Agradecemos a Michael VanNieuwenhze (Indiana University) por el don de las FDAAs en la figura 2 y figura 4. Agradecemos a los miembros del laboratorio de marrón para la retroalimentación durante la preparación de este manuscrito. Investigación en el laboratorio de marrón en la división y crecimiento de las células a. tumefaciens es apoyada por la National Science Foundation (IOS1557806).

1. crecimiento de las cepas de a. tumefaciens
<ol><li>
Cultivo de cepas de a. tumefaciens
	<ol>
<li>Utilice una punta de palillo o pipeta de madera estéril para inocular 1 mL de medio de crecimiento de ATGN (véase lista de materiales para la receta) con una sola Colonia de la cepa deseada. Nota: Para las cepas de a. tumefaciens agotamiento, el ATGN debe contener 1 mM IPTG como un inductor para mantener la biosíntesis de la proteína esencial.</li>
		<li>Crecen las cepas de a. tumefaciens noche en ATGN a 28 ° C con agitación a 225 rpm.</li>
		<li>Medir la densidad óptica de las células a 600 nm (OD600) utilizando un espectrofotómetro. Diluir el cultivo celular un OD600 = ~0.2 y continúan creciendo hasta OD600 = ~0.6 está alcanzado. Para cepas de agotamiento, seguir creciendo con inductor hasta OD600 = ~0.6 está alcanzado.</li>
		<li>Utilizar cepas de tipo salvaje y mutante de a. tumefaciens a OD600 = ~0.6 para el objetivo específico de tinción o Time-lapse microscopía (ver artículos 2 y 3.1). Para cepas de agotamiento, lavar el inductor (ver sección 1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eliminación del inductor para la caracterización de cepas de agotamiento de la proteína de a. tumefaciens
	<ol>
<li>1 mL de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente.</li>
		<li>Para lavar, eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en medio fresco sin inductor y sedimenten las células como se describe anteriormente (1.2.1). Lavar las células de un total de 3 veces en medios frescos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado final en medios frescos y concentrar las células a un OD600 = ~0.8 inmediata tinción con colorantes específicos objetivo (sección 2 y Figura 4B-D) o microscopía de Time-lapse (sección 3.2 y Figura 4A) . Alternativamente, la agotan las células para la cantidad de tiempo deseada por cultivo de células en medios sin inductor antes de la coloración y la proyección de imagen de las células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. objetivo específico de tinción de las células a. tumefaciens
<ol><li>
Etiquetado ácida d-amino fluorescente de la pared celular Nota: FDAAs son no tóxico fluorescentes d-aminoácidos que se incorporan fácilmente en el peptidoglicano de a. tumefaciens . Este sencillo procedimiento etiquetado sondas crecimiento patrones en células vivas6. Protocolos para la síntesis de cuatro FDAAs están disponibles38.<ol>
<li>500 μl de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa. Resuspender el precipitado de células en 100 μl de medio fresco.</li>
		<li>Añadir 5 μl de 5 mM FDAA para lavado y concentrado de células e Incube por 2 minutos en la oscuridad. Nota: Limitar FDAA exposición a la luz. El tiempo de incubación varía dependiendo de la tasa de crecimiento de la cepa. Normalmente, los tiempos de incubación deben ser 5-10% de la duplicación de tiempo6.</li>
		<li>Sedimenten las células por centrifugación y lavar el pellet celular con tampón fosfato salino (PBS) tres veces.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en 50 μl PBS. Nota: El volumen de PBS utilizados por resuspensión puede variar según tamaño de la pelotilla.</li>
		<li>Aplicar 0.8-1 μl de células a un colchón de agarosa y la imagen mediante microscopía de epifluorescencia inmediatamente (ver secciones 3.1 y 3.2).<ol>
<li>Como alternativa, dejar más incorporación de etiqueta mediante la fijación de las células con etanol al 70% helada. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de etanol al 70% helada e incubar en hielo por 15 minutos.</li>
