Name: stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por una beca del Ministerio de economía y competitividad (MINECO) del gobierno de España, SAF2016-78898-C2-2-R.

este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con ambas normativa española (Real Decreto 53/2013 - Ley 32/2007) y las directrices de la Unión Europea (Directiva 2010/63/EU) en el cuidado y uso de animales en investigación biomédica.
 1. Preparación de la rata Nota: realizamos los experimentos en ratas machos para evitar los cambios hormonales.
<ol><li>El animal con una mezcla de clorhidrato de ketamina (30 mg/kg) y el clorhidrato de xilacina (5 mg/kg) inyectados por vía intramuscular, con esta dosis, la rata debe profundamente anestesiar para alrededor 1 h. de Anesthetize</li>
	Pizca de <li>la rata &#39; toe s; ausencia de un retiro reflejo indica que el animal es totalmente inconsciente. Si la rata responde a la pizca, dar anestesia suplementaria en un tercio de la dosis inicial.</li>
	<li>Afeitado del cuero cabelludo y desinfectar el área quirúrgico con povidona-yodo.</li>
	<li>Colocar el animal sobre una almohadilla de calefacción para mantener una temperatura de 38 ° C y estabilizar el animal &#39; cabeza en un marco estereotáctica usando dos barras de oreja y una barra de bocado. Tenga cuidado para evitar la perforación de la membrana del tímpano con las barras oído.</li>
	<li>Proteger los ojos aplicando una gota de gel oftálmico o suero salino a cada ojo.</li>
</ol> 2. Ubicación de la CA en el hueso Temporal de la rata <ol><li>con un bisturí, hacer una incisión a lo largo de la línea media para exponer el cráneo y retraiga el periostio que cubre la superficie del cráneo.</li>
	<li>Utilizar una punta de algodón estéril para eliminar suavemente la sangre que cubre la superficie del cráneo para visualizar bregma, lambda y interaural 0 según el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro 22.</li>
	<li>Hacer una incisión en el músculo temporal cerca de su inserción dorsal sobre el cráneo con un bisturí. Tirar el músculo utilizando una aguja y sutura material y fijar el material de sutura para el marco estereotáctico; Esto expondrá el hueso temporal. Si se presenta sangrado, lavar con solución salina estéril fría.</li>
	<li>Colocar una aguja recta estéril en el micromanipulador stereotactic, asegurándose de que está plenamente asegurado.</li>
	<li>Baje lentamente la aguja hasta que quede justo encima de la superficie del cráneo, por lo que la punta de la aguja se establece en 0 interaural. Definir este punto como cero y determinar las coordenadas de este punto.</li>
	<li>Dependiendo del área cerebral de interés, varían las coordenadas stereotactic. Determinar las coordenadas utilizando el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro 22. Una vez determinadas las coordenadas, mueva la aguja para que coincida con esas coordenadas.</li>
	<li>Blanco la CA utilizando las coordenadas de los siguientes cuatro puntos: A: A / P =-5,80 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +-8,67 mm. Baje la aguja hasta justo encima del hueso temporal para visualizar cada uno de estos cuatro puntos. Utilizando un rotulador, marca los puntos en el hueso temporal y conectarlos con el fin de dibujar un rectángulo; el rectángulo servirá como una guía para abrir de una ventana en el hueso ( figura 1).</li>
</ol> 3. Exposición quirúrgica de la CA <ol><li>abrir la ventana utilizando un taladro eléctrico y una broca pequeña broca (0.6 mm Ø). Perfore el perímetro del rectángulo a 8.000 rpm hasta que el hueso da lejos. Enfriar la superficie de perforación por lavado con solución salina estéril frío para evitar daños a estructuras subcorticales. El hueso que da forma, puede detectarse una caída en la resistencia. Tenga cuidado de no perforar el cerebro.</li>
	<li>Cuando las fronteras están flojas, tire hacia arriba del hueso de cubierta con pinzas finas y almacenarlo en solución salina estéril fría.</li>
</ol> 4. Ablación de la CA <ol><li>utilizando un microscopio quirúrgico (10 X), con cuidado corte las meninges con una cuchilla microquirúrgica y eliminarlos usando dos pinzas de punta fina. Si se presenta sangrado, lavar con solución salina estéril fría.</li>
	<li>Aspire suavemente la CA usando un dispositivo de succión quirúrgico (presión -0,24 bar) acoplado a una aguja estéril de punta Roma de 20 G. Este punto es fundamental y debe realizarse con mucho cuidado: aspirar sólo las seis capas corticales y no la materia blanca subyacente.</li>
	<li>Aspirar hasta detener la hemorragia de las arterias perforantes.</li>
