Este trabajo fue financiado en parte por el proyecto para el desarrollo de la investigación innovadora en Cancer Therapeutics (P-directo) (15cm0106102h0002, K.M.) y el proyecto para la investigación del cáncer y la evolución terapéutica (P-crear) (16cm 01061150001, K.M.) de Japón Agencia para la investigación médica y el desarrollo, AMED; la Fundación de ciencia de Takeda (Y.M.); Beca del fondo de investigación del cáncer de princesa Takamatsu (13-24520, Y.M.); y JSP KAKENHI número JP16K07133 (Y.M.).

1. reactivo configuración
<ol><li>
Reactivos utilizados para la sincronización de la célula
	<ol>
<li>Para generar el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene timidina de 2,5 mM, disolver 30,28 mg de timidina por 1 mL de agua grado de cultivo de tejidos para preparar timidina 125 mM. Filtrar la solución con una unidad de filtro 0,22 μm jeringa. Añadir 1 mL de timidina recién preparada 125 mM por 50 mL de DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 10% (vol/vol).</li>
		<li>Para generar el DMEM que contenía 0,1 μg/mL de nocodazole, disolver nocodazole en dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar 5 nocodazole μg/μL. Añadir 1 μl de 5 μg / μl nocodazole por 50 mL de DMEM suplementado con 10% FBS (vol/vol).</li>
		<li>Para generar el DMEM que contenía 0.002% (vol/vol) de DMSO, añadir 1 μl de DMSO por 50 mL de DMEM suplementado con 10% FBS (vol/vol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reactivos para análisis de RdRP IP
	<ol>
<li>Preparar lysis buffer A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) y el 0.5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Almacenar el reactivo a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 5 x buffer acetato: ácido 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic 50 mM (HEPES)-KOH (pH 7.8), acetato de potasio de 500 mM y 20 mM de MgCl2. Almacenar el reactivo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar el tampón de acetato de 1: 1 x de tampón de lavado, glicerol al 10% (vol/vol), 0.1% (vol/vol) Triton X-100 y 0.06 x inhibidor de la proteasa coctel, ácido ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-libre. Preparar el tampón de lavado 1 día de uso o el día antes de su uso. Almacenar el reactivo a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar solución AGC: 1 x de tampón de acetato, glicerol al 10% (vol/vol) y 0,02% (peso/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimetilamonio] -1-propanesulfonat (caps). Almacenar el reactivo a 4 ° C.</li>
		<li>Para generar la solución AGC que contiene 2 mM CaCl2, añadir 100 μl de 1 M de CaCl2 por 50 mL de solución AGC. Almacenar el reactivo a 4 ° C.</li>
		<li>Para generar la solución AGC que contiene bis de glicol de etileno de 3 m m (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido tetraacético (EGTA), añadir 375 μl de 0,4 M EGTA (pH 7.5) 50 mL de solución AGC. Almacenar el reactivo a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar el tampón de acetato de 2: 1 x de tampón de lavado y grietas del 0,02% (peso/vol). Almacenar el reactivo a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar la solución de la HMD: 0.2 M HEPES-KOH (pH 7.8), 40 mM de MgCl2 y 2 mM Ditiotreitol (DTT). Almacenar el reactivo a-20 ° C. Nota: Solución HMD debe renovarse al menos en tres meses.</li>
		<li>Preparar 2 x proteinasa K buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA y 1% (peso/vol) sodio dodecil sulfato (SDS). Almacenar el reactivo a-20 ° C.</li>
		<li>Preparar 2 x de buffer de carga: 95% (vol/vol) formamida, 20 mM EDTA y 1% (peso/vol) G. naranja almacenan el reactivo a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de las células HeLa
Nota: Preparar las células HeLa sincronizada en fase mitótica (manipulado) o dividiendo de forma asincrónica (unmanipulated). Cultura de las células en presencia de 5% CO2 a 37 ° C.
<ol><li>
Sincronización de células HeLa en mitosis
	<ol>
<li>Placa de 1 x 106 células HeLa con 10 mL de DMEM suplementado con 10% (vol/vol) FBS en una placa de cultivo de 10 cm.</li>
		<li>Dos días después de la galjanoplastia, sustituir el medio con 10 mL de DMEM que contenía timidina de 2,5 mM y 10% FBS (vol/vol). Cultura de las células durante 24 h.</li>
		<li>Lavar las células 3 veces con 10 mL de tampón fosfato salino (PBS) (-) y las células con 10 mL de DMEM con 10% (vol/vol) FBS para 6 h de la cultura.</li>