			<li>Recoger las células por centrifugación y resuspender en un pequeño volumen de PBS para la proyección de imagen en un momento posterior. Almacenar suspensiones celulares a 4 ° C y de imagen dentro de 48 horas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ADN de tinción con DAPI o mancha naranja Nota: Observar ADN estructura, las células están marcadas con DAPI o naranja (tinción de células muertas). Aunque clásicamente se describe como una"muerte celular", la naranja es florescente, Fotoestables y no afecta el crecimiento de las células bacterianas, permitiendo a DNA de células vivas imágenes10. En a. tumefaciens, naranja Etiquetadoras obras bien en células vivas y es adecuados para microscopía Time-lapse (figura 3). En contraste, el ultravioleta (UV) exposición a la luz necesaria para la proyección de imagen células con tinción DAPI es fototóxica (figura 3) y tinción DAPI es más adecuado para la tinción de células vivas para la proyección de imagen inmediata o tinción de células fijas.<ol>
<li>La coloración de DAPI de células<ol>
<li>1 mL de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa.</li>
			<li>Opcionalmente, para fijar las células antes de la tinción, Resuspender el precipitado de células en 1 mL de etanol al 70% helada. Incubar en hielo durante 10-15 minutos recogen las células por centrifugación como se describen en 2.2.1.1.</li>
			<li>Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con 1 μl de la solución madre de DAPI (1 mg/mL; ver la Tabla de materiales). Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar durante 5 minutos en la oscuridad.</li>
			<li>Pellet de células por centrifugación a 7.000 x g durante 5 min y resuspender en 1 mL de PBS para eliminar exceso DAPI. Lavan las células dos veces más y resuspender el precipitado en 50 μl PBS o en los medios de comunicación.</li>
			<li>Aplicar 0.8-1 μl de células a un colchón de agarosa y la imagen mediante microscopía de epifluorescencia inmediatamente. Consulte las secciones 3.1 y 3.2. Nota: Este Protocolo no es óptimo para Time-lapse microscopia observar la dinámica del cromosoma (figura 3). Considere el uso de la coloración naranja como una alternativa (consulte la sección 2.2.2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloración naranja de células vivas</li>
		<li>1 mL de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con 1 μl de la solución madre naranja (véase lista de materiales). Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar por 5 min en la oscuridad.</li>
		<li>Pellet de células por centrifugación y resuspender en 1 mL de PBS para eliminar exceso naranja. Lavan las células dos veces más y resuspender el precipitado en 50 μl PBS.</li>
		<li>Aplicar 0.8-1 μl de células a un colchón de agarosa y la imagen mediante microscopía de epifluorescencia inmediatamente. Consulte las secciones 3.1 y 3.2. Nota: Este protocolo trabaja con células vivas y es adecuado para microscopía de lapso de tiempo observar la dinámica del cromosoma (figura 3). Si no es conveniente a la imagen inmediatamente, las células pueden fijarse en etanol al 70% helada (ver apartado 2.2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Membrana de etiquetado Nota: El tinte fluorescente styryl lipofílico 4-64 se ha utilizado extensivamente para observar la membrana de las células bacterianas. A diferencia de muchas bacterias, 4-64 con la etiqueta de las células a. tumefaciens no rotular uniformemente, pero algo con frecuencia exhiben un patrón de "Herradura"14,15. El polo de crecimiento es notable, casi desprovisto de manchas mientras que el polo viejo es intensamente marcado. 4-64 permite visualización de patrones de crecimiento celular y la estructura de la membrana en a. tumefaciens.<ol>
<li>Añadir FM 4-64 a una concentración final de 8 μg/mL en 1 mL de cultivo de células de la fase exponencial e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad.</li>
		<li>Pelotilla células marcadas por centrifugación a 7.000 x g durante 5 minutos en una centrifugadora de escritorio y resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS. Lavar las células de un total de tres veces para eliminar el exceso de tinte.</li>
		<li>Resuspender las células en un volumen pequeño de PBS y punto en una almohadilla de agarosa a la imagen inmediatamente. (Véanse las secciones 3.1 y 3.2) PRECAUCIÓN: Las células deben ser reflejadas inmediatamente para observar patrones característicos de etiquetado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. la proyección de imagen de las células a. tumefaciens
<ol><li>
Preparación del pad de agarosa Nota: La figura 1 contiene una secuencia de imágenes (panel A) y esquema (panel B) de una almohadilla de agarosa típica preparada para microscopía de Time-lapse. Cojines de agarosa se preparan normalmente según sea necesario.<ol>