	<li>Una vez terminada la aspiración, cubra el área lesionada con el hueso extraído y aplicar una gasa hemostática absorbible.</li>
	<li>Dejar que el músculo temporal recupera su posición original y luego sutura la piel con herida clips (9 mm). Aplique un ungüento antibiótico (véase la Tabla de materiales). Seguir aplicar el ungüento sobre la herida dos veces al día durante tres días. 
	Nota: Cada aplicación consiste en una capa delgada aplicada sobre la herida.</li>
	<li>Buprenorfina de inyectar por vía subcutánea en la parte posterior de la rata (0,05 mg/kg) como un analgésico 1 h después de la cirugía y luego cada 8 h durante 72 h.</li>
	<li>Mantener el animal en la almohada hasta que se despierta y volver a su jaula de alojamiento recuperar.</li>
	<li>Casa animales individualmente para evitar que los compañeros de jaula tocando el área suturado y proporcionar algunos elementos de enriquecimiento. Cambiar el aserrín diariamente para prevenir infecciones y revise cuidadosamente que el animal se recupera correctamente y no muestra signos de malestar.</li>
</ol> 5. Colección de tejido PRECAUCIÓN: al manipular el paraformaldehido (PFA), sólida y acuosa, usar equipo de protección personal (EPP) y utilizar un gabinete de seguridad.
 Nota: preparar 750 mL de solución de formaldehído disolviendo 4% (w/v) PFA en 1 x solución de tampón fosfato (PBS) con calor (55 º C). Filtrar la solución de formaldehído con papel de filtro. Preparar el timbre &#39; s solución al disolver 8,5 g de NaCl, 0,25 g de KCl, 0.2 g NaHCO 3 en 1.000 mL de agua (pH solución = 6.9).
<ol><li>Permite al animal sobrevivir como sea necesario para el estudio. Cuando se haya completado la investigación con la rata seccionada AC, terminal anestesiar por inyección intraperitoneal de 0,1 mL de pentobarbital sódico (60 mg/kg). Evaluar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie y la ausencia del reflejo de retirada.</li>
	<li>Cuando el animal está anestesiado profundamente, realizar una perfusión intracardiaca 23 de 125 mL de Ringer &#39; s solución seguido de 750 mL de solución de formaldehído mediante el uso de una aguja de calibre de 1,8 mm de diámetro interior.</li>
	<li>Una vez terminada la perfusión, decapita a la rata en la primera vértebra cervical.</li>
	<li>Tijeras de uso para quitar la piel y el músculo de la cabeza y exponer el cráneo. Utilice tijeras para cortar y abrir el foramen magnum y retire la parte posterior del cráneo.</li>
	<li>Haga un transversal corte en el hueso orbital usando tijeras Spencer y usar gubias para cortar a lo largo de los bordes superiores del cráneo para exponer el cerebro. Tenga cuidado de no dañar el cerebro.</li>
	<li>Una vez que el cerebro es expuesto, retire con cuidado la duramadre con unas pinzas de punta fina. Utilice un dedo suavemente saque bajo y elevar el cerebro. Levante el cerebro y corte la unt de nerviosIl es gratuito. Sumergir el cerebro en solución de formaldehído y almacenar a 4 ° C por 24 h.</li>
</ol> 6. Localización de las lesiones AC <ol><li>después de la fijación posterior, coloque con cuidado el cerebro en una matriz de cerebro de rata sagital exponiendo la superficie lateral del cerebro.</li>
	<li>Colocar una cámara arriba de 21 cm la superficie de la corteza mediante un soporte de cámara, seleccione la &#34; disparo super macro &#34; modo y tomar una fotografía de la superficie del cerebro.</li>
	<li>Ponga el cerebro en una matriz de cerebro de rata coronal exponiendo la superficie dorsal del cerebro y tome otra foto.</li>
	<li>Utilizando un programa editor de imagen, abra las imágenes y escala abajo de 50% para que sea más fácil trabajar con ellos. Identificar el bregma, lambda y referencias 0 interaural en la fotografía según Paxinos y Watson coordenadas 19 y marque su posición en las imágenes ( figura 2). Dibujar el contorno de la ablación en la imagen lateral del cerebro. Calcular el perímetro de.</li>
	<li>Importación las coordenadas del mapa donde la primaria (A1) y las regiones secundarias (Dorsal y Ventral cortezas) de la CA son ubicada 18 en el archivo del programa editor donde se trabaja con las imágenes. Haga clic en el mapa y arrástrelo para superponerlo a la fotografía lateral del cerebro seccionado.
	<ol><li>Hacer el bregma y referencias de la lambda del mapa coordenado coinciden con el bregma y lambda referencias identificadas en la imagen del lateral cerebro.</li>
		<li>Usar el nebulizador nasal fisura como referencia para ajustar la imagen del cerebro para el mapa y hacer que coinciden ( figura 2B).</li>
	</ol></li> <li>Calcular el porcentaje de la lesión en relación con el área ocupada por la A.C.</li></ol>

