Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH R01 GM113602 (WFM) y la NSF 1144247 (AL). Reconocemos Mark Slabodnick y Natalie Kirkland para el desarrollo de las versiones iniciales de algunos de estos protocolos y debates informativos. Agradecemos a Karina Perlaza y Greyson Lewis para la lectura crítica del manuscrito.

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	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cultivo de Stentor presenta una serie de desafíos. En primer lugar, para realizar experimentos que requieren grandes cantidades de células, es necesario mantener un gran número de culturas de Stentor , como las culturas se vuelven insalubres cuando Stentor concentración excede 20 células/mL. En segundo lugar, los organismos que pueden contaminar cultivos Stentor a menudo dividen más rápido que Stentor y aplastar la cultura (un contaminante común es rotíferos). Por lo tanto, es necesario inspeccionar periódicamente la cultura bajo un microscopio y eliminar los contaminantes. En ocasiones, una nueva cultura debe iniciar a partir de un pequeño número de células manualmente rescatado de un cultivo contaminado. Esto aumenta el tiempo necesario para mantener cultivos sanos de Stentor . En tercer lugar, ampliar una sola celda en una cultura de 400 mL requiere al menos un mes porque el ciclo celular de Stentor es 3-5 días. En cuarto lugar, a diferencia de otros modelo ciliates, Stentor raramente en forma del quiste y se puede congelar.
Un aspecto importante del cultivo de Stentor es la selección de un organismo de alimento apropiado. Previamente fueron descritos varios métodos para el cultivo de Stentor . Uno de ellos sugiere para utilizar leche descremada para cultivar bacterias que se alimentan entonces Stentor. Esta técnica es eficaz en cultivo Stentor; sin embargo, la aplicación de técnicas genómicas requiere muestras puras para evitar confusión de Lee genómico de organismos de la comida indefinido. Utilizando el protocolo actual, Stentor pueden cultivarse en masa y porque su alimento, Chlamydomonas, se ha secuenciado, la presencia de contaminación genómica del organismo de alimentos puede ser detectada y controlada para. Por razones desconocidas, tártaro tenía que reponer sus stocks por regresar a donde él encontró Stentor antes. Con el protocolo actual, hemos podido mantener Stentor durante años.
Experimentos de regeneración con Stentor están generalmente sencillos, pero hay algunos detalles importantes a tener en cuenta. Con respecto a la sección 2, corte Stentor células a la mitad pueden ser dominadas en minutos. Dominar procedimientos de microcirugía más avanzados de Stentor puede requerir una semana de práctica. Mientras que realizar un tratamiento de sacarosa o urea (sección 3), si al principio de la proyección de imagen la mayoría de las células todavía tiene sus bandas membranellar, aumentar el tiempo de incubación de 10-30 s para cuando se realiza tratamiento de sacarosa a continuación. No aumentan el tiempo de tratamiento con sacarosa más allá de 3 minutos de incubación ya que resultará en la muerte celular.
Proyección de imagen de Stentor regeneración requiere métodos de imagen grandes células durante largos períodos de tiempo. El método de proyección de imagen detallado en la sección 4 puede ser utilizado con un microscopio vertical. Si en cambio se dispone de un microscopio invertido, las células pueden colocarse en un portaobjetos o cubreobjetos en pequeñas cámaras. Un método consiste en crear una cámara de vaselina y cubierta con otro cubreobjetos para evitar la evaporación. Alternativamente, se puede hacer una cámara de una célula individual haciendo un agujero con una perforadora de tamaño deseado en un 1 x 1 cm2 de espaciador de silicio (tabla de materiales), colocar el separador en un cubreobjetos, poner las células en la cámara de y que cubre la cámara con otro cubreobjetos. Cuando la proyección de imagen, si no en la orientación correcta para observar los rasgos característicos de cada etapa de la regeneración de Stentor , golpee la placa firmemente para hacer el contrato de la célula. Ver la célula extender para identificar la etapa de regeneración (extensión completa lleva unos 45 s). Si la celda está todavía en la orientación incorrecta, repita el tapping. Las imágenes que se muestra en la figura 1 y figura 6 fueron tomadas por un microscopio de estereo zoom; sin embargo, se pueden realizar todos los experimentos detallados con un 5 X estéreo microscopio de disección.
Otro desafío además de cultivo y proyección de imagen Stentor es el seguimiento de la regeneración, específicamente la cantidad de tiempo necesario para identificar las etapas. Si la regeneración celular es perfectamente orientado con la región del primordio oral claramente visible, la identificación de la etapa tarda unos segundos. A veces, sin embargo, la célula de Stentor es en una orientación de prevención de la asignación clara de la etapa de regeneración, teniendo así más tiempo para identificar. La importante cantidad de tiempo requerido para la etapa las células regeneración individuales podrían retrasar la cuantificación de todas las células regeneradoras, disminuyendo la precisión temporal de staging y requiriendo el observador esperar y volver a la imagen la celda después de que se ha trasladado a una nueva orientación. Por lo tanto, este experimento es tiempo y mano de obra. Por estas razones, sería altamente deseable para el desarrollo de métodos automatizados para detectar las células de Stentor y la asignación de las etapas de regeneración de datos de microscopia video. Estos también permitiría más experimentos reproducibles, aumenta el tamaño de la muestra, y la eliminación de los prejuicios humanos.
La aparición de métodos altamente sensibles de genómica y proteómica ha comenzado a poner los estudios de las células en alcance. Para tales análisis unicelular, el tamaño gigante de una célula de Stentor , es un tema de prueba conveniente para los experimentos de prueba de concepto. Para tales experimentos a ser posible, cultivo de Stentor es fundamental, y así los métodos descritos aquí deben desempeñar un papel en el desarrollo de las técnicas más avanzadas de unicelular.