<li>3.1.1. utilizar un cubreobjetos como guía y corte un 22 x 22 mm cuadrado de laboratorio de la película (véase lista de materiales) ejecutando un bisturí alrededor de los bordes.</li>
		<li>Cortar un cuadrado en el centro de la película de laboratorio dejando un ~ 2-5 frontera mm para servir como una junta para la almohadilla de agarosa. Deseche la abertura del centro.</li>
		<li>Coloque el empaque de película en un portaobjetos de vidrio (75 mm x 25 mm) limpiado con amoniaco y limpiador sin alcohol (véase lista de materiales) y calentar hasta que la película se derrita ligeramente sobre el vidrio (imagen de arriba en la figura 1A). Película de laboratorio del derretimiento, utilice el borde de un conjunto de bloque de calor a 70 ° C o derretir suavemente a la llama.</li>
		<li>Preparar la solución de agarosa mezclando ~0.075 g agarosa (véase lista de materiales) en 5 mL de medio en un matraz pequeño. Calentar la solución en un microondas con agitación periódica para mezclar hasta que la agarosa se disuelve y la solución es clara. Mantener la solución de agarosa en 55-70 ° C y usar para la construcción de múltiples pastillas de agarosa dentro de 48 horas.</li>
		<li>Media pipeta que contiene 1.2-1.5% agarosa en el centro de la Junta. Nota: El volumen de los medios de comunicación suele ser de 50-60 μL pero variará según el tamaño de la Junta. Agregar medios a una diapositiva de frío pueden causar la agarosa se solidifique demasiado rápidamente, así la diapositiva debe mantenerse sobre una superficie caliente. El borde de un bloque de calor situado a 70 ° C obras bien. Agarosa de agua o soluciones de agarosa tamponado como tamponada fosfato salino (PBS) pueden utilizarse en lugar de los medios de comunicación que contenga agarosa para aplicaciones en las que el crecimiento celular continua no es necesario. Para cepas de agotamiento de la proyección de imagen, puede ser inductor de presentes o ausentes en los medios de comunicación. Presencia del inductor puede utilizarse como un control, mientras que la ausencia del inductor revelará el fenotipo de agotamiento.</li>
		<li>Coloque un cubreobjetos sobre el empaque para distribuir uniformemente la agarosa.</li>
		<li>Colocar el portaobjetos sobre una superficie fría, solidificar para min ~ 2 Evite un secado excesivo de la almohadilla de agarosa como resultado una superficie rugosa en la agarosa y puesta en común de la suspensión de la célula cuando se aplica a la superficie.</li>
		<li>Deslice con cuidado el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa. PRECAUCIÓN: No se apresure este paso. La almohadilla de agarosa puede rasgar fácilmente y una almohadilla de agarosa desigual puede dificultar la proyección de imagen.</li>
		<li>Seque la almohadilla de la agarosa al aire durante 1-2 min a temperatura ambiente aparezca seca la superficie de la almohadilla. Con el bisturí, quitar una pequeña tira de agarosa para crear una bolsa de aire (imagen media, figura 1A); la bolsa de aire es típicamente ~ 2 x 7-10 mm y las células a. tumefaciens tienden a crecen mejor cerca de la bolsa de aire (figura 1). Nota: Para la proyección de imagen de células fijas o en condiciones donde el crecimiento no se controla, una bolsa de aire no es necesaria.</li>
		<li>Punto 0.8-1 μl de células sobre la almohadilla de la agarosa y la tapa con un cubreobjetos nuevo. Coloque con cuidado el cubreobjetos sobre la parte superior de la almohadilla de la agarosa para la distribución de las células a través de la superficie de la almohadilla de agarosa.</li>
		<li>Sellar los bordes del cubreobjetos con VALAP fundido (ver la Tabla de materiales para la receta; Figura 1A, imagen inferior). Para sellar a lo largo de los bordes y esquinas del cubreobjetos puede causar sequedad de la almohadilla de agarosa, que conducirá a la deriva de las células durante la proyección de imagen. Nota: Sólo es necesario sellado de cubreobjetos para la proyección de imagen de lapso de tiempo a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56497/56497fig1.jpg"> Figura 1: preparación de agarosa pad. (A) imagen secuencia del Protocolo de preparación del pad de agarosa. Imagen 1 es una diapositiva con el empaque de película de laboratorio. En la imagen 2, se visualizan la agarosa cojín y bolsa de aire. Finalmente, la imagen 3 muestra la plataforma completa agarosa con las células bajo un cubreobjetos y sella con VALAP. (B) un esquema de una