		<li>Reemplazar el medio con 10 mL de DMEM que contiene 0.1 μg/mL de nocodazole y 10% (vol/vol) FBS y las células por 14 h la cultura.</li>
		<li>Agitar suavemente la placa de cultivo y recuperar el sobrenadante que contiene las células mitotic separadas. Contar el número de células para el ensayo de RdRP de IP.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 490 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Nota: El precipitado de células puede ser almacenado a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de células HeLa unmanipulated
	<ol>
<li>Placa de 1 x 106 células HeLa con 10 mL de DMEM suplementado con 10% (vol/vol) FBS en una placa de cultivo de 10 cm.</li>
		<li>Dos días después de la galjanoplastia, sustituir el medio con 10 mL de DMEM con 10% FBS (vol/vol). Las células de 30 h de la cultura.</li>
		<li>Reemplazar el medio con 10 mL de DMEM que contenía 0.002% (vol/vol) DMSO y el 10% (vol/vol) FBS y las células por 14 h la cultura.</li>
		<li>Recoger las células mediante tripsinización 0,7 ml de tripsina (2,5 g/L) que contiene 1 mM EDTA. Contar el número de células para el ensayo de RdRP de IP.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 490 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Nota: El precipitado de células puede ser almacenado a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP-RdRP ensayo
<ol><li>Preparación de grano de proteína A-agarose
	<ol>
<li>Transferir 1 mL (cama volumen 500 μl) de la resina de afinidad a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a 800 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 800 μl de tampón de lisis A los granos y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugue a 800 x g durante 3 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Repita este paso dos veces (total tres lavados).</li>
		<li>Añadir 800 μl de tampón de lisis A los granos, mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Gire el tubo durante la noche (o por lo menos 4 h) a 4 ° C en un agitador rotatorio.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 800 x g durante 3 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 500 μl de tampón de lisis A los granos y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Almacenar los granos a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de lisado de célula
	<ol>
<li>(Opcional) Si las células se congelan en el paso 2 y descongelar las células congeladas en el hielo hasta que las células queden sueltas.</li>
		<li>Lavar las células una vez con 10 mL de PBS (-). Centrifugar la muestra a 1.450 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Lyse las células con buffer de lisis helada (1 mL de tampón de lisis A por 1 x 107 de las células) mediante pipeteo suave.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos la muestra en un tubo de 1,5 mL con las siguientes condiciones; amplificación del sonicador en 25% y someter a ultrasonidos para 10 s.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 20.400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante. Transferir 1 mL del sobrenadante a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. PRECAUCIÓN: Realice todos los procedimientos en condiciones libres de Rnasa.</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunoprecipitación
	<ol>
<li>Pre-claro el lisado de paso 3.2.6 añadiendo 40 μl (grano volumen 20 μl) de perlas de agarosa A proteína prelavada por 1 mL de lisado. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces y rotar la muestra durante 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 13.000 x g durante 1 min a 4 ° C y recuperar el sobrenadante.</li>
		<li>Agregar 40 μl (cama volumen 20 μl) de proteína prelavada A-agarose granos y 10 μg de anticuerpo anti-humana terc (clon: 10E9-2)8 en el previamente despejado lisado. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces y rotar la muestra a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar los granos con tampón de lavado 1: Añada 1 mL de tampón de lavado 1 a las cuentas, mezclar bien por inversión del tubo y girar la muestra durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Repita este paso tres veces más.</li>