<ol>
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Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.

Una cirugía exitosa depende dos factores: mantener vivo al animal durante y después del procedimiento y localizar con precisión el área de interés. Asegurar que la rata es profundamente anestesiada durante la cirugía (prueba el reflejo de retirada) y recibe suficientes analgésicos y antibióticos no ototóxicos deben ayudar a la supervivencia. Además, la rata se debe mantener sobre una almohada hasta que despierta de la anestesia para evitar la hipotermia. Sutura se reduce la susceptibilidad a la infección, y la técnica adecuada es de vital importancia: animales elegirá a sus clips de herida, por lo que debería ser implantados lo suficientemente apretado para evitar la remoción sin poner demasiada tensión en la herida.
Para localizar con precisión el AC (o cualquier otra área cortical), es importante determinar la posición de bregma y lambda 0 interaural para utilizarlos como referencias para el cálculo de los límites de la región específica. Cualquier error en el cálculo de las coordenadas resultará en la ablación parcial de la CA o la aspiración no deseada de otras zonas aledañas. Así, la punta de la aguja debe solamente toque el hueso 0 interaural y luego traducir las coordenadas anteroposterior y mediolateral según lo que se describe en el presente Protocolo.
En este manuscrito, también hemos descrito cómo exponer quirúrgicamente y ablar de la CA. Hay tres pasos fundamentales: el proceso de perforación, la apertura y el retiro de las meninges y la ablación por aspiración. Perforación se debe realizar a una velocidad baja con la presión mínima, como una perforación de alta velocidad genera calor que puede afectar a cerca de las estructuras subcorticales. Sin embargo, mantener una velocidad baja y el área de perforación con solución salina estéril fría de refrigeración deben prevenir cualquier daño. Además, la presión mínima es esencial para evitar una rotura repentina del cráneo y lesiones posteriores a la corteza subyacente. La apertura y el retiro de las meninges que cubren el AC deben realizarse con cuidado para no romper los vasos sanguíneos. Si se presenta sangrado, es generalmente desfavorable el pronóstico temprano y tardío y es cuestionable si tal animal cumple los criterios de inclusión de un estudio confiable. Se recomienda la eutanasia en este caso. Por último, la aspiración (probablemente el aspecto más difícil en la realización de una efectiva lesión), debe limitarse a la materia gris. Hay dos indicadores que pueden ayudar a detectar la presencia de la sustancia blanca: (1) un cambio en el contraste de color, como la materia blanca es más brillante que la materia gris; y (2) el cese del sangrado de las arterias perforantes.
Después de cualquier manipulación realizada en el cerebro, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión del procedimiento en la corteza para el posterior análisis y validación de los datos obtenidos del animal. En este manuscrito, detallamos cómo localizar la ablación realizada en la corteza, utilizando un mapa de coordenadas descrito previamente por nuestro grupo18. Este mapa fue construido usando referencias anatómicas obtenidas de reconstrucciones de la sección serie de secciones histológicas, correlacionadas con el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro22. En consecuencia, el mapa distingue entre la primaria (A1) y cortezas secundarias (Dorsal y Ventral) de la CA. La principal ventaja de este mapa de coordenadas es que permite la rápida localización de la lesión mediante la superposición de una fotografía tomada desde la superficie lateral del cerebro en una matriz de cerebro sagital. Otra ventaja es que los laboratorios con menos experiencia en anatomía pueden utilizar el mapa adaptándolo a sus modelos animales. Sólo es necesario establecer las distancias entre bregma y lambda referencias 0 interaural en un cerebro de control perfundido y escala el mapa arriba o hacia abajo en consecuencia. Usar el nebulizador nasal fisura como referencia para ajustar la imagen del cerebro para el mapa. La profundidad de la ablación no puede determinarse en este mapa de coordenadas, por lo que debe ser determinado en las secciones histológicas del cerebro.
La combinación de métodos estereotácticas con la exposición quirúrgica de la CA son métodos básicos que podrían adaptarse fácilmente por cualquier investigador que desee a la CA en la rata. Esto puede ser para un experimento agudo o uno que requiere la implantación de dispositivos permanentes. Además, la ablación quirúrgica de la AC se ha previamente utilizada como modelo para estudiar los efectos de privación crónica cortical en audiencia. Ablaciones AC podrían utilizarse también para estudiar los efectos que ablaciones AC unilaterales ejercen en otras áreas corticales, o servir como un modelo de movimiento. Así, los diseños experimentales que se describen aquí son métodos útiles que se pueden aplicar individualmente o en combinación con una amplia gama de diseños experimentales.