Las células no son simples bolsas de enzimas, pero algo muy complejas máquinas cuyos componentes son cuidadosamente escala con el tamaño correcto y dispuestos en posiciones bien definidas. La morfogénesis de las células individuales representa un proceso clave en biología celular y del desarrollo, pero su mecanismo molecular es desconocido1,2. Mientras que algunas células cultivadas se asemejan a manchas, organismos unicelulares pueden han extremadamente complicado arquitecturas, ejemplificadas por los complejos patrones corticales en ciliados3,4.
Quizás el ejemplo más extremo de una célula altamente estructurado es Stentor coeruleus, un gigante heterotrichous ciliados distantemente relacionados con Tetrahymena y Paramecium. Stentor es 1 mm de largo y está cubierta con más de 100 bandas longitudinales de pigmento azul que se alternan con hileras de cilios organizados por paralelo pilas de cintas de microtúbulos que la longitud de toda la célula. La célula es trompeta en forma (figura 1), con una banda de membranellar y un aparato bucal (OA) en su extremo anterior y un holdfast que une la célula al sustrato en su extremo posterior. Además de la polaridad antero-posterior claro, la célula también muestra un patrón distintivo quiral, que espaciamiento entre hileras ciliares gradualmente aumenta en sentido horario. Esto se traduce en una discontinuidad donde la fila más estrecha se encuentra con la fila más amplia y en esta región de la superficie de la célula, conocido como el lugar geométrico del contraste de la raya, puede inducir la formación de la segunda serie de estructuras de extremo anterior cuando injertado en otro celular5, lo que es formalmente equivalente a organizador de Spemann. Por lo tanto, todos los procesos claves de la biología del desarrollo tienen sus análogos en Stentor: axiation, formación de patrones e inducción. En un embrión, estos procesos son conducidos por las diferencias de destino entre las diferentes células, pero en Stentor, debe ser conducidos por las diferencias de destino entre las diferentes regiones dentro de una sola célula. Lo que define las diferencias entre las regiones dentro de Stentor es un misterio.
Si cualquier parte de Stentor es cortado, la pieza que faltaba de la célula puede regenerar para producir una célula normal en cuestión de horas. Si una célula es cortar por la mitad, o incluso en piezas mucho más pequeñas, cada pieza se reorganiza en una célula de aspecto normal pero más pequeña y restaura la proporcionalidad adecuada entre partes de la célula6,7. Pequeñísimos fragmentos, 1/64th el tamaño de la célula original, son capaces de regenerarse en una celda pequeña pero normalmente proporcionada y luego crece al tamaño completo6. Stentor presenta así una oportunidad única para estudiar los mecanismos de organelo tamaño escalado y celular regulación del crecimiento mediante métodos quirúrgicos que se aplican generalmente a nivel de tejidos u organismos enteros.
Una de las propiedades de Stentor que le permite regenerarse de una amplia gama de intervenciones quirúrgicas es que contiene un macronucleus noduladas sola (figura 1) con unos 50.000 copias del genoma entero8. Como un fragmento de la célula contiene al menos un nodo macronuclear, tiene la capacidad de regenerar completamente. Otra propiedad subyace la capacidad de regeneración de Stentores su prodigiosa capacidad de cicatrización de heridas. Aunque muchos tipos de células son capaces de curar sus heridas9, Stentor es capaz de recuperarse de una extraordinaria gama de perturbaciones físicas. Un ejemplo de recuperación de Stentor de una perturbación drástica, junto con los métodos para la visualización de flujo citoplásmico en Stentor10 fueron divulgados previamente. Estos métodos permiten el estudio de cómo hería y subsecuente regeneración afectan el estado físico del citoplasma.
Stentorde gran tamaño, capacidad de regeneración extraordinaria y el hecho que se manifiesta en muchos de los fenómenos del desarrollo en embriones multicelulares (como los organizadores, axiation y patrones) atrajeron a muchos biólogos del desarrollo durante la vuelta del siglo pasado, incluyendo Caza Morgan de Thomas7. Durante los años 50 y años 60, enfoques microquirúrgicos demostraron una variedad sorprendente de procesos regenerativos y morfogenéticos en este solo-celled organismo11. Sin embargo, Stentor ha sido desarrollado como un sistema modelo de biología molecular sólo recientemente. Durante los últimos años, el genoma de Stentor fue secuenciado y ensamblado8, y el método para perturbar la expresión génica mediante la alimentación de RNAi fue desarrollado12.
Una de las razones que Stentor fue convertido en un organismo modelo para la biología molecular moderna sólo recientemente fue la dificultad de crecimiento grandes culturas debido a su largo ciclo celular (3 a 5 días). Sin embargo, los métodos genómicos y proteómicos modernos requieren menos material que utilizaron a, y el volumen de una sola célula de Stentor es suficiente para estos métodos, incluso sin recurrir a métodos ultrasensibles que se desarrollaron para el análisis de solo células que son mucho más pequeñas que Stentor. Sección 1 del protocolo detalla el procedimiento para el establecimiento de una cultura grande de una sola célula de Stentor . El mismo enfoque puede utilizarse para establecer una cultura grande de un fragmento de células obtenida por corte de una célula. Sección 1 también proporciona las directrices para mantener cultivos sanos de Stentor durante largos períodos de tiempo. Sección 2 del protocolo proporciona la metodología para inducir la regeneración de la célula por las células de corte manualmente con una aguja de vidrio. Artículo 3 del Protocolo se dedica a dos métodos de inducir la regeneración de estructuras celulares específicas (membranellar banda y oral aparato): tratamiento de las células con sacarosa o urea conduce al vertimiento de estas estructuras, seguidas por su regeneración. Artículo 4 del protocolo detalla un método para la proyección de imagen de células regeneradoras durante largos períodos de tiempo. Sección 4 termina con la descripción de las etapas de la regeneración y sugerencias sobre el análisis de la dinámica de la regeneración.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