		<li>Lavar los granos una vez con solución AGC que contiene 2 mM CaCl2: Añadir 1 mL de solución AGC 2 mM CaCl2 para los granos, mezclar bien por inversión del tubo y girar la muestra durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Tratamiento de los granos con nucleasa Micrococcal (MNase): preparar la mezcla de reacción de MNase se describe en la tabla 1. Resuspender los granos en 60 μL de la mezcla de reacción de MNase mediante pipeteo suave. Agitar suavemente la muestra (20 a 25 rpm) en un plato de una shaker en una incubadora de tipo Peltier durante 15 min a 25 ° C. Nota: Es muy importante utilizar un vibrador ondulado y siga estrictamente el límite de velocidad en este paso. Otro tipo de agitadores, como mezcladores rotatorios, no se recomienda.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar los granos dos veces con solución AGC que contiene 3 mM EGTA: Añadir 1 mL de solución AGC 3 mM EGTA a los granos, mezclar bien por inversión del tubo y girar la muestra durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Repita este paso una vez.</li>
		<li>Lavar los granos una vez con tampón de lavado 2: Añadir 1 mL de tampón de lavado 2a los granos, mezclar bien por inversión del tubo y girar la muestra durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Mantener los granos en el hielo mientras la reacción de RdRP. PRECAUCIÓN: Realice todos los procedimientos en condiciones libres de Rnasa.</li>
	</ol></li>
	<li>Reacción de la RdRP
	<ol>
<li>Preparar una mezcla de reacción de RdRP en un nuevo tubo tal como se describe en la tabla 2.</li>
		<li>Añadir 6 μl de [α -32P] UTP (3.000 Ci/mmol) para la mezcla y mezcle bien por pipeteo. Nota: ATP [α -32P], [α -32P] CTP y GTP [α -32P] puede ser utilizado para la reacción en lugar de [α -32P] UTP.</li>
		<li>Añadir 1 μl de plantilla de RNA (1 μg/μl) a la mezcla y mezcle bien por pipeteo. Nota: Para establecer el ensayo de RdRP, se recomienda la siguiente plantilla de RNA: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Resuspender los granos con 20 μl de la mezcla de reacción de RdRP de paso 3.4.3 mediante pipeteo.</li>
		<li>Agitar suavemente la muestra (20 a 25 rpm) en un plato de una shaker en una incubadora de tipo peltier por 2 h a 32 ° C.</li>
		<li>Añadir 5,4 μL de proteinasa K (20 mg/mL) y 45,4 μL de tampón de proteinasa K de x 2 a la mezcla de reacción. Mezclar mediante pipeteo y agitar (20 a 25 rpm) de la muestra sobre un plato giratorio en una incubadora de tipo Peltier durante 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Añadir 109,2 μl de agua libre de ARNasa a la muestra.</li>
		<li>Añadir 200 μL de ácido fenol-cloroformo a la muestra. Mezclar por vortex y centrifugar luego la muestra en 21.100 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo. Repita este paso una vez.</li>
		<li>Añadir 20 μl de acetato de sodio de 3 M (pH = 5.2), 4 μL de portador de precipitación y 250 μl de etanol en la fase acuosa. Agitar el tubo para mezclar, a continuación, centrifugar la muestra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar el sedimento con 300 μL de etanol frío al 70% (vol/vol) almacenado a-20 ° C. Centrifugar la muestra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y secar el pellet. PRECAUCIÓN: Realice todos los procedimientos en condiciones libres de Rnasa. Nota: El precipitado del paso 3.4.11 puede almacenarse a-20 ° C durante al menos 2 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento de la ARNasa
	<ol>
<li>Resuspender el precipitado de paso 3.4.11 en 20 μl de agua libre de ARNasa.</li>
		<li>Preparar una mezcla de reacción Rnasa en un nuevo tubo tal como se describe en la tabla 3.</li>
		<li>Añadir 180 μl de la mezcla de reacción Rnasa a la muestra e incubar el tubo durante 2 h a 37 ° C.</li>
		<li>Agregar 2.3 μl de SDS 10% (vol/vol) de la muestra e incubar por 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Añadir 2 μl de proteinasa K (20 mg/mL) a la muestra e incubar por 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Añadir 205 μl de ácido fenol-cloroformo a la muestra. Luego, mezclar por vortex, Centrifugue la muestra a 21.100 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.</li>
		<li>Añadir 20 μl de acetato de sodio de 3 M (pH 5,2), 4 μL del portador de la precipitación y 250 μl de etanol en la fase acuosa. Agitar el tubo para mezclar, a continuación, centrifugar la muestra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar el sedimento con 300 μL de etanol frío al 70% (vol/vol) almacenado a-20 ° C. Centrifugar la muestra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y secar el pellet. Nota: El precipitado del paso 3.5.9 puede almacenarse a-20 ° C durante al menos 2 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Autorradiografía y electroforesis en gel de