almohadilla de agarosa para Time-lapse microscopía se proporciona. Principales características de la almohadilla de agarosa están marcadas en el esquema. (C) el bolsillo de aire promovió el crecimiento de a. tumefaciens sobre soportes de agarosa. Se muestran imágenes de las células de a. tumefaciens wildtype cultivadas en una almohadilla de agarosa durante 20 horas. Imágenes fueron tomadas en posiciones cada vez más distantes de la bolsa de aire. La distancia desde el borde más cercano de la imagen a la bolsa de aire se muestra por encima de cada imagen. Barra de escala = 10 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56497/56497fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2"><li>
La proyección de imagen Nota: Imágenes epifluorescencia, contraste de interferencia diferencial y contraste de fases se realiza con un microscopio invertido con enfoque automático basado en hardware, una etapa automatizada, filtros estándar, una fuente de luz LED, inmersión de aceite de 60 X objetivos (NA 1.4) para contraste de fase o de contraste de interferencia diferencial (DIC) y una 1K multiplicadores de electrón--dispositivo de carga acoplada (EMCCD) de la cámara. El microscopio debe colocarse en una sala de temperatura controlada. Alternativamente, puede utilizarse un escenario más cálido o cámara para mantener temperaturas constantes durante proyección de imagen.<ol>
<li>Microscopía de epifluorescencia Nota: Para imágenes de fluorescencia de células vivas, es necesario limitar el número de adquisiciones de la imagen y optimizar el tiempo de exposición para minimizar el fotoblanqueo y fototoxicidad. Para la proyección de imagen de cada tinte, es aconsejable encontrar un tiempo de exposición óptimo que proporciona detección de fluorescencia suficiente pero no lleva al fotoblanqueo o fototoxicidad. En las figuras 2-4, se utilizaron tiempos de exposición de 200 ms para todas las imágenes de fluorescencia. Para las secuencias de lapso de tiempo que se muestra en la figura 3, imágenes fueron adquiridas cada 10 minutos durante 3 horas.<ol>
<li>Colocar aceite de inmersión en el objetivo deseado y coloque el carro invertido en el soporte de diapositivas en el escenario. Utilice las perillas de enfoque para poner las células en el foco.</li>
			<li>Adquirir las imágenes de fase (o DIC) y el filtro de la fluorescencia deseada. Nota: Las máximas longitudes de onda de excitación y emisión para las manchas en la figura 2, figura 3y figura 4 son los siguientes: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), naranja (547/570).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Microscopía de Time-lapse Nota: Durante el Time-lapse microscopía las siguientes características son controlados por el ordenador: x, y y z filtros de posición, persianas y fluorescencia. Un sistema de enfoque automático basado en hardware es óptimo para mantener la atención durante la proyección de imagen de Time-lapse. Alternativamente, puede utilizarse un lazo basado en software de enfoque automático.<ol>
<li>Colocar aceite de inmersión en el objetivo deseado y coloque el carro invertido en el soporte de diapositivas en el escenario. Utilice las perillas de enfoque para poner las células en el foco.</li>
			<li>Opcionalmente: Adquirir múltiples (x, y) posiciones. Seleccionar al azar 10 campos de células en proximidad cercana a la bolsa de aire de los cojines de la agarosa.</li>
			<li>Puesta en marcha la adquisición de la secuencia de tiempo a la imagen en fase o CID en el intervalo de tiempo deseado. Nota: Para la secuencia Time-lapse que se muestra en la figura 4, DIC imágenes fueron adquiridas con la exposición de ms de 30 cada 10 minutos para las 14 h. Cuando utilice imágenes de fluorescencia durante el Time-lapse microscopia, ajuste el tiempo de exposición y el intervalo de adquisición para minimizar el fotoblanqueo y fototoxicidad.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo contiene una serie de procedimientos para la investigación de cepas de tipo salvaje, mutante y el agotamiento de a. tumefaciens . Cabe destacar que todos los procedimientos enumerados en la sección de protocolo pueden ser fácilmente adaptados para otras cepas bacterianas con modificaciones adicionales para tener en cuenta medios de cultivo, temperaturas y tasas de crecimiento.
El uso de colorantes específicos del destino es una valiosa herramienta para proporcionar ...

