Name: detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr
Uploaded: 2018-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR at JoVE.com

Los autores desean dar las gracias a Kami Harris para el primer diseño, Ashley McKibbon y Jessica Thomas-Ebbett para rodaje, John Blakely, Alexandra Foley-Eby, Chris Langley, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chris Zinck y Rosie el perro que aparece en la video. A. M. K. fue apoyado por la Fundación Canadiense de investigación de la enfermedad de Lyme, y financiación del proyecto fue proporcionada por las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC). M. K. B. W. había recibido sueldo fondos de la Fundación de innovación de Nuevo Brunswick (NBIF).

1. ADN aislado de las garrapatas
<ol><li>Adquirir las garrapatas mediante colección de campo, o vigilancia pasiva de veterinarios y miembros del público. Garrapatas deben matadas congelando, colocadas en una bolsa sellada y enviadas a temperatura ambiente.<ol>
<li>Utilizando un formulario de presentación, recabar información sobre la fecha y la ubicación geográfica del encuentro, estado del accesorio de garrapata, especie e historia de viaje reciente de la hostia.</li>
		<li>Puesto que la polimerización en cadena jerarquizada es intrínsecamente vulnerable a la contaminación, asegúrese de que está configurado el espacio de trabajo de laboratorio para minimizar la Cruz-exposición de muestras. Esto implica ejecutar diferentes elementos del protocolo en espacios separados, dedicados bien aislados entre sí completamente limpiados y esterilizados, y asegurando que todos los instrumentos son libres de contaminantes.</li>
		<li>Al recibir a la muestra, fotografiar los ticks y determinar la especie, etapa de desarrollo, sexo y estado de ingurgitación en comparación a una identificación dominante32 .</li>
		<li>Bajo condiciones asépticas, biseca la garrapata con una hoja de afeitar estéril o bisturí y colocar los fragmentos de dos garrapatas en tubos de microcentrífuga separado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para extraer el ADN total, utilizar cualquier procedimiento de aislamiento que produce la plantilla compatible con PCR; Este protocolo muestra una sencilla estrategia basada en la quelación.<ol>
<li>Comenzar agregando un volumen apropiado (a menudo entre los 50-200 μL) de un reactivo lítico quelación al fragmento de garrapata. El monto específico dependerá de la condición ejemplar de tamaño y congestión; directrices deben ser provistas por el fabricante. Homogeneizar con un mortero de microtubo.</li>
		<li>Incubar las muestras en un baño de agua a 60 ° C durante 45 minutos y agitar brevemente.</li>
		<li>Centrifugar las muestras durante 4 minutos a 16.276 x g (13.300 rpm) en una microcentrífuga de sobremesa.</li>
		<li>Transferir el sobrenadante a un microtubo fresco, rotulado conteniendo 50 de μl isopropanol, mezclar por inversión y volver a centrifugar como en (1.2.3).</li>
		<li>Decantar el sobrenadante y lavar el pellet de ADN con 50 μl de etanol al 70%.</li>
		<li>Quitar exceso etanol con una pipeta y permiten la pelotilla airear por 15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Para Resuspender el ADN, añada 50 μl de 1 mM de Tris de pH 7.0 e incubar las muestras en un baño de agua durante 1 h a 60 ° C. Ahora, el ADN puede almacenarse a-20 ° C para futuros análisis molecular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nested PCR detección de Borrelia OspA y FlaB.
Nota: Se proporciona un resumen general PCR principios y prácticas de Lorenz, 201233.
<ol><li>Sintetizar u obtener cartillas de gene-específicas del oligonucleótido exterior e interior de Borrelia . Vea la tabla 1 para primer conjuntos, sus respectivos productos tamaños y temperatura de fusión.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Primer nombre</td>
			<td>Objetivo gene</td>
			<td colspan="2">Secuencia (5' - 3')</td>
			<td>Tamaño de amplicón</td>
			<td>Temperatura de recocido</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB a Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB a Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB en Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB en Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA a Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA fuera Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA en Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA en Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Cartillas interiores y exteriores para nPCR de Borrelia burgdorferiFlaB y OspA. En la práctica, los iniciadores del FlaB detectan B. burgdorferi s.s. y otros estrechamente relacionados genospecies de Borrelia , mientras OspA cartillas capturan sólo B. burgdorferi s.s. amplificación de ambos loci indicaría B. burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>Esterilizar previamente un gabinete PCR con UV luz y 70% etanol. Nota: Para minimizar la potencial contaminación de las muestras, este espacio de trabajo debe ser distinto de la localización de la disección de la garrapata, la extracción de ADN y electrophoresis del gel.<ol>
<li>Para el funcionamiento inicial de la PCR, utilizar los iniciadores externos junto con la plantilla de ADN recuperado en el paso 1.0 anterior y establece la mezcla de reacción según se describe en la tabla 2. En paralelo, realizar positivos control funciona de verificado Borrelia DNA y control negativo funciona incluyendo reacciones no-plantilla para detectar contaminación del reactivo y el aerosol. Añadir ADN al final para minimizar la contaminación potencial de los reactivos. Asegurar que cada tubo está cerrado en todo momento cuando los reactivos no se agregan y cerrar tubos inmediatamente después de la adición de ADN y antes de que se abran otros tubos.</li>
		<li>Un termociclador de programa como sigue: 95 ° C por 5 min; 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, recocido temperatura por 30 s, 72 ° C por 45 s; 72 ° C por 5 min; y mantener a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar la segunda ronda de PCR similar a la primera reacción, excepto utilizar imprimaciones interiores con 2 μl del producto PCR primer (producido en 2.2.2). Nota: Los volúmenes de reacción otra vez son proporcionados en la tabla 2. Debe tenerse cuidado para evitar la contaminación con amplicones que DNA de la plantilla se agrega último y que solamente los tubos correspondientes a una muestra están abiertos a la vez. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
				<td>Volúmenes PCR # 1</td>
				<td>Polimerización en cadena # 2 volúmenes</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq polimerasa Master Mix 2 X</td>
				<td>12.5 ΜL</td>
				<td>12.5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Agua libre de nucleasas</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μm cartillas de avance y retroceso</td>
				<td>1,0 μL iniciadores exterior</td>
				<td>Cartillas interior 1,0 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Plantilla de la DNA</td>
				<td>2.0 μL, de la extracción de la muestra (1.2.7)</td>
				<td>2.0 μL, 1 ronda de PCR (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
Tabla 2: Mezclas de reacción de PCR para amplificaciones primeras y segunda. 
	 