Las células deben ser capaces de regenerar sus partes para recuperarse de perturbaciones externas. El unicelular ciliado Stentor coeruleus es un organismo modelo excelente para el estudio de la cicatrización y regeneración de la célula siguiente. El genoma de Stentor se convirtió recientemente, junto con métodos de biología molecular moderna, como RNAi. Estas herramientas hacen posible estudiar sola célula regeneración a nivel molecular. La primera sección del protocolo cubre Stentor establecer los cultivos celulares de las células o fragmentos celulares, junto con las directrices generales para mantener culturas de Stentor . Cultivo de Stentor en grandes cantidades permite el uso de herramientas valiosas como bioquímica, secuenciación y espectrometría de masas. Las secciones subsiguientes del protocolo cubren distintos métodos para inducir regeneración en Stentor. Cortar manualmente las células con una aguja de vidrio permite estudiar la regeneración de partes grandes de la célula, mientras que el tratamiento de células con sacarosa o urea permite estudiar la regeneración de estructuras específicas, situada en el extremo anterior de la célula. Se proporciona un método para proyección de imagen las células regeneración individuales, junto con una rúbrica de escenificando y analizar la dinámica de la regeneración. Todo el proceso de regeneración se divide en tres etapas. Al visualizar la dinámica de la progresión de una población de células a través de las etapas, se demuestra la heterogeneidad en el momento de la regeneración.

