y angiogénicos sustancias vasoactivas, factores de10. Por lo tanto, en este sentido, se infiere que el estado funcional de islotes pancreáticos microvascular AMPc puede afectar la función de las células β del islote y conseguir implicado en la patogenia de enfermedades como la pancreatitis aguda, crónica, diabetes y otras enfermedades relacionadas con el páncreas.
Analizando los cambios patológicos del estado funcional del islote pancreático microvascular AMPc podría ser una estrategia factible para determinar las contribuciones de la microcirculación de islotes pancreáticos para las enfermedades antes mencionadas. Un procedimiento detallado paso a paso que describe el enfoque para determinar islotes pancreáticos AMPc microvascular en vivo ofrecen aquí. Las medidas típicas de entonces se muestran en los Resultados de representante. Finalmente, los beneficios y limitaciones del método se destacan en la discusión, junto con más aplicaciones.

<table><tbody><tr><td>MoorVMS-LDF2</td><td>Moor Instruments</td><td>GI80</td><td>PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data</td></tr><tr><td>MoorVMS-PC Software</td><td>Moor Instruments</td><td>GI80-1</td><td>Software of MoorVMS-LDF2</td></tr><tr><td>Calibration stand</td><td>Moor Instruments</td><td>GI-cal</td><td>Calibration tool</td></tr><tr><td>Calibration base</td><td>Moor Instruments</td><td>GI-cal</td><td>Calibration tool</td></tr><tr><td>Calibration flux standard</td><td>Moor Instruments</td><td>GI-cal</td><td>Calibration tool</td></tr><tr><td>One Touch UltraEasy glucometer</td><td>Johnson and Johnson</td><td>#1955685</td><td>Confirm hyperglycemia</td></tr><tr><td>One Touch UltraEasy strips</td><td>Johnson and Johnson</td><td>#1297006</td><td>Confirm hyperglycemia</td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0130</td><td>Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>Working concentration 3 %</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Inc.</td><td>200121</td><td>Working concentration 75 %</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Amresco</td><td>335</td><td>Working concentration 10 %</td></tr><tr><td>Medical gauze</td><td>China Health Materials Co.</td><td>S-7112</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Blunt-nose forceps</td><td>Shang Hai Surgical Instruments Inc.</td><td>N-551</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Surgical tapes</td><td>3M Company</td><td>3664CU</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Gauze sponge</td><td>Fu Kang Sen Medical Device CO.</td><td>BB5447</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Yu Lin Surgical Instruments Inc.</td><td>175C</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Skin scissor</td><td>Carent</td><td>255-17</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Suture</td><td>Ning Bo Surgical Instruments Inc.</td><td>3325-77</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Syringe and 25-G needle</td><td>MISAWA Inc.</td><td>3731-2011</td><td>Scale: 1 ml</td></tr></tbody></table>

laser doppler: a tool for measuring pancreatic islet microvascular vasomotion in vivo

Como un estado funcional de la microcirculación, AMPc microvascular es importante para el suministro de oxígeno y nutrientes y la eliminación de dióxido de carbono y productos de desecho. La debilitación de la vasomoción microvascular podría ser un paso crucial en el desarrollo de enfermedades relacionadas con la microcirculación. Además, los islotes pancreáticos altamente vascularizado está adaptado para apoyar la función endocrina. En este sentido, parece posible inferir que el estado funcional de islotes pancreáticos microvascular AMPc podría afectar la función de islotes pancreáticos. Analizar los cambios patológicos de la situación funcional de AMPc microvascular islote pancreático puede ser una estrategia factible para determinar las contribuciones que la microcirculación de islote pancreático hace relacionados con enfermedades, como diabetes mellitus, pancreatitis, etcetera. Por lo tanto, este protocolo describe el uso de un monitor de flujo de sangre Doppler de láser para determinar el estado funcional del islote pancreático AMPc microvascular y establecer los parámetros (incluida la perfusión de la sangre media, amplitud, frecuencia y relativa velocidad de AMPc microvascular del islote pancreático) para la evaluación del estado funcional microcirculación. En un modelo de ratón diabético inducida, observamos un estado funcional deterioro de AMPc microvascular del islote pancreático. En conclusión, este enfoque para la evaluación de islote pancreático AMPc microvascular en vivo puede revelar mecanismos relativos a las enfermedades del islote pancreático.

Una fotografía del láser de medición de AMPc microvascular Doppler aparato equipado con un diodo de láser de semiconductor se muestra en la figura 1A. Software de interfaz de usuario se presenta en la figura 1B. Usando el método mencionado anteriormente, los parámetros hemodinámicos de AMPc microvascular islote pancreático fueron detectados de ratones diabéticos y no diabéticos control. Una variedad de técnicas, incluy...