	<ol>
<li>Programar al termociclador como antes, pero ajustar la temperatura de recocido para acomodar los cebadores internos (véase cuadro 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. proyección de imagen y electroforesis en Gel de agarosa
Nota: Para instrucciones básicas de separación de ADN por electroforesis, ver Lee et al., 201234.
<ol><li>Preparar un gel de agarosa al 1.2% con buffer de SB X 20 0.2 M NaOH, 0,8 M ácido bórico pH 8, diluido al 1 X y añadir aproximadamente 5 μl de una tinción de ADN, antes de verter, si se desea la tinción del gel.</li>
	<li>Cargar 10 μl del producto de la segunda reacción de PCR (interna) de cada uno experimental y la muestra de control, junto a una escalera de bp 100 (5 μl).<ol>
<li>Electrophorese por 1 h a 107 V (5V/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vista y documento el gel utilizando un transiluminador y asociados de la cámara y el software.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Décadas de uso, técnicas basadas en PCR han demostrado ser constantemente su valor en la detección de Borrelia de muestras de artrópodos y mamíferas, si Borrelia provienen de origen clínico o ambiental. PCR ofrece muchas mejoras sobre enfoques existentes para la vigilancia. En particular, no es dependiente en el desarrollo y rendimiento de los reactivos de anticuerpos y en su lugar puede ser fácilmente adaptado para detectar nuevos objetivos de interés simplemente modificando secuencias de la cartilla. PCR también tiene capacidad para la evaluación de múltiples loci en paralelo, ya sea independientemente o a través de una reacción multiplex. Puede ser aplicado a las entradas de diversas muestras, incluyendo garrapatas fresco y archivados22, animal o humanos fluidos corporales y tejido resecado25. PCR también rinde amplicones que pueden ser procesados, por ejemplo por enzima de la restricción digestión, sonda hibridación o secuenciación, para proporcionar la mayor penetración en la identidad microbiana21.
Como una herramienta clínica, la PCR es expresiones preferible para el diagnóstico serológico estándar, ya que proporciona una indicación directa de presencia bacteriana, en lugar de confiar en la respuesta inmune del huésped como medida secundaria de la infección. Sin embargo, borreliosis de Lyme se asocia con una carga microbiana relativamente modesta (< 50 organismos/mL de orina o plasma) y25spirochetemia transitoria, que puede dar lugar a falsos negativos. La sensibilidad de esta técnica en la clínica varía considerablemente dependiendo del tipo de tejido, etapa de la infección y la condición de la muestra, comprendida entre 12,5% y 62% en los estudios de sangre, líquido cefalorraquídeo y tejido hecho una biopsia36. Limitaciones de sensibilidad molecular no son una preocupación si PCR se lleva a cabo con posterioridad a la cultura bacteriana, sin embargo la recuperación de la espiroqueta viable de especímenes clínicos se ha demostrado igualmente desafiante. Sólo recientemente se han optimizado los protocolos para mayor rendimiento35. Mientras tanto, la tripa de una garrapata adulta infectada puede albergar en promedio en cualquier lugar de 2.000 a más de 50.000 Borrelia37,38,39, que es firmemente dentro de la gama de detección de nPCR. Así, el protocolo es idóneo para esfuerzos de vigilancia de la garrapata.
A pesar de sus muchas ventajas, nPCR plantean ciertos retos y la capacidad de esta técnica para informar con precisión infección de garrapata por lo tanto depende de la estratégica selección de genes y amplicones, flujos de trabajo experimentales meticuloso que recuperan ADN de calidad de especímenes y reducir al mínimo la Cruz-exposición de muestras y el uso de los controles adecuados que pueden contaminantes en el ambiente de laboratorio y reactivos. Antes de cualquier experimentación, el alcance y la intención de la investigación debe definirse claramente para que lugares geométricos genéticos apropiados y regiones, se pueden seleccionar. Si el objetivo es proporcionar una pantalla imparcial para los causantes de Lyme burgdorferi de Borrelia s.l. complejo, imprimaciones deben crearse para detectar todas las cepas asociadas con similar afinidad y eficiencia de amplificación, sin capturarlos sin relación organismos25. Nuevas cartillas pueden ser diseñadas y evaluado en silico utilizando herramientas de software como el Primer chorro40, aunque también debe ser validados experimentalmente contra referencia estándar aislantes antes de ser aplicados a muestras no caracterizadas. El procedimiento de extracción de ADN pretende recuperar intacto plantilla microbiana de una muestra ambiental mixta (homogeneizado de garrapata). Un paso opcional antes de proceder con la PCR es evaluar la integridad del ADN extraído. Además, se podrían configurar reacciones paralelas a un gen de la limpieza en la señal de destino. Este último método también puede indicar la presencia de inhibidores en la mezcla de reacción, proporcionando mayor confianza que las reacciones negativas de Borrelia son debido a la ausencia del organismo y no a la presencia de un inhibidor de contaminantes.