Stentor culturas han establecido y mantenido de células individuales o fragmentos celulares utilizando la sección 1 del Protocolo de forma fiable. Un ejemplo representativo de una cultura saludable grande se muestra en el Video 1.
El curso del tiempo de la regeneración se midió en Stentor utilizando el método de tratamiento de sacarosa para iniciar la regeneración que se describe en el paso 3.1, combinado con la proyección de imagen y el método de análisis discutidos en la sección 4 (figura 7). Esta trama indica que hay una propagación de una hora de duración en el tiempo por la población de células para alcanzar cualquier etapa particular. Este tipo de análisis permite el estudio de la heterogeneidad temporal en el proceso de regeneración en una población de regenerar las células.
El siguiente es un resumen de la programación de regeneración que se ha observado hasta el momento después de decenas de tratamientos de sacarosa (figura 4 y figura 6). Fase 1 es cuando las células Stentor ven como gotas de lágrimas sin ninguna banda de membranellar (esta etapa comienza inmediatamente después de lavado de sacarosa). Esta etapa dura de 3-6 h. fase 2 es cuando una banda de membranellar aparece y crece (3-6 h después de tratamiento con sacarosa). Esta etapa dura de 3-4 h. 3 etapa es cuando un primordio oral aparece en la parte posterior de la banda de membranellar (6-8 h después de tratamiento con sacarosa), y ambas estructuras se mueven hacia el extremo anterior de la célula. Esta etapa dura 1-2 h. Cuando la banda de membranellar y el aparato bucal alcanza el extremo anterior de la célula, esto indica la terminación de la regeneración. La célula ha adoptado forma de trompeta-como característica de Stentor . Las células fueron totalmente regenerado 8-9 h después de tratamiento con sacarosa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> Figura 1. Instantánea de Stentor. La banda de membranellar y el aparato bucal se muestra en el extremo anterior de la célula. La holdfast está en el extremo posterior de la célula. Macronucleus Stentor es noduladas. Un bien alimentados Stentor tiene vacuolas de alimentos verdes que contienen en su mayoría Chlamydomonas. Barra de escala es 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> Figura 2. Instalación de corte de Stentor . Corte de la célula se realiza manipulando manualmente una aguja de vidrio mientras mira a la célula con un microscopio estéreo disección disponible comercialmente. El propósito del pañuelo de papel es proporcionar el fondo blanco para ver las células mejor. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> Figura 3. Instantáneas de Video ilustrando cómo cortar un Stentor con una aguja de cristal de 3. (A) A Stentor inmediatamente antes de que la aguja llegue a él. (B) un Stentor aprieta suavemente entre un portaobjetos de vidrio y aguja. (C) A había contratado Stentor reaccionan a la fuerza de la aguja. (D) A Stentor a cortar presionando suavemente en la pila con el lado de la aguja. (E) A Stentor ahora cortada en dos pero no separados. (F) dos fragmentos de Stentor . Barra de escala es 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> Figura 4. Visualización esquemática de la sección 3 y sección 4 del Protocolo de. Se trata de un protocolo ilustrado para la realización de sacarosa o urea tratamiento y observación de la regeneración de la célula. El tiempo indicado en el panel inferior se mide desde el inicio de la máquina 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> Figura 5. La configuración para la observación directa o proyección de imagen de la regeneración con un microscopio vertical. En cada gota de μl 4 cuelgan de cubreobjetos, hay una célula en regeneración. Agua en los pozos de la placa punto limita la evaporación de las gotitas. Esta configuración permite después de la regeneración de varias celdas en paralelo. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> Figura 6. Instantáneas de Stentor en cada etapa de la banda de membranellar y la regeneración del aparato oral. (A) etapa 1 se caracteriza por una forma de lágrima como celular y la ausencia de la banda de membranellar. (B) fase 2 se caracteriza por la aparición de la banda membranellar, una estructura de cilios que late continuamente. Bandas de Membranellar están marcados con líneas blancas discontinuas en paneles B - D. (C y D) etapa 3 es caracterizada por la aparición del primordio oral (marcado con una flecha). Primordio oral parece una invaginación en el extremo posterior de la banda de membranellar. El primordio oral entonces se moverá hacia arriba hacia la parte anterior de la célula para convertirse en el aparato bucal. (E) la regeneración se completa cuando la célula ha adoptado la característica Stentor con forma de trompeta, y el aparato bucal (marcado con una flecha) se ha ensanchado en el extremo anterior de la célula. Barra de escala es 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> Figura 7. Apilados que muestra diagrama de caja como proporciones de células en todas las etapas de la regeneración después de tratamiento con sacarosa cambia con el paso del tiempo. La trama muestra heterogeneidad en el tiempo de las etapas de la regeneración dentro de una población de células regeneradoras. "Fin de reg." indica la finalización de la regeneración. El número de células: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> Video de 1. Ejemplo de una sana cultura de Stentor . Generalmente, si una cultura es concentrado, División de la cultura se recomienda. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> Video 2. Desaceleración de Stentor con metilcelulosa. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> Video 3. Corte Stentor. Células individuales pueden ser cortadas manualmente en pedazos múltiples bajo un estéreo microscopio de disección presionando una aguja de vidrio a través de la célula. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema con la cultura</td>
			<td>Posible solución</td>
			<td>Prevención de posibles</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura es abrumada por rotíferos u otros grandes organismos.</td>
			<td>Quitar tantos Stentor como sea posible en un nuevo plato de cultura. Luego lavar las células 3 veces.</td>
			<td>Lave bien Stentor cuando recibirlos, aun cuando compra de un proveedor comercial.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura es abrumada por hongos y otros organismos pequeños.</td>
			<td>Identificar una esquina donde hay menos Stentor. En esa zona, eliminar tanto los medios como sea posible sin la eliminación de muchos Stentor y agregue nueva PSW. Mezclar suavemente pero profundamente a representar los organismos invasores. Omitir la siguiente alimentación y Stentor come.</td>
			<td>Observar el cultivo regularmente y eliminar contaminantes pequeños mediante el intercambio de los medios de comunicación para fresco PSW.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor están poniendo encima de la otra.</td>
			<td>Partido de la cultura de modo que la concentración es de menos de 20 células/mL.</td>
			<td>Dividir las culturas más a menudo.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Células de Stentor de apareamiento.</td>
			<td>Alimentar cada 4 días, en vez de cada 5 días.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura tiene un montón de material de desecho oscuro.</td>
			<td>Eliminar tanto el material oscuro, residuos de Stentor , como sea posible sin la eliminación de las células. Si Stentor se unen al material oscuro, pipeta hacia arriba y hacia abajo para liberar las células de Stentor de sus residuos y luego retire los medios de comunicación con los residuos sin la eliminación de las células. O, retire los Stentor y por consiguiente la alimentación menos.</td>
			<td>Alimentación Stentor 1 mL menos de alimento por cada 100 mL de la cultura.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aspecto saludable (vacuolated, hinchados o redondeados) Stentor.
</td>
			<td>Eliminar tanto los medios como sea posible sin la eliminación de muchas células de Stentor y Añadir nueva PSW.</td>
			<td>Intercambiar periódicamente los medios de comunicación.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Guía para el cultivo de Stentor.