Progresión a través del ciclo de la célula bacteriana requiere la coordinación de muchos procesos incluyendo biosíntesis de membrana y pared celular, replicación del DNA y la segregación y división celular. Para entender completamente la complejidad de la biología de la célula bacteriana, es necesario estudiar estos acontecimientos esenciales; sin embargo, se trata de una tarea no trivial ya que la viabilidad celular se ve comprometida cuando componentes clave de estos caminos son mutagenized. Microscopía de epifluorescencia juntada con colorantes específicos del destino es un enfoque poderoso para estos procesos esenciales en el tipo salvaje y mutante de cepas bacterianas.
Colorantes específicos de peptidoglicano son fluorescentes antibióticos (vancomicina-FL, bocillin-FL) y fluorescente-d-amino ácidos (por ejemplo, 7-hidroxicumarina-3-carboxílico ácido-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanina; TADA). En bacterias Gram positivas, el uso de concentraciones subletales de fluorescentes antibióticos análogos a los sitios de la biosíntesis del peptidoglicano de la sonda ha sido una estrategia efectiva para revelar peptidoglicano patrones de inserción de1,2, 3,4. Mientras que el etiquetado fluorescente vancomicina se ha utilizado para ganar penetraciones en el peptidoglicano patrones de inserción en bacterias Gram-negativas fija5, la membrana externa proporciona generalmente una barrera de permeabilidad que impide el uso de fluorescentes antibióticos como sonda para la biosíntesis de peptidoglicano en células vivas. Por el contrario, pulsos cortos de fluorescente d-aminoácidos o d-aminoácidos con grupos funcionales de biorthogonal covalente etiqueta regiones de reciente inserción de peptidoglicano en una amplia gama de vida las células bacterianas6,7. Patrones de inserción de peptidoglicano que se han observado con los d-aminoácidos sintéticos incluyen punteado y septal (Escherichia coli y Bacillus subtilis), polar y septal (Agrobacterium tumefaciens y Listeria monocytogenes), sólo septal (Staphylococcus aureus) y apical (Streptomyces venezuelaa)6,7. Estas observaciones indican que las bacterias exhiben diversos patrones de la biogénesis de la pared celular y que el uso de sintéticos d aminoácidos como sondas para examinar los patrones de crecimiento es una estrategia valiosa en muchas bacterias.
Tintes que etiquetar los cromosomas bacterianos incluyen la carpeta de surco menor específicos de ácido desoxirribonucleico (ADN) (4, 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) y colorantes de Cianina de alta afinidad (verde y naranja; vea la lista de materiales). La coloración de DAPI de células fijas ayuda a enumeración de bacterias a partir de muestras ambientales8, mientras que la coloración de DAPI de células vivas se utiliza para indicar la viabilidad bacteriana9. En cambio, colorantes de Cianina como naranja y verde son frecuentemente descritos como células "muertas" impermeant membrana manchas para enumerar las células no viables9. Sorprendentemente, cuando estos reactivos se utilizan para sondar la morfología del nucleoide bacteriano durante el crecimiento de la célula, DAPI, naranja y verde todos mostraron ser membrana florescente y capaz de etiquetado células vivas10. En vivo las células de e. coli , la coloración de DAPI de ADN aparece difusa debido a auto fluorescencia del citoplasma y exposiciones repetidas de células con tinción DAPI a luz ultravioleta (UV) perturba la estructura nucleoide del10. Tinción e. coli o B. subtilis con naranja revela que este tinte es membrana florescente y proporciona fluorescencia de larga duración sobre la Unión al ADN en células vivas sin afectar el crecimiento de la célula, replicación del ADN o cromosoma segregación10 . Estas observaciones sugieren que colorantes de Cianina ADN pueden utilizarse para controlar la morfología de nucleoids durante el crecimiento celular de muchas bacterias.
Phospholipid-specific stryl tintes como N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibromuro de pyridinium (4-64; véase la lista de materiales) son compuestos catiónicos y asociar preferentemente con carga negativa fosfolípidos como la cardiolipina y fosfatidilglicerol11. Se observan patrones distintos al 4-64 se utiliza para etiquetar la membrana de bacterias diferentes. En Escherichia coli, 4-64 se enriquece en los polos, en bandas a lo largo de la pared lateral y en los sitios de la división de pre-divisional células de12. En Bacillus subtilis, 4-64 etiquetado permite la visualización de lípidos espirales13. En Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiquetas la membrana externa y se observa un patrón característico "Herradura" en el que el polo de crecimiento carece de etiquetado14,15. Estas observaciones indican que estas bacterias exhiben distribuciones lípido heterogéneo debido a la presencia de los dominios de lípidos que contribuyen a la asimetría celular. Cambios en los patrones Etiquetadoras 4-64 como la presencia de las etiquetas difusas, las ampollas o vesículas, invaginaciones o contracción de la membrana puede ser informativa en la caracterización de mutantes que afectan a la distribución o la biosíntesis de lípidos.