El aumento de la sensibilidad de la estrategia PCR anidada viene a expensas de la posible contaminación que genera resultados falsos positivos. Plantilla de exógeno podría introducirse a una muestra durante la disección de la garrapata y la recuperación de ADN, o en el proceso de creación de las reacciones de amplificación externa e interna. Por lo tanto es especialmente importante seguir mejores protocolos de práctica para PCR evitar la plantilla o amplicones contaminación cruzada. Estos incluyen el uso de estaciones de trabajo separadas con corrientes de aire independiente, contención en PCR y gabinetes de seguridad biológica en su caso, cuidadosa química física limpieza y esterilización de superficies y reactivos y prudente manejo de ADN 41. No-plantilla controles también son vitales en la identificación de contaminación de los reactivos comunes. Una vulnerabilidad particular de nPCR es el amplicon manipulación que se produce al transferir los productos de la primera reacción en el segundo recipiente de polimerización en cadena. Puesto que el ADN diana ya ha sufrido enriquecimiento exponencial en las muestras positivas, este paso es especialmente propenso a la contaminación cruzada, y se ha desarrollado un protocolo del solo-tubo nPCR para sortear esta limitación. En este enfoque, ambos juegos de cebadores para un gen dado se suman a un tubo de reacción que queda sellado para dos rondas de PCR31. Los pares de imprimación interior y exterior deben ser termodinámicamente distintos, tal que el par externo amplifica la plantilla a una alta temperatura de recocido que es prohibitiva para los cebadores internos. En la segunda vuelta, se baja la temperatura de recocido para acomodar al par interno. No sólo hace de este puente un paso potencialmente confusión, también permite el uso de más medidas de lucha contra la contaminación de31,42. Sin embargo, esta modificación puede sacrificar cierta sensibilidad del ensayo. Independientemente del enfoque, aumentando el número de repeticiones técnicas realizado independientemente en una muestra le ayudará a identificar contaminación espuria.
Técnicas moleculares han continuado evolucionando desde la introducción del nPCR y estos enfoques más recientes ofrecen seleccionarlos ventajas sobre los diseños originales, aunque en mayor gastos financieros. Como su nombre indica, PCR cuantitativa (qPCR o real tiempo (RT)-PCR) permite la enumeración de patógenos en una muestra, mientras que las técnicas convencionales son cualitativas en naturaleza43. La sensibilidad de qPCR es presuntamente similar a la de nPCR38, aunque puede variar dependiendo de la imprimación de características28. Una variación de qPCR que utiliza balizas moleculares (MB) en lugar de sondas TaqMan convencionales también ha demostrado promesa en la detección de Borrelia en muestras clínicas44,45,46. Debido a su estructura secundaria única, moleculares beacons al parecer producen fluorescencia del fondo inferior y superiores señales legítimas, proporcionando así una sensibilidad superior47. Evaluaciones preclínicas sugieren un potencial umbral de detección de entre uno y diez las espiroquetas44,45. Por otra parte, la técnica se ha aplicado con éxito en reacciones multiplexores para detectar simultáneamente un huésped mamífero gen44 y otros patógenos tick-borne45, que no es fácilmente alcanzable con nPCR. Otras modificaciones en el diseño incluyen gota PCR (ddPCR) la tecnología digital, que puede cuantificar ADN sin el uso de una curva estándar39,48. El límite inferior de detección de esta técnica para Borrelia es además alrededor de diez muestra espiroquetas39. En comparación con nPCR, estos enfoques también tienen la ventaja de reducido potencial para la contaminación, ya que sólo requieren un protocolo de amplificación individuales.
Si el objetivo de la vigilancia es en lugar de otro perfil el contenido bacteriano variado de una garrapata, 16S rRNA metagenómica es un atractivo49. Aunque este enfoque es más costoso, requiere especializados secuenciadores de ADN que no se encuentra en todos los laboratorios de biología molecular y exige una interpretación más sofisticada basada en la bioinformática, puede capturar un amplio espectro de microbios más exactamente representa la carga del patógeno del vector.
QPCR y sus derivados son métodos de elección para aplicaciones cuantitativas y metagenómica pantallas proporcionan amplios inventarios del microbioma de la garrapata, esfuerzos de vigilancia específica a menudo se refieren a información binaria de la presencia o ausencia de uno o varios patógenos en un vector. Bajo tales circunstancias, estos enfoques nuevos y más elaborados pueden introducir complejidad innecesaria y carga financiera en el proceso. Por estas razones, nPCR ha resistido la prueba del tiempo como una técnica fundamental en señal de prueba.