	<ol>
<li>Resuspender la muestra con 20 μl de agua libre de ARNasa.</li>
		<li>Añadir 20 μl de 2 x de buffer de carga.</li>
		<li>Hervir la muestra 10 min a 95 ° C. Triturar la muestra en el hielo.</li>
		<li>Correr el gel. En caso de que el tamaño de la plantilla es 34 nts (véase también paso 3.4.3), gel de poliacrilamida al 7 M Urea - 10% se utiliza para desnaturalizando electroforesis del gel.</li>
		<li>Secar el gel con un secador de gel.</li>
		<li>Exponer la película al gel de secado dentro de un cassette de rayos x con una pantalla de intensificación a-80 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
<li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li>
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<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de RdRP de IP es un método sensible para detectar actividad RdRP de terc humana. TERC proteína se expresa altamente en células de HeLa mitóticas, en que terc forma el RdRP complejo8,9,10. Esto sugiere que las células de HeLa mitotic son un material óptimo para detectar actividad RdRP. En el protocolo descrito anteriormente, las células HeLa mitotic y asíncrono se incluyen como un positivo y un ejemplo negativo, respectivamente. Como se muestra en la figura 1A, RdRP productos de análisis de la plantilla recomendada de RNA en células HeLa mitotic mostrar señales radioactivas amplias entre 20 a 30 nt. Además de las células HeLa, hemos realizado el ensayo con diferentes tipos de líneas celulares y encontró que se puede cambiar el patrón de señal en la célula diferentes tipos9: algunos muestran una señal fuerte sólo alrededor de 30 nt, algunos muestran un patrón similar con células HeLa. Han realizado también el ensayo con las plantillas del RNA que no sea el 34 nt plantilla8, corta y larga (~ 300 nt) ARNs con secuencias distintas y con éxito RdRP productos obtenidos de las plantillas aunque puede haber cierta preferencia. Para el primer ensayo, sin embargo, se recomienda utilizar células HeLa en fase mitótica y la plantilla de nt RNA 34. RdRPs puede generar ARN bicatenario en un cartilla-dependiente y en una forma independiente de la cartilla11. Nos han informado que terc conserva esta propiedad como humano RdRP7,9; TERC sintetiza dsRNA de una plantilla de RNA 3'-foldback estructura a través de un mecanismo de cebado de espalda7. Para la plantilla de nt RNA 34, terc sintetiza filamentos complementarios sin utilizar primers9. Para detectar específicamente la RdRP productos sintetizados en forma independiente de la cartilla, es decir, de novo sintetizadas RNA productos [α -32P] puede reemplazarse con [γ -32P] NTP NTP en el RdRP reacción9.
MNase tratamiento de complejos inmunes terc en granos es un paso crítico para obtener los resultados deseados. Si se realiza el tratamiento de MNase demasiado tiempo o con agitación intensa, los productos de RdRP se reduciría notablemente. Para evitar estos problemas, recomendamos seguir estrictamente el protocolo cuidadosamente. Solución HMD es otro factor crítico para el éxito. Si usted encuentra que las señales son muy débiles, reemplazar la solución HMD a uno recién preparado.
A lo largo del Protocolo, uno debe tomar gran cuidado para evitar la contaminación de la Rnasa. Ribonucleasa tratamiento debe ser realizado con equipo dedicado. Después de manipular la ribonucleasa, uno debe desechar las puntas y tubos con Rnasa inmediatamente, eliminan Rnasa con solución especializada (e.g. Rnasa tranquila) y cambian de arboledas.
TERC interactúa no sólo con TERC sino también muchos tipos de RNAs endógenos, y nos han informado de parte de ellos7. Modificación en el ensayo de RdRP de IP, tales como el ensayo de RdRP IP sin tratamiento MNase, proporcionará una lista completa de plantillas de RNA endógenas guía actividad y bioinformáticas de RdRP asociada a terc en sus características de secuencia. Hemos aplicado con éxito este protocolo al tejido lisado. Porque TERT se expresa en una variedad de tejidos normales y tumorales, este análisis podrían ser útil para investigar la función enzimática no canónico de terc en humanos.