La rata es uno de los modelos animales más utilizados en Neurología auditiva. La robustez de su comportamiento, es capaz de trabajar a cientos de ensayos por día. Su sensibilidad y agudeza espectral audiencia1,2, y la organización anatómica y funcional de su sistema central, comparable de otros mamíferos3, hacen la rata en un modelo animal adecuado para el análisis de una amplia gama de temas de investigación en Neurociencia auditiva. La corteza auditiva de ratas (AC), en particular, ha sido objeto de varios estudios anatómicos y fisiológicos que han tratado de comprender su estructura, organización y papel en el procesamiento de sonido3. Hoy en día, la AC se ha vuelto popular entre los neurólogos interesados en la plasticidad de la dependencia de la experiencia, percepción auditiva, la base sináptica de la organización del campo receptivo y el control cortical del procesamiento del sonido en el subcortical auditivo 5,4,6,7,de núcleos de8,9. Para abordar los desafíos que plantean estos nuevos enfoques, procedimientos que se pueden localizar con precisión y exponer quirúrgicamente la CA acelerará los esfuerzos de investigación. Técnicas estereotácticas permiten localizar regiones específicas en el cerebro sin pruebas de Fisiología. Aunque el tamaño del cerebro varía ligeramente entre los animales, la ubicación de cualquier área del cerebro puede ser determinada utilizando coordenadas stereotactic conjunto de hitos en el cráneo del cerebro de rata.
La ablación restringida de la AC es la extirpación quirúrgica de la región sensorial de la corteza más directamente relacionada con la audiencia. En contraste con otros métodos utilizados para bloquear la actividad de AC, tales como refrigeración o local lidocaína inyecciones10,11,12, la ablación quirúrgica de los resultados de AC en la pérdida crónica de la función. Así, ablaciones de AC son más adecuados para estudiar los efectos a largo plazo de privación cortical, así como los posteriores fenómenos de plasticidad de la lesión. La combinación de métodos estereotácticas con ablación quirúrgica de la CA se ha utilizado con éxito para estudiar los efectos fisiológicos, conductuales y moleculares de control cortical privación13,14,15 ,16,17,18,19. Por ejemplo, un modelo de rata con ablaciones bilaterales de AC se ha utilizado para estudiar los efectos de la ablación cortical en el reflejo de sobresalto auditivo y auditivas del médula oblonga (ABR) de respuestas16. Recientemente, hemos comparado los efectos que unilateral versus bilaterales ablaciones de los productos de rata AC en los umbrales de la ABR, amplitudes y latencias en diferentes momentos después de la lesión18. Además, el modelo de la rata de ablación AC restrictiva también se ha utilizado para estudiar el efecto de la degeneración vía corticofugal en la inferior collicus13,14,15 y el oído interno17 ,19. Después de que tal manipulación se realiza en el cerebro, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión de las lesiones en la corteza. Aunque muy útiles, la principal limitación de tonotópica mapas basados en las respuestas neuronales20,21 son las técnicas electrofisiológicas necesarias para localizar los campos auditivos en el cerebro de la rata. Puesto que no todos los laboratorios tienen el equipo necesario o conocimientos para hacer tales grabaciones, se construyó un mapa de coordenadas basado en la transferencia de los límites citoarquitectónicos de la CA a una imagen de la superficie del cerebro18. Este mapa puede ser muy útil para localizar la CA sin pruebas de Fisiología.
El presente Protocolo describe un método para la ubicación stereotactically guiada, exposición quirúrgica y ablación de la CA en ratas. También describe cómo utilizar nuestro mapa coordenadas18 para fácilmente localizar la extensión de la lesión sobre una imagen de la superficie de los cerebros seccionados.