La enfermedad de Lyme (LD) es la infección transmitida por vectores más frecuente en el hemisferio norte, y su incidencia sigue aumentando1. Esta enfermedad debilitante es causada por patógenos spirocheteal de la borreliosis de Lyme (LB) complejo (comúnmente referido como Borrelia burgdorferi sensu lato, s.l.), que comprende históricamente el patógeno predominante de América del norte, B. burgdorferi sensu stricto (s.s), además de B. afzelii y B. garinii, que están extendidos por toda Europa y Asia y son especies de emergente importancia clínica2,3. Estas bacterias se transmiten a los seres humanos a través de la picadura de infectado Ixodes garrapatas2. Aunque los vectores principales de América del norte son I. scapularis e I. pacificus, múltiples especies dentro de este género se han encontrado para abrigar y transmitir la bacteria4. En los seres humanos, B. burgdorferi puede causar síntomas del multisistema que afectan a la piel, articulaciones, corazón, sistema nervioso, glándulas endocrinas, aparato gastrointestinal y órganos internos5,6,7, 8,9,10. Actualmente, el centro de Control y prevención de enfermedades calcula más de 300.000 nuevos casos humanos anuales en los Estados Unidos11,12. Mientras que el pronóstico suele ser favorable cuando la enfermedad es diagnosticada y tratada en las primeras etapas, los estudios han sugerido en cualquier lugar entre 10% y el 60% de los pacientes que recibieron el régimen antibiótico recomendado continuado sufriendo síntomas después de terapia cesación, en un fenómeno había denominado síndrome de la enfermedad de Lyme de Post tratamiento (PTLDS)13,14,15. Por otra parte, retrasos en la intervención clínica pueden presentarse como resultado de la falta de conciencia de una picadura de garrapata, la presentación no específica de la enfermedad inicial y la baja sensibilidad del diagnóstico basado en la serología tradicional cuando se utiliza en el inicio de la infección. Si no se tratan rápida y adecuadamente permite la progresión de síntomas que puede manifestar en cada vez más debilitantes complicaciones16,17. Prevención de la enfermedad de Lyme es una piedra angular de la gestión del riesgo. Estrategias para combatir esta creciente amenaza incluyen medidas de vigilancia sólido para indicar que la prevalencia del patógeno en las garrapatas e identifican las regiones geográficas de interés.
Este artículo demuestra la utilidad de la reacción en cadena jerarquizada de polimerasa (nPCR) como una herramienta de detección molecular mediante el cual se identifican las garrapatas infectadas. Para aumentar la especificidad, dos genes de Borrelia se utilizan para la amplificación de paralelo. B de flagelina (FlaB) codifica una proteína de gran filamento del flagelo18, y el gen se encuentra en el único cromosoma lineal, mientras que el producto de la lipoproteína de exterior superficie proteína A (OspA) media del midgut de la garrapata colonización, y es codificada por el plásmido19,20. El flujo de trabajo consiste en colección de garrapata, la extracción de ADN y luego una ronda inicial de la PCR para detectar Borrelia-loci específicos. Posterior PCR utiliza el producto de la primera reacción como una nueva plantilla para generar fragmentos de amplificación más pequeño e interno. Una garrapata se considera positiva para Borrelia burgdorferi cuando amplicones de interior de ambos genes de Borrelia pueden ser detectada por electroforesis en gel de agarosa.
La técnica de nPCR y FlaB y objetivos de gen OspA , han sido ampliamente utilizados para la vigilancia ecológica y detección clínica de la espiroqueta de Lyme desde principios del decenio de 199021,22,23 ,24,25. Antes del desarrollo de protocolos moleculares, las garrapatas fueron evaluadas al someter contenido estomacal a anti -Borrelia inmunofluorescencia (IF) de tinción, cultivo microbiano o una combinación de éstos26. Estos enfoques adolecen de limitaciones inherentes, incluyendo el crecimiento lento y la naturaleza fastidiosa de Borrelia27problemas de performance de anticuerpo y el requisito de garrapatas vivo IF proceso21. PCR fue posteriormente adoptado para identificación rápida, sensible y específico de vectores infectados. Ofreció mejoras marcadas en la metodología tradicional, incluyendo la aplicación directa de la cultura-independiente a tipos de muestras diversas, como las garrapatas muertas y archivados que serían inadecuadas para la prueba de21,22 . Diseños experimentales anidados más lejos mejoran la especificidad y sensibilidad de la PCR clásica empleando dos conjuntos distintos de cartillas gene-específicas en dos rondas consecutivas de amplificación25,28.
Éxito experimental es críticamente dependiente de diseño selección y productos estratégicos gene. Para estimar con precisión la presencia de Borrelia burgdorferi, cartillas deberán detectar los patógenos pertinentes sin antigénico con la espiroqueta de la fiebre recurrente también en el género Borrelia . En el caso del FlaB, esta especificidad se logra apuntando a una región interna variable del gen, en lugar de las secuencias flanqueantes relativamente conservadas que son compartidas por diversas bacterias (figura 1)24,29 , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> Figura 1: el concepto de nPCR, tal como se ilustra usando Borrelia FlaB gene como objetivo. El termini de 5' y 3' del gen es comunes a los organismos más allá de burgdorferi de Borrelia s.l., representación de estas regiones no aptos para la evaluación específica de los agentes patógenos causantes de Lyme. Usando las secuencias interiores conservan menos como objetivos de la cartilla, se ejecutan dos rondas de PCR para detectar un amplicon final, interna. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En una prueba de su capacidad discriminatoria, interior FlaB cartillas fueron evaluadas con más de 80 diferentes cepas de Borrelia y encontró a identificar sólo aquellos asociados con la enfermedad de Lyme24. El límite inferior de detección de nPCR se ha documentado en entre seis24 y diez31 bacterias de cultivo puro, aunque la sensibilidad puede mejorarse por borrar el amplicon sur y cruza por hibridación una radiomarcados o sonda quimioluminiscente. Las técnicas de acoplamiento reduce el umbral de detección a un spirochete solo31. Por comparación directa, PCR solo redondo convencional, unprobed fue encontrado para informar de la presencia de un mínimo de 104 espiroquetas31. Sin embargo, cabe señalar que la sensibilidad del ensayo será menor cuando se trabaja con muestras ambientales y clínicas complejas, debido a la abrumadora presencia de ADN no relacionado y posibles sustancias inhibidoras. Estos desafíos pueden eludirse en gran parte por el uso de nPCR.
A pesar de avances en las tecnologías moleculares en las últimas décadas, nPCR sigue siendo una técnica básica en esfuerzos de vigilancia moderna. Si se tiene cuidado en el diseño y ejecución de este protocolo, es un enfoque potente, adaptable y relativamente sencillo para capturar la presencia de patógenos en vectores de garrapatas.