Humana de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) es conocida como la subunidad catalítica de la telomerasa y alarga el telómero usando componente RNA de telomerasa (TERC), el RNA específico plantilla1. Aunque terc polimeriza ADN telomérico como un componente de la telomerasa, los análisis estructurales y filogenéticos indican que terc está estrechamente relacionada con polimerasas RNA-dependent RNA virales (RdRPs) así como la transcriptasa inversa viral y comparte dominios con Estas polimerasas2,3,4. RdRP es la enzima que genera el filamento del RNA complementario a una plantilla de RNA. La enzima está codificada no sólo virus, sino también en organismos modelo, como la planta, la levadura y el gusano, y síntesis de ARN de doble hebra por RdRP contribuye al silenciamiento génico transcripcional y postranscripcional en estos organismos5,6 . Aunque RdRP humana había estado desaparecido durante mucho tiempo, se encontró actividad RdRP humano terc en 20097.
Nos confirmaron actividad RdRP de terc con proteína recombinante7primero estableció un análisis de sensibilidad en vitro para detectar actividad RdRP de terc endógeno8. Aquí, demostramos el ensayo en vitro RdRP (IP-RdRP ensayo) para terc endógena. Este método comienza con inmunoprecipitación (IP) de terc endógeno y es seguido en vitro RdRP reacción, en el cual ribonucleótidos radiactivos se incorporan a filamentos de RNA nacientes.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin mixed solution</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&amp;bull;6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&amp;bull;2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Use fresh RI for the assay</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, deionized</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>EX-135</td><td>For step B)</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., KUBOTA</td><td>3740</td><td>For step 6.2</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>MX-305</td><td>For step 6.5</td></tr><tr><td>Cooled incubator</td><td>e.g., Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Set a rotary shaker inside</td></tr><tr><td>Rotary shaker</td><td>e.g., TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Cooled incubator&amp;nbsp;</td><td>e.g., TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>e.g., TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Block incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein

Humano telomerasa transcriptasa inversa (TERT) es la subunidad catalítica de la telomerasa y alarga a través de la actividad de RNA-dependiente polimerasa de la DNA del telómero. Aunque terc es nombrado como una transcriptasa inversa, análisis estructurales y filogenéticos de terc demuestran que terc es miembro de polimerasas de diestros y relaciona con polimerasas RNA-dependent RNA virales (RdRPs) así como de la transcriptasa inversa viral. En primer lugar identificamos RdRP actividad de terc humano que genera RNA complementario soporte a una plantilla de RNA no codificante y contribuye a RNA silenciamiento en células de cáncer. Para analizar esta actividad enzimática no canónico, desarrollamos análisis de RdRP con terc recombinante en 2009, posteriormente había establecido en vitro ensayo RdRP para terc endógena. En este manuscrito, describimos el método de este último. Brevemente, complejos inmunes terc aislados de las células y se incubaron con plantilla de RNA y rNTPs incluyendo rNTP radiactivo de RdRP reacción. Para eliminar el RNA monocatenario, productos de reacción son tratados con Rnasa I y los productos finales están analizado con electroforesis en gel de poliacrilamida. Productos radiactivos de RdRP pueden detectarse por autorradiografía tras la exposición durante la noche.

Con la plantilla de RNA recomendada, productos radioactivos de la RdRP se observan entre los 20 a 30 nucleótidos (nt) específicamente en las células HeLa en fase mitótica después de la exposición durante la noche (figura 1A). Por lo general, la intensidad de la señal de los productos de RdRP muestra dos picos que están situados en torno a los 25 nt y 30 nt en consonancia con la distribución de tamaño de los productos confirmado por la siguiente generación de la secuencia9. En contraste con las células mitóticas, las células HeLa sin sincronización demuestran casi ausencia de los productos radiactivos de 20 – 30 nt. Señales de ovales, que se colocan por debajo de 20 nt en todas las muestras, son no específicas derivas.
En caso de sólo un producto nt ~ 30 con señal débil en células HeLa mitotic, indica que la reacción de RdRP no salieron bien. Por ejemplo, si MNase el tratamiento se realiza aproximadamente e inadecuadamente, la intensidad de la señal en HeLa mitótico de las células disminuye significativamente (figura 1B). RdRP la reacción se realizó con la vieja solución HMD también reduce los productos (figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> Figura 1 : Productos de RdRP representante de terc endógeno en células HeLa mitotic. (A) tres resultados representativos de la prueba de IP RdRP en células HeLa tratan con nocodazole (manipulado) o DMSO (unmanipulated). La síntesis química 34 nt RNA fue utilizado como una plantilla. (B) IP-RdRP ensayo en células de HeLa mitóticas con tratamiento inadecuado de la MNase. (C) ensayo de RdRP IP en mitóticas células HeLa con solución HMD ya sea fresca o vieja. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivos</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nucleasa micrococcal, 20 U/μl</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Almacenador intermediario de la nucleasa micrococcal, 10 x</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua libre de ARNasa</td>
			<td>51 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: MNase componente de mezcla de reacción.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivos</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>GRIETAS, 0.07% (peso/vol)</td>
			<td>6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución HMD</td>
			<td>2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 mM</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0,4 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inhibidor de Rnasa, 40 U/μl</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua libre de ARNasa</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: RdRP componente de mezcla de reacción.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivos</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rnasa una ribonucleasa, 10 U/μl</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón de reacción, 10 x</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua libre de ARNasa</td>
			<td>159.8 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Ribonucleasa reacción mezcla el componente.

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Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Humana de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) sintetiza la DNA telomeric, pero también ARN bicatenario a través de la actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente. Aquí, describimos un análisis recién creado para detectar actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente del terc endógena.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

9.8K vistas.  National Cancer Center Research Institute. Humana de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) sintetiza la DNA telomeric, pero también ARN bicatenario a través de la actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente. Aquí, describimos un análisis recién creado para detectar actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente del terc endógena.

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Investigación

Bioquímica

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

TRAMPA digital de gota (ddTRAP): adaptación del Protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Investigación sobre el cáncer

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Detección de Tilapia lago Virus usando RT-PCR convencional y SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Medio ambiente

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Ensayo libre de anticuerpos para el análisis de actividad de la metiltransferasa de ARN

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Genética

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación precisa de la longitud de los telómeros en estudios de población humana

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Explorando el impacto del trauma en el envejecimiento celular

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

Medición de la longitud de los telómeros de PCR cuantitativa multiplex monocromática 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

Cuantificación de la longitud de los telómeros mediante la detección de quimioluminiscencia no radiactiva

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Autor destacado: Optimización de los parámetros de rendimiento del ensayo de longitud de telómeros TAGGG  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

Optimización de los parámetros de rendimiento del ensayo de longitud de telómeros TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

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