Este trabajo fue financiado por una beca de Parque de investigación Norwich (JR), la ingeniería conjunta y Consejo de investigación de ciencias físicas/biotecnológicos y financiado por el BBSRC de Consejo de investigación de ciencias biológicas OpenPlant sintética biología centro de investigación conceden (BB L014130/1) (M.J.S., A.O.); un intercambio de conocimientos de centro John Innes y comercialización conceden (BB/KEC1740/1) (BB); y el Instituto BBSRC programa estratégico 'Las moléculas de la naturaleza' (BB/P012523/1) y el John Innes (A.O.). Nos gustaría agradecer a George Lomonossoff para proporcionar los vectores pEAQ y Andrew Davis para la fotografía.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Rendimiento alto vacío infiltración permite este protocolo a ser utilizado rutinariamente en nuestro laboratorio para la producción preparativa de triterpeno compuestos de interés para diferentes aplicaciones posteriores. El aparato de vacío de la infiltración que se describe aquí se reproducen fácilmente. Además del depósito vacío es aconsejable disminuir el tiempo necesario para tirar el vacío necesario, sin embargo, es posible reutilizar simplemente un horno de vacío sin modificar como la cámara de infiltración. La protección de la bomba de vacío vía la adición de un condensador adecuado es teóricamente razonable, pero en nuestro laboratorio hemos encontrado que sea innecesario.
Cobertura de infiltración se ve comprometida si las hojas no son completamente sumergidas en la suspensión de la infiltración. Este problema se reduce al mínimo asegurándose de que el nivel de la suspensión llega a la superficie superior del titular de la planta, y que el titular de la planta es un ajuste apretado para el baño de la infiltración. Nota de la figura 2 que la superficie superior del titular de la planta es empotrada en el baño de infiltración cuando en lugar. Esto se logra mediante paneles en los bordes mediados del titular de los que forman el punto de anclaje con la parte superior de la bañera de infiltración. La suspensión de infiltración requieren adiciones periódicas para mantener el nivel de suspensión. Esto se logra mejor por la adición de la suspensión de exceso de infiltración para evitar la reducción gradual de la OD600 en el transcurso de una gran infiltración batch-wise. Sin embargo, en nuestras manos, sustitución por agua no parecen tener un efecto notable en los rendimientos esperados a escala preparativa, aunque esto no ha sido posible investigar. Cuantas plantas se pueden infiltradas de un lote de suspensión de infiltración es todavía una cuestión abierta. Rutinariamente infiltran entre 100 y 200 plantas con un solo lote de suspensión de infiltración. Además, es normal que algunos suelo para lixiviación en la suspensión de infiltración a lo largo del proceso de infiltración. Esto no se ha encontrado para tener un efecto notable sobre la eficacia de la infiltración.
Durante la cosecha es recomendable (pero no fundamental) para cosechar solamente las hojas que se infiltraron (algunas hojas habrán crecido después de la infiltración). Cosecha selectiva evita la dilución con tejido improductivo, que de lo contrario aumentaría la proporción de impurezas endógenas en relación con el compuesto de interés. Esto tiene un impacto nominal en la facilidad de purificación de aguas abajo y aumenta la magnitud de estos procesos. Cuando se utiliza tHMGR para impulsar el suministro de precursores, un fenotipo necrosado se observa a menudo a desarrollar durante el período de crecimiento después de la infiltración. Esto es normal y realmente ayuda a la