<table><tbody><tr><td>LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td><td>Nuaire</td><td>ES AIR NU-543&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>0.22 mm thickness</td></tr><tr><td>Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td><td>Axygen</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>AquaGenomic&amp;nbsp;</td><td>MultiTarget Pharmaceuticals</td><td>2030</td><td>DNA extraction reagent</td></tr><tr><td>Microtube Pestle</td><td>Diamed</td><td>DIATEC610-1551</td><td>Designed for 1.5 ml tubes</td></tr><tr><td>Water bath - Isotemp 202</td><td>Fishse Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>S0100 CAN</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td><td>Labnet</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Primer Synthesis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cabinet</td><td>Misonix</td><td>PCR6-482</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix 2x</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>The water comes with the GTG</td></tr><tr><td>Spectrafuge Mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td><td>EDVOTEK</td><td>608</td><td></td></tr><tr><td>Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>GD 100 bp DNA Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>DM001-R500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis power pack&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>VWR 105</td><td>EC Apparatus Corporation</td></tr><tr><td>Fluor-S MultiImager&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-7700 (Serial number 433B0154)</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td><td>BioRad</td><td>1709600</td><td></td></tr></tbody></table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

La enfermedad de Lyme es una infección grave transmitida por vectores que es causada por la Borrelia burgdorferi sensu lato familia de las espiroquetas, que son transmitidos a los seres humanos a través de la picadura de garrapatas Ixodes infectadas. El agente etiológico primario en América del norte es stricto del sensu del burgdorferi del Borrelia . Como amplían las regiones geográficas de riesgo, es prudente apoyar los programas de vigilancia robusta que pueden medir las tasas de infección de la garrapata y comunicar los resultados a los médicos, veterinarios y público en general. La técnica molecular de reacción en cadena jerarquizada de polimerasa (nPCR) ha sido utilizada para este propósito, y sigue siendo un enfoque central, barato y robusto en la detección de Borrelia en garrapatas y vida silvestre.
Este artículo demuestra la aplicación de nPCR en extractos de ADN para identificar los ejemplares infectados de la señal. Independiente dos objetivos de B. burgdorferi , genes de codificación B flagelina (michelines) y exterior superficie proteína A (OspA), se han utilizado ampliamente con esta técnica. El protocolo trata de colección de la marca, la extracción de ADN y luego una ronda inicial de la PCR para detectar cada uno de los dos Borrelia-loci específicos. Reacción en cadena subsecuente de la polimerasa (PCR) utiliza el producto de la primera reacción como una nueva plantilla para generar fragmentos de amplificación más pequeño e interno. El enfoque anidado mejora la especificidad y la sensibilidad de la PCR convencional. Una garrapata se considera positiva para el patógeno cuando amplicones de interior de ambos genes de Borrelia pueden ser detectada por electroforesis en gel de agarosa.