Más allá de la coloración de las células, es necesario determinar la función de las proteínas que participan en los procesos esenciales. La caracterización de las proteínas esenciales es un desafío técnico porque no es posible eliminar genes esenciales y estudiar las consecuencias fenotípicas. Así, han surgido enfoques alternativos que agotan la proteína. Por ejemplo, un gen esencial se puede poner bajo el control de un promotor inducible en lugar de su promotor nativo. Promotores inducibles son sensibles a moléculas pequeñas tales como; Isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG)17,18,19,20,21, arabinosa22,16, vanillate17,23, de zinc y así la transcripción del gen objetivo deja de xilosa23, y la proteína de interés se agota cuando se retira el inductor. Enfoques alternativos para el agotamiento de proteínas esenciales de interés incluyen riboswitches sintético24 que utiliza las interacciones ARN molécula pequeña para impedir la transcripción de genes diana, CRISPR interferencia25,26 a bloque de transcripción de genes diana y proteína inducible degradación27,28 que utiliza etiquetas de péptidos a las proteínas de la blanco para la degradación por la proteasa de ClpXP. Cepas de agotamiento proporcionan solamente un a corto plazo para la caracterización antes de que las células pierden viabilidad, por lo tanto, la proyección de imagen microscópica de células en el tiempo durante el agotamiento de la proteína es un potente enfoque para la caracterización. De hecho, microscopía de células bacterianas vivas ha permitido a los investigadores a ganar penetraciones en los procesos biológicos fundamentales, incluyendo los mecanismos de mantenimiento de forma celular, secreción y compartimentación29.
A. tumefaciens es un patógeno de planta bacteriana30 e ingeniero genético natural31,32. Así, los mecanismos relacionados con la patogenicidad, incluyendo huésped-patógeno interacciones33,34,35, secreción36y host transformación30,31, 37 han sido ampliamente investigados. Para diseñar estrategias que prevención la enfermedad de a. tumefaciens mediada o aumentar la planta de transformación, los procesos esenciales para la supervivencia de a. tumefaciens deban entenderse mejor. El uso de colorantes específicos del destino y el reciente desarrollo de una estrategia de agotamiento de la proteína de a. tumefaciens18 proporciona un medio para investigar los procesos esenciales.
Aquí, cuentan con protocolos detallados para el análisis microscópico de cepas de tipo salvaje y mutante proteína agotamiento de a. tumefaciens . Los dos primeros protocolos describen cómo preparar las células y etiquetarlos con colorantes específicos del destino. El tercer Protocolo proporciona instrucciones paso a paso para preparar pastillas de agarosa (figura 1) y proyección de imagen las células bacterianas (figura 2, figura 3, figura 4). Estos protocolos también pueden ser adecuados para otras bacterias con adaptaciones adicionales para tener en cuenta las condiciones de los diferentes medios de comunicación, las tasas de crecimiento, requerimientos de oxígeno y estructuras celulares.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58</td><td>ATCC</td><td>33970</td><td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. J Bacteriol 123:255-264.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58&amp;Delta;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-&lt;em&gt;ctrA &amp;Delta;ctrA&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATGN Minimal Medium</td><td></td><td></td><td>To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 &amp;deg;C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.</td></tr><tr><td>20X AT Buffer</td><td></td><td></td><td>Add 214 g/L KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>20X AT Salts</td><td></td><td></td><td>Add 40 g/L (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 3.2 g/L MgSO4&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and 0.024 g/L MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to water. Autoclave.</td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>A701</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Chemical</td><td>M114</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16</td><td>Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423</td><td>Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Optional Media Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>GoldBio</td><td>K-120</td><td>Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C5</td><td>Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550D</td><td>25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Sparkle Glass Cleaner</td><td>Home Depot</td><td>203261385</td><td>Ammonia and alcohol free.</td></tr><tr><td>Ultra Pure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td>Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399500</td><td>10X solution to be diluted to 1X with sterile water.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.</td></tr><tr><td>VALAP</td><td></td><td></td><td>Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 &amp;deg;C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.</td></tr><tr><td>Lanolin Butter</td><td>SAAQIN</td><td>SQ-LAB-R1</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Target Corp.</td><td>06-17644</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Crafty Candles</td><td>263012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Target-specific dyes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Use to dilute stock solutions of dyes as needed.</td></tr><tr><td>FDAAs (NADA, HADA,TADA)</td><td></td><td></td><td>FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry bath</td><td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td><td>52120-200</td><td></td></tr><tr><td>Metallic thermal beads</td><td>Lab Armor</td><td>42370-002</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera</td><td></td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.</td></tr></tbody></table>