<table><tbody><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>David Kopf Ins.</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>WILD M650 Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>DAGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental micromotor</td><td>W&amp;amp;H elco</td><td>5118</td><td></td></tr><tr><td>Diamond burr</td><td>B Braun</td><td>GD021R</td><td>0.6 mm</td></tr><tr><td>Surgical suction device</td><td>Atmos</td><td>Atmoforte E2</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Merial</td><td></td><td>30 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td></td><td>5 mg/kg</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-11</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodine</td><td>Meda</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>sterile saline serum</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G sterile needle</td><td>Terumo Neolus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture material</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Ointment</td><td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>dimeda</td><td>10.331.12</td><td></td></tr><tr><td>Surgical needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>501940</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Indivior UK</td><td>Buprex</td><td>0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>dimeda</td><td>08.120.15</td><td></td></tr><tr><td>Spencer scissor</td><td>dimeda</td><td>08.804.14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical knife</td><td>MSP</td><td>7503</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable hemostatic gauze</td><td>Surgicel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggital rat Brain Matrix</td><td>Activational systems Inc.</td><td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pentobarbital</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td>60 mg/kg</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Olympus 5.1 MP</td><td>C-5060 wide zoom</td><td>lens F2.8-4.8</td></tr><tr><td>Wound clips</td><td>Reflex 9</td><td></td><td>9 mm</td></tr><tr><td>Canvas 12</td><td>ACD Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>needle gauge</td><td></td><td></td><td>diameter 1.8 mm</td></tr><tr><td>Separatory funnel</td><td>labbox</td><td>11409</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GluA2 primer Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td></tr><tr><td>GluA2 primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td></tr><tr><td>GluA3 primer Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td></tr><tr><td>GluA3 primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td></tr></tbody></table>

stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain

La corteza auditiva de ratas (AC) se está convirtiendo en popular entre los investigadores de Neurociencia auditiva que están interesados en la plasticidad de la dependencia de la experiencia y procesos perceptivos auditivos cortical control de procesamiento en los núcleos auditivos subcorticales de sonido. Para hacer frente a nuevos retos, un procedimiento para localizar con precisión y quirúrgico exponer la corteza auditiva agilizaría este esfuerzo de investigación. Neurocirugía estereotáxica se utiliza rutinariamente en la investigación preclínica en modelos animales al engraft una aguja o electrodo en un lugar previamente definido dentro de la corteza auditiva. En el siguiente protocolo, utilizamos métodos estereotácticos de una forma novedosa. Identificamos cuatro puntos de coordenadas sobre la superficie de la temporal bone de la rata para definir una ventana que, una vez abierto, expone con precisión tanto el principal (A1) y secundaria (Dorsal y Ventral) cortezas de la A.C. con este método, entonces realizamos una cirugía ablación de la CA. Después de realiza dicha manipulación, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión de las lesiones en la corteza. Así, describimos un método para localizar fácilmente la autopsia de la ablación de la AC utilizando un mapa de coordenadas construido mediante la transferencia de los límites citoarquitectónicos de la CA a la superficie del cerebro. La combinación de la localización stereotactically dirigido y ablación de la CA con la localización de la zona lesionada en post mortem de un mapa de coordenadas facilita la validación de la información obtenida de los animales y conduce a un mejor análisis y comprensión de los datos.

Se realizan una ubicación stereotactically guiada, exposición quirúrgica y la ablación unilateral de la CA en tres ratas de Wistar. La localización de la lesión confirmó que ablaciones en las tres ratas usurpó las subdivisiones principales de la CA (cortezas primarias dorsales y ventrales) y abarca un rango de 80 a 100% de la superficie total de AC (figura 2B).
El protocolo aquí descrito para realizar ablaciones AC restrictivas se ha utilizado previamente en nuestro laboratorio para estudiar los efectos a largo plazo de la privación del control cortical en los núcleos auditivos subcorticales, así como los posteriores fenómenos de plasticidad. En estos estudios, se validó el protocolo de ablaciones AC aplicando fisiológica (ABR), comportamiento (respuestas de sobresalto, prepulso inhibición; PPI) y molecular (DNA microarrays, qPCR y Western Blot) métodos13,14,15,16,17,18,19. Aquí, para demostrar la eficacia de nuestro protocolo, dejamos las tres ratas de AC por ablación sobrevivir durante una semana, y las cócleas durante la colección de tejidos recogidos paso a estudiar los cambios en la expresión de las subunidades AMPA más relevantes presentes en la cóclea adulta , GluA2 y GluA3, por qPCR. La comparación entre las transcripciones de AC ablación ratas y animales de control simulado donde se realizó todo el proceso de la cirugía pero no la ablación cortical mostraron una abajo-regulación de GluA2 y una para arriba-regulación de GluA3 en ambas cócleas (figura 3) , que está de acuerdo con nuestro anterior estudio19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figura 1: imágenes del rata del hueso temporal en tres pasos quirúrgicos diferentes. (A) transferencia de las coordenadas estereotáxicas de la CA en el hueso temporal. Las coordenadas de los cuatro puntos son: A: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +-8,67 mm. (B) las coordenadas se utilizan como referencia para dibujar un rectángulo en la superficie del hueso temporal que guiarán la apertura de una ventana. (C) muestra la ventana que se abre en el hueso después de la perforación. Las meninges con los vasos sanguíneos se observan en la superficie del cerebro. R: rostral, D: dorsal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figura 2: procedimiento para la localización de las lesiones en el cerebro de la rata. (A) fotografía de la superficie dorsal de un cerebro AC ablación con agujas stereotactically implantados en Lambda y Bregma (según coordenadas Paxinos y Watson,19). Las líneas punteadas marcan la posición de Bregma y Interaural 0 en la cuadrícula de 9 x 9 cm, así como en la superficie dorsal del cerebro. (B) fotografía de la superficie lateral del cerebro seccionado superpuesto al mapa de coordenadas de la CA. El perímetro de la lesión es marcado en rojo en la imagen. El perímetro de la zona de AC está marcado en negro en el mapa. En este ejemplo, el porcentaje de la ablación de AC con respecto al área total ocupado por el AC es 84.79%. AC: corteza auditiva, IA: inter aural, FR: fisura Nebulizador nasal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figura 3: cambios en los niveles de ARNm de las subunidades del receptor AMPA GluA2 y GluA3 después de la unilateral lesión tras ablaciones AC de 7 días. Resultados se presentan como la media ± desviación estándar del cambio doble. Cambios para GluA2 las transcripciones se representan en azul. En rojo se presentan cambios para las transcripciones de GluA3. Se observaron una disminución significativa en GluA2 y un aumento de GluA3 en ambas cócleas (ipsi - y contralateral a la ablación) en relación con controles del impostor con no ablaciones corticales en 7 días después de la cirugía; Esto está de acuerdo con nuestros anteriores resultados19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Stereotactically dirigido la ablación de la corteza auditiva de ratas y la localización de la lesión en el cerebro