nPCR es un enfoque elegante para aumentar la especificidad y la sensibilidad de detección de patógenos, sobre todo cuando muestras ambientales complejas están bajo investigación. Como se muestra en la figura 1, dos rondas de PCR dirigidos a una región estratégica de la Borrelia FlaB locus (y OspA, no en la foto) pueden reportar la presencia de la bacteria Borrelia burgdorferi mediante la generación de corto interno amplicones. Cuando resolvieron por electroforesis en gel, los productos de reacción FlaB y OspA de cada señal pueden ser visualmente anotó y Comparado con controles. En la figura 2, identificadores de ejemplar único se proporcionan a lo largo de la parte superior de cada gel y controles no-plantilla y aerosol están representados a la izquierda y derecha, respectivamente, junto a las escaleras.
Sólido amplicón bandas son claramente visibles en seleccionadas muestras experimentales, y se distinguen fácilmente de cartillas sobrantes y ADN residual (figura 2). Basado en los principios de diseño experimental establecidos, una garrapata se considera positiva para Borrelia cuando paralelo controles negativos no demuestran amplificación, y amplicones internos se producen de cartillas FlaB y OspA . En este caso, muestras T907 T604 y T606 cumplieron los criterios de vigilancia para el patógeno de Lyme (figura 2). By Contrast, T923 sólo era positivo para la OspA, un resultado que hay varias posibles explicaciones: A) la señal de origen era negativa para Borrelia, pero la preparación interior o exterior de la OspA PCR cifra estaba contaminada con ADN de plantilla (nota que contaminación sistémica de los reactivos fue eliminada mediante controles negativos), B) la garrapata lleva a Lyme Borrelia, pero cantidades bajas de la plantilla o error experimental previno amplificación del FlaB, o C) un organismo estuvo presente contiene la secuencia conservada de la OspA , pero carecía de flagelina o tenía identidad insuficiente en la región específica del FlaB a templar a los iniciadores. De hecho, las similitudes de secuencia OspA se han observado en una variedad de organismos, incluyendo animales y plantas28. La situación de converse, la amplificación de más conserva el gen de la flagelina , pero no el gen OspA , podría indicar una especie relacionada de Borrelia . En la práctica, este protocolo rinde más los resultados positivos solo de la OspA de los iniciadores del FlaB , sugiriendo que el escenario 'A' es la explicación menos probable de hacer. Sin más análisis experimental de la muestra discutible, sin embargo, no es posible determinar la fuente del resultado positivo solo. Aumentar el número de repeticiones técnicas en muestras ambiguas puede ayudar a reconciliar su estado verdadero, ya que cualquier contaminante que cifra se introdujeron a las reacciones anteriores no estaría presente en el ADN archivado. Sin embargo, si las reacciones posteriores con estos iniciadores no proporcionan resultados concluyentes, otros loci de Borrelia podían ser investigados por PCR. Amplicones generados a partir de estas reacciones también podrían ordenados y comparados entre aislamientos para ayudar a asignar identidad y estimar el grado de divergencia de la tensión. SAPI y sus colegas proporcionan un ejemplo de este flujo de trabajo utilizando muestras clínicas humanas35.
Todos los factores considerados, los criterios de protocolo e interpretación se han estimado a producir falsos positivas y falsas negativas tasas de 0.17% y 0.0063%, respectivamente.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> Figura 2 : Detección de Borrelia burgdorferi en garrapatas individuales por nPCR de FlaB y OspA. Códigos asignados a cada tick se representan en la parte superior de los geles y las identidades alinean verticalmente para reportar la detección de la OspA y michelines en cada muestra. Carriles derecho B a la izquierda de las imagen representan plantilla no los controles, mientras que un (carriles de mano derecha) son controles de aerosol para capturar la contaminación del medio ambiente de laboratorio. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