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Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Métodos para el estudio de la regeneración en Stentor

El ciliado gigante, Stentor coeruleus, es un excelente sistema para estudiar la regeneración y cicatrización de heridas. Presentamos los procedimientos para establecer Stentor cultivos celulares de las células o fragmentos celulares, inducir la regeneración de las células de corte, químicamente inducir la regeneración de la banda membranellar y aparato bucal, proyección de imagen y análisis de células regeneración.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.7K vistas.  University of California San Francisco. El ciliado gigante, Stentor coeruleus, es un excelente sistema para estudiar la regeneración y cicatrización de heridas. Presentamos los procedimientos para establecer Stentor cultivos celulares de las células o fragmentos celulares, inducir la regeneración de las células de corte, químicamente inducir la regeneración de la banda membranellar y aparato bucal, proyección de imagen y análisis de células regeneración.

Video: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Inducir completa Pólipo regeneración de la aboral Physa de la anémona de mar Starlet<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Un modelo murino de la implantación de un stent en la arteria carótida para el Estudio de la reestenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Medicina

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

La investigación de la regeneración funcional en organotípicos médula espinal Co-culturas cultivadas en Arrays Multi-electrodos

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Neurociencias

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

La inmovilización de las planarias, irradiación parcial, y el trasplante de tejido

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Biología

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un ensayo para la línea lateral de regeneración en adultos de pez cebra

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

La perfusión como un método para la visualización vascular<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

Análisis de los patrones de motilidad del estentor durante y después de la regeneración del aparato oral mediante el seguimiento celular

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Métodos para el estudio de la regeneración en Stentor

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