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Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Láser Doppler: Una herramienta para medir islote pancreático AMPc Microvascular en Vivo

Islote pancreático microvascular AMPc regula la distribución de sangre del islote y mantiene la función fisiológica de las células β del islote. Este protocolo describe el uso de un monitor Doppler láser para determinar el estado funcional del islote pancreático AMPc microvascular en vivo y para evaluar las contribuciones de la microcirculación de islotes pancreáticos para enfermedades relacionadas con el páncreas.

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

8.2K vistas.  Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College. Islote pancreático microvascular AMPc regula la distribución de sangre del islote y mantiene la función fisiológica de las células β del islote. Este protocolo describe el uso de un monitor Doppler láser para determinar el estado funcional del islote pancreático AMPc microvascular en vivo y para evaluar las contribuciones de la microcirculación de islotes pancreáticos para enfermedades relacionadas con el páncreas.

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Investigación

Medicina

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate postprandial delivery of nutrients and hormones to insulin-sensitive tissues. We here describe a technique for combining intravital microscopy (IVM) and contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) of the adductor compartment of the mouse hindlimb to simultaneously visualize muscle resistance arteries and perfusion of the microcirculation in vivo. Simultaneously assessing insulin's effect at multiple levels of the vascular tree is important to study relationships between insulin's multiple vasoactive effects and muscle perfusion. Experiments in this study were performed in mice. First, the tail vein cannula is inserted for the infusion of anesthesia, vasoactive compounds and ultrasound contrast agent (lipid-encapsulated microbubbles). Second, a small incision is made in the groin area to expose the arterial tree of the adductor muscle compartment. The ultrasound probe is then positioned at the contralateral upper hindlimb to view the muscles in cross-section. To assess baseline parameters, the arterial diameter is assessed and microbubbles are subsequently infused at a constant rate to estimate muscle blood flow and microvascular blood volume (MBV). When applied before and during a hyperinsulinemic-euglycemic clamp, combined IVM and CEUS allow assessment of insulin-induced changes of arterial diameter, microvascular muscle perfusion and whole-body insulin sensitivity. Moreover, the temporal relationship between responses of the microcirculation and the resistance arteries to insulin can be quantified. It is also possible to follow-up the mice longitudinally in time, making it a valuable tool to study changes in vascular and whole-body insulin sensitivity.

Insulin-induced vasodilation regulates muscle perfusion and increases the microvascular surface area (microvascular recruitment) available for solute exchange between blood and tissue interstitium. Combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography is presented to simultaneously assess insulin&#39;s action at the larger vessels and the microcirculation in vivo.

Combina la microscopia Intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biología

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Inmunología e Infección

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is a common, noninvasive, repeatable method for assessing blood flow recovery. The technique calculates overall blood flow in the sampled tissue from the Doppler shift in frequency caused when a laser hits moving red blood cells. Measurements are expressed in arbitrary perfusion units, so the contralateral non-intervened upon leg is usually used to help control measurements. Measurement depth is in the range of 0.3-1 mm; for hindlimb ischemia, this means that dermal perfusion is assessed. Dermal perfusion is dependent on several factors&#8212;most importantly skin temperature and anesthetic agent, which must be carefully controlled to result in reliable readings. Furthermore, hair and skin pigmentation can alter the ability of the laser to either reach or penetrate to the dermis. This article demonstrates the technique of LDPI in the mouse hindlimb.

Here, we present a protocol that demonstrates the technique and necessary controls for Laser Doppler perfusion imaging to measure blood flow in the mouse hindlimb.

Imágenes de perfusión doppler láser en el hindlimb del ratón

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Investigación de nuevos mecanismos de disfunción microvascular en humanos

Intradermal Microdialysis: An Approach to Investigating Novel Mechanisms of Microvascular Dysfunction in Humans

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate mechanisms of vascular smooth muscle and endothelial function in the cutaneous circulation. This technique allows for the pharmacological dissection of the pathophysiology of microvascular endothelial dysfunction as indexed by decreased nitric oxide-mediated vasodilation, an indicator of cardiovascular disease development risk. In this technique, a microdialysis probe is placed in the dermal layer of the skin, and a local heating unit with a laser Doppler flowmetry probe is placed over the probe to measure the red blood cell flux. The local skin temperature is clamped or stimulated with direct heat application, and pharmacological agents are perfused through the probe to stimulate or inhibit intracellular signaling pathways in order to induce vasodilation or vasoconstriction or to interrogate mechanisms of interest (co-factors, antioxidants, etc.). The cutaneous vascular conductance is quantified, and mechanisms of endothelial dysfunction in disease states can be delineated.

Autor destacado: Un enfoque de farmacodissección para descubrir mecanismos en poblaciones con riesgo de enfermedad cardiovascular 

Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate microvascular function in health and disease. Both dose-response and local heating protocols can be utilized for this technique to explore mechanisms of vasodilation and vasoconstriction in the cutaneous circulation.

Microdiálisis intradérmica: un enfoque para investigar nuevos mecanismos de disfunción microvascular en humanos

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally ...

Láser Doppler: Una herramienta para medir islote pancreático AMPc Microvascular en Vivo

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