PCR anidada es una técnica sensible, específica y directa que se puede aplicar a garrapata que extractos de ADN para sonda de burgdorferi de Borrelia, el agente causativo de la enfermedad de Lyme. El experimento inicial de PCR utiliza cartillas gene-específicas para generar amplicones de largo, que luego se convierten en plantillas para una posterior reacción usando cebadores internos.

Detectar el Spirochete de la enfermedad de Lyme, Burgdorferi de Borrelia, de garrapatas mediante PCR anidado

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

17.9K vistas.  Mount Allison University. PCR anidada es una técnica sensible, específica y directa que se puede aplicar a garrapata que extractos de ADN para sonda de burgdorferi de Borrelia, el agente causativo de la enfermedad de Lyme. El experimento inicial de PCR utiliza cartillas gene-específicas para generar amplicones de largo, que luego se convierten en plantillas para una posterior reacción usando cebadores internos.

Video: Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Investigación

Inmunología e Infección

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was developed to detect the conserved region of the nucleoprotein (N) gene of lyssaviruses. The method applies reverse transcription (RT) using viral RNA as template and oligo (dT)15 and random hexamers as primers to synthesize the viral complementary DNA (cDNA). Then, the viral cDNA is used as a template to amplify an 845 bp N gene fragment in first-round PCR using outer primers, followed by second-round nested PCR to amplify the final 371 bp fragment using inner primers. This method can detect different genetic clades of rabies viruses (RABV). The validation, using 9,624 brain specimens from eight domestic animal species in 10 years of clinical rabies diagnoses and surveillance in China, showed that the method has 100% sensitivity and 99.97% specificity in comparison with the direct fluorescent antibody test (FAT), the gold standard method recommended by the World Health Organization (WHO) and the World Organization for Animal Health (OIE). In addition, the method could also specifically amplify the targeted N gene fragment of 15 other approved and two novel lyssavirus species in the 10th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) as evaluated by a mimic detection of synthesized N gene plasmids of all lyssaviruses. The method provides a convenient alternative to FAT for rabies diagnosis and has been approved as a National Standard (GB/T36789-2018) of China.

A pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction has been developed to detect specifically all known lyssaviruses. Validation using rabies brain samples of different animal species showed that this method has a sensitivity and specificity equivalent to the gold standard fluorescent antibody test and could be used for routine rabies diagnosis.

Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Genética

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

La alimentación de las garrapatas de los animales para Transmisión y xenodiagnóstico en Lyme Investigación de Enfermedades

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently reclassified into Borreliella, the relapsing fever (RF) group Borrelia, and a third reptile-associated group of spirochetes. Culture-based methods remain the gold standard for the laboratory detection of bacterial infections for both research and clinical work, as the culture of pathogens from bodily fluids or tissues directly detects replicating pathogens and provides source material for research. Borrelia and&#160;Borreliella spirochetes&#160;are fastidious and slow growing, and thus are not commonly cultured for clinical purposes; however, culture is necessary for research. This protocol demonstrates the methodology and recipes required to successfully culture LB and RF spirochetes, including all recognized species from B. burgdorferi s.l. complex including&#160;B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto&#160;(s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis, and B. miyamotoi. The basic medium for growing LB and RF spirochetes is the Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II or BSK-H) medium, which reliably supports the growth of spirochetes in established cultures. To be able to grow newly isolated Borrelia isolates from tick- or host-derived samples where the initial spirochete number is low in the inoculum, modified Kelly-Pettenkofer (MKP) medium is preferred. This medium also supports the growth of B. miyamotoi. The success of the cultivation of RF spirochetes also depends critically on the quality of ingredients.

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

In vitro culture is a direct detection method for the presence of living bacteria. This protocol describes methods for the culture of diverse Borrelia spirochetes,&#160;including those of the Borrelia burgdorferi sensu lato complex, relapsing fever Borrelia species, and Borrelia miyamotoi. These species are fastidious and slow growing but can be cultured.

