El objetivo general de este experimento es identificar marcadores moleculares útiles para los carcinomas sinonasales y los neuroblastomas olfativos de una manera simple y eficiente. Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo del neuroblastoma olfativo y el carcinoma sinonasal, como la identificación de marcadores moleculares para discriminar el subtipo tumoral. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener resultado en menos de seis horas, o dentro de un día para el informe del hospital.
Demostrando el procedimiento de extracción de ARN y PCR en tiempo real será la Dra. Giorgia Millefanti, estudiante de doctorado de mi laboratorio. Y demostrando el procedimiento de inmunohistoquímica será Giovanni Micheloni, también estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar el procedimiento, recopile y divida todas las muestras de FFPE humanas en diferentes subgrupos, de acuerdo con la clasificación de la OMS de tumores de cabeza y cuello.
Calienta los toboganes de muestras en un horno a 60 grados Centígrados durante 30 minutos. A continuación, rehidrate las secciones de FFPE de tres micrómetros de espesor lavándolas brevemente en xileno durante 10 minutos. A continuación, lave los portaobjetos en 100%95%85% y 75% alcohol en serie durante cinco minutos cada lavado.
Enjuague los portaobjetos durante cinco minutos en agua destilada. Posteriormente, bloquee la actividad endógena colocando las diapositivas en peróxido de hidrógeno acuoso al 3% durante 12 minutos. Después, realice la recuperación de antígenos mediante el tratamiento de las diapositivas con 10 tampón de citrato mililolar y el microwaving durante 10 minutos.
Después de 10 minutos, lave las secciones en el búfer TBS. Luego, agrega el 0,2% de Tritón X, e incubarlos durante la noche a cuatro grados Celsius, con Goat Anti-Human OTX2 Anticuerpo, diluido en una proporción de 1 a 100. Al día siguiente, añadir anticuerpo secundario anti cabra de conejo biotinilado, diluido a 1 a 200, e incubar las secciones durante una hora a temperatura ambiente.
A continuación, trate las muestras con el complejo de peroxidasa ABC. Después, desarrollar la inmunoreacción usando tetrahidrocloruro de diaminobenceno, y contrarrestar manchar los núcleos con Hematoxilina Harris. A continuación, deshidratar las secciones en una escala de alcohol de media luna, y aclararlos en una sustancia despeje de origen turpine.
A continuación, monte las secciones en una diapositiva con medio de montaje. Después de la extracción de ARN y la transcripción inversa, realice análisis cuantitativos de PCR en tiempo real con tecnología basada en sondas y un ciclor térmico. Prepare la mezcla de reacción PCR utilizando 12,5 microlitros de mezcla maestra basada en sondas, 1,25 microlitros de cada sonda OTX1, OTX2 y ACTB, 50 nanogramos de CDNA y agua sin nucleasas de hasta 25 microlitros de volumen total.
Realizar todas las reacciones en triplicado utilizando el gen ACTB como control endógeno para normalizar los niveles de expresión génica. A continuación, centrifugar la placa a 1109 veces la gravedad durante tres minutos. A continuación, guarde la placa protegida de la luz a cuatro grados centígrados, hasta el experimento.
Para realizar PCR en tiempo real, coloque las muestras en la máquina. A continuación, establezca el perfil del ciclor térmico con un ciclo de inicio caliente inicial en 50 grados Celsius durante dos minutos, y 95 grados Celsius durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 grados Celsius durante 15 segundos y un ciclo final a 60 grados Celsius durante un minuto. Para el análisis del nivel de expresión génica, normalice los niveles de expresión génica a través del método de umbral de ciclo comparativo utilizando el gen ACTB como control endógeno.
Evalúe los niveles de expresión génica utilizando el método de umbral de ciclo comparativo y trace los resultados. A continuación, realice análisis estadísticos utilizando la prueba t del estudiante, teniendo en cuenta resultados estadísticamente significativos con p
La expresión nuclear de OTX1 se encontró en todas las muestras de adenocarcinoma de tipo no intestinal, mientras que la inmunorreactividad es pequeña o ausente se destacó en adenocarcinomas de tipo intestinal. La inmunoreactividad intensa estuvo presente en todos los neuroblastomas olfativos. Entre todos los carcinomas neuro-endocrinos mal diferenciados, la expresión OTX varió en intensidad y porcentaje de células positivas.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar cada paso de la extracción de ARN en condiciones estériles utilizando también equipos estériles. Paralelamente a este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de rayos X, el examen endoscópico de la cavidad nasal, la tomografía computarizada, la resonancia magnética y la biopsia, para confirmar los resultados obtenidos de nuestra técnica. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran esta enfermedad en modelos celulares.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo identificar marcadores moleculares para discriminar los subtipos tumorales utilizando la inmunohistoquímica y PCR en tiempo real. No olvide que trabajar con estos reactivos, instrumentación y muestras puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como DPI al realizar estos procedimientos.