Se describe un método para la ubicación stereotactically-dirigida, la exposición y la ablación de la corteza auditiva de ratas. La localización de la ablación se evaluó mediante post mortem de un mapa de coordenadas.

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

stereotactically-guided-ablation-rat-auditory-cortex-localization

Research

JoVE Journal

Behavior

11.5K vistas.  University of Salamanca. Se describe un método para la ubicación stereotactically-dirigida, la exposición y la ablación de la corteza auditiva de ratas. La localización de la ablación se evaluó mediante post mortem de un mapa de coordenadas.

Video: Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

FMRI simultánea y electrofisiología en el cerebro de roedores

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Investigación

Neurociencias

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer scale. However, current methods mostly rely on tethered cable recordings or only use unidirectional systems, allowing either recording or stimulation of neural activity, but not at the same time or same target. Here, a new wireless, bidirectional device for simultaneous multichannel recording and stimulation of neural activity in freely behaving rats is described. The system operates through a single portable head stage that both transmits recorded activity and can be targeted in real-time for brain stimulation using a telemetry-based multichannel software. The head stage is equipped with a preamplifier and a rechargeable battery, allowing stable long-term recordings or stimulation for up to 1 h. Importantly, the head stage is compact, weighs 12 g (including battery) and thus has minimal impact on the animal&#180;s behavioral repertoire, making the method applicable to a broad set of behavioral tasks. Moreover, the method has the major advantage that the effect of brain stimulation on neural activity and behavior can be measured simultaneously, providing a tool to assess the causal relationships between specific brain activation patterns and behavior. This feature makes the method particularly valuable for the field of deep brain stimulation, allowing precise assessment, monitoring, and adjustment of stimulation parameters during long-term behavioral experiments. The applicability of the system has been validated using the inferior colliculus as a model structure.

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A wireless, bidirectional system for multi-channel neural recordings and stimulation in freely behaving rats is introduced. The system is light and compact, thus having minimal impact on the animal&#180;s behavioral repertoire. Moreover, this bidirectional system provides a sophisticated tool to assess causal relationships between brain activation patterns and behavior.

Un inalámbrico, interfaz bidireccional para la grabación en Vivo y estimulación de la actividad Neural en comportarse libremente las ratas

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Comportamiento

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

La cirugía estereotáxica para la lesión excitotóxica de áreas específicas del cerebro en la rata adulta

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La estimulación cerebral profunda con simultánea fMRI en roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Microelectrodos guiada implantación de electrodos en el Subtalámico Núcleo de ratas de largo plazo estimulación cerebral profunda

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Concurrent Recording of Co-localized Electroencephalography and Local Field Potential in Rodent

Although electroencephalography (EEG) is widely used as a non-invasive technique for recording neural activities of the brain, our understanding of the neurogenesis of EEG is still very limited. Local field potentials (LFPs) recorded via a multi-laminar microelectrode can provide a more detailed account of simultaneous neural activity across different cortical layers in the neocortex, but the technique is invasive. Combining EEG and LFP measurements in a pre-clinical model can greatly enhance understanding of the neural mechanisms involved in the generation of EEG signals, and facilitate the derivation of a more realistic and biologically accurate mathematical model of EEG. A simple procedure for acquiring concurrent and co-localized EEG and multi-laminar LFP signals in the anesthetized rodent is presented here. We also investigated whether EEG signals were significantly affected by a burr hole drilled in the skull for the insertion of a microelectrode. Our results suggest that the burr hole has a negligible impact on EEG recordings.