Métodos de cultivo de espiroquetas de Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex y fiebre recidivante Borrelia

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This process has notably lower efficiencies in the Lyme disease spirochete relative to other, better-characterized Gram-negative bacteria. The rate of success of transformation is highly dependent upon having concentrated amounts of high-quality DNA from specific backgrounds and is subject to significant strain-to-strain variability. Alternative means for introducing foreign DNA (i.e., shuttle vectors, fluorescent reporters, and antibiotic-resistance markers) into B. burgdorferi could be an important addition to the armamentarium of useful tools for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. Bacteriophage have been well-recognized as natural mechanisms for the movement of DNA among bacteria in a process called transduction. In this study, a method has been developed for using the ubiquitous borrelial phage &#966;BB-1 to transduce DNA between B. burgdorferi cells of both the same and different genetic backgrounds. The transduced DNA includes both borrelial DNA and heterologous DNA in the form of small shuttle vectors. This demonstration suggests a potential use of phage-mediated transduction as a complement to electroporation for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. This report describes methods for the induction and purification of phage &#966;BB-1 from B. burgdorferi, the use of this phage in transduction assays, and the selection and screening of potential transductants.

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

The ability of bacteriophage to move DNA between bacterial cells makes them effective tools for the genetic manipulation of their bacterial hosts. Presented here is a methodology for inducing, recovering, and using &#966;BB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi, to transduce heterologous DNA between different strains of the Lyme disease spirochete.

Manipulación genética mediada por fagos de la enfermedad de Lyme Espiroqueta Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Inmunoensayo multiplex para IgG e IgM específicas de Borrelia en suero

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different antibody isotypes because they appear at different stages of the host immune response. With Lyme borreliosis, the pathogenic agent can be one of the multiple members of the Borrelia species. Therefore, correct sample classification requires evaluating the immunoreactivity against different antigens of different Borrelia species. Additionally, anti-pathogen IgG and IgM responses can have different elicitation time courses during disease progression. Here we demonstrate the development of a two-reporter multiplex immunoassay that has utility in identifying Borrelia-specific immune response in human serum samples by simultaneously evaluating both IgG and IgM immunoreactivity against different bacterial antigens in the same reaction well. This dual-reporter approach retains the analytical performance of single-reporter methods while conserving time and resources and reducing sample size requirements. This assay allows essentially double the serological information to be generated from a blood sample in half the time.

Autor destacado: Ampliación del alcance de los inmunoensayos multiplex para el diagnóstico de la borreliosis de Lyme y la investigación de patógenos 

A three-channel dual-reporter fluorescence flow analysis system was used to develop a bead-based multiplex immunoassay that simultaneously evaluates serum samples for IgG and IgM elicited against multiple antigens of different Borrelia species that cause Lyme borreliosis in Europe and North America.

Detección simultánea de diferentes clases de anticuerpos en una prueba serológica multiplexada

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Exposición humana a larvas de garrapatas para la investigación de enfermedades transmitidas por garrapatas

A Model for Experimental Exposure of Humans to Larval Ixodes scapularis Ticks

Tickborne diseases are a significant public health problem in the United States and worldwide. Ticks are obligate blood-feeding arthropods; an ixodid tick must remain attached to the skin of the host and complete its multi-day feeding process to acquire its blood meal. Exposing animals to ticks is a common practice for studying host responses to tick bites and tickborne diseases. We developed the procedure, conducted the first human research study, and published the findings on exposing human volunteers to uninfected larval Ixodes scapularis ticks. This article describes the methodology used to construct the containment dressing, how to apply and secure the ticks to the host, how to maintain the dressing, and how to remove the ticks from the host. Exposing volunteers to tick bites is an experimental procedure and must be performed under a clinical research protocol approved by the appropriate regulatory authorities. This method allows for translational research to better understand the human response to tick bites and foster the development of diagnostics, prevention, and therapies for tickborne diseases.

Autor destacado: Modelo de exposición humana controlada para la investigación de garrapatas y estudios sobre la enfermedad de Lyme

This article presents the methodology for exposing humans to larval Ixodes scapularis for clinical research. The technique is relatively simple, tolerable by the research volunteers, and can be modified according to experimental needs. Such research involving human subjects must be conducted under clinical study protocols approved by the appropriate regulatory authorities.

Un modelo para la exposición experimental de humanos a larvas de garrapatas Ixodes scapularis

Tickborne diseases are a significant public health problem in the United States and worldwide. Ticks are obligate blood-feeding arthropods; an ixodid tick ...

Detectar el Spirochete de la enfermedad de Lyme, Burgdorferi de Borrelia, de garrapatas mediante PCR anidado

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