live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth

Los procesos celulares básicos como la replicación del ADN y segregación, la síntesis de proteínas, biosíntesis de la pared celular y división celular dependen de la función de proteínas que son esenciales para la supervivencia bacteriana. Una serie de objetivos específicos de colorantes puede utilizarse como sondas para mejor entienden estos procesos. Tinción con colorantes lipófilos permite la observación de la estructura de la membrana, visualización de microdominios lipídicos y la detección de las ampollas de la membrana. Uso de fluorescentes d-aminoácidos (FDAAs) a los sitios de la biosíntesis del peptidoglicano de la sonda puede indicar posibles defectos en la biogénesis de la pared celular o patrones de crecimiento de la célula. Por último, las manchas de ácido nucleico pueden indicar posibles defectos en la segregación de replicación o cromosoma de ADN. ADN de Cianina manchas etiqueta viven las células y son conveniente para Time-lapse microscopía permite observaciones en tiempo real de morfología nucleoid durante el crecimiento de la célula. Protocolos para el etiquetado de células pueden aplicarse a mutantes de agotamiento de la proteína para identificar defectos en la estructura de la membrana, la biogénesis de la pared celular o la segregación cromosómica. Además, Time-lapse microscopia puede utilizarse para monitorizar los cambios morfológicos como una proteína esencial se elimina y puede proporcionar perspectivas adicionales en función de la proteína. Por ejemplo, el agotamiento de proteínas esencial división celular produce filamentación o ramificación, mientras que el agotamiento de proteínas de crecimiento celular puede causar células llegar a ser más corto o más redondos. Aquí, los protocolos para el crecimiento de la célula, específico del destino etiquetado y microscopía de Time-lapse se proporcionan para el patógeno de la planta bacteriano tumefaciens de la agrobacteria. Juntos, tintes específicos del destino y Time-lapse microscopia permiten caracterización de procesos esenciales en a. tumefaciens. Por último, los protocolos proporcionados pueden modificarse fácilmente para probar procesos esenciales en otras bacterias.

Objetivo específico de tipo salvaje Las células de a. tumefaciens Para ilustrar esa morfología de la célula no se ve afectada por los pasos de lavado o tratamiento con DMSO 1% (que se utiliza para diluir los tintes fluorescentes), las células fueron imágenes directamente de la cultura (figura 2A, panel izquierdo), después de lavar las células por centrifugación como se describe en 1.2 (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth at JoVE.com

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Es difícil entender la función de los procesos esenciales en bacterias. Microscopía de fluorescencia con objetivo específicos de colorantes puede proporcionar ideas claves en la progresión de crecimiento y el ciclo celular la célula microbiana. Aquí, Agrobacterium tumefaciens se utiliza como una bacteria modelo para resaltar los métodos de proyección de imagen de células vivas para la caracterización de los procesos esenciales.

Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

live-cell-fluorescence-microscopy-to-observe-essential-processes

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K vistas.  University of Missouri. Es difícil entender la función de los procesos esenciales en bacterias. Microscopía de fluorescencia con objetivo específicos de colorantes puede proporcionar ideas claves en la progresión de crecimiento y el ciclo celular la célula microbiana. Aquí, Agrobacterium tumefaciens se utiliza como una bacteria modelo para resaltar los métodos de proyección de imagen de células vivas para la caracterización de los procesos esenciales.

Video: Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Investigación

Inmunología e Infección

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Investigación sobre el cáncer

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

Imágenes en vivo de la célula de fluorescencia de ciclo completo de células vegetativas de la lento-crecimiento Social bacteria Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Bioquímica

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biología

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Visualización cinética de interacciones bacterianas entre especies de una sola célula

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

Resumen

Explorar más videos

PLAYLIST