This protocol describes a simple method for concurrent recording of co-localized electroencephalography (EEG) and multi-laminar local field potential in an anesthetized rat. A burr hole drilled in the skull for the insertion of a microelectrode is shown to produce negligible distortion of the EEG signal.

Grabación concurrente de electroencefalografía Co localizada y potencial de campo Local en roedores

Although electroencephalography (EEG) is widely used as a non-invasive technique for recording neural activities of the brain, our understanding of the ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Un método basado en el Micro-CT para caracterizar las lesiones y la localización de electrodos en cerebros de animales pequeños

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

In vivo Positron Emission Tomography to Reveal Activity Patterns Induced by Deep Brain Stimulation in Rats

Deep brain stimulation (DBS) is an invasive neurosurgical technique based on the application of electrical pulses to brain structures involved in the patient&#39;s pathophysiology. Despite the long history of DBS, its mechanism of action and appropriate protocols remain unclear, highlighting the need for research aiming to solve these enigmas. In this sense, evaluating the in vivo effects of DBS using functional imaging techniques represents a powerful strategy to determine the impact of stimulation on brain dynamics. Here, an experimental protocol for preclinical models (Wistar rats), combined with a longitudinal study [18F]-fluorodeoxyclucose positron emission tomography (FDG-PET), to assess the acute consequences of DBS on brain metabolism is described. First, animals underwent stereotactic surgery for bilateral implantation of electrodes into the prefrontal cortex. A post-surgical computerized tomography (CT) scan of each animal was acquired to verify electrode placement. After one week of recovery, a first static FDG-PET of each operated animal without stimulation (D1) was acquired, and two days later (D2), a second FDG-PET was acquired while animals were stimulated. For that, the electrodes were connected to an isolated stimulator after administering FDG to the animals. Thus, animals were stimulated during the FDG uptake period (45 min), recording the acute effects of DBS on brain metabolism. Given the exploratory nature of this study, FDG-PET images were analyzed by a voxel-wise approach based on a paired T-test between D1 and D2 studies. Overall, the combination of DBS and imaging studies allows describing the neuromodulation consequences on neural networks, ultimately helping to unravel the conundrums surrounding DBS.

In vivo Positron Emission Tomography to Reveal Activity Patterns Induced by Deep Brain Stimulation in Rats

We describe a preclinical experimental method to evaluate metabolic neuromodulation induced by acute deep brain stimulation with in vivo FDG-PET. This manuscript includes all experimental steps, from stereotaxic surgery to the application of the stimulation treatment and the acquisition, processing, and analysis of PET images.

In vivo Tomografía por emisión de positrones para revelar patrones de actividad inducida por estimulación cerebral profunda en ratas

Deep brain stimulation (DBS) is an invasive neurosurgical technique based on the application of electrical pulses to brain structures involved in the ...

Implanting a Wireless Bidirectional Microelectrode System in a Rat Brain

Source: Melo-Thomas, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56299">A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates a procedure for implanting a wireless bidirectional multichannel electrode unit into a rat brain to record and stimulate multichannel neural networks.

Implante de un sistema inalámbrico de microelectrodos bidireccionales en el cerebro de una rata

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

A Stereotactically Guided Ablation Technique for Auditory Cortex Removal in Rats

Source: Lamas, V., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56429">Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a stereotactically-guided surgical procedure for ablating the auditory cortex in a rat. The steps include identifying anatomical landmarks in an anesthetized rat secured in a stereotactic frame, creating a window on the skull above the auditory cortex, aspirating the cortical layers, and providing post-operative care to assess the impact of the ablation on sound processing.

Source: Lamas, V., et al. Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain.&#160;J. Vis. Exp. ...

Stereotactically dirigido la ablación de la corteza auditiva de ratas y la localización de la lesión en el cerebro

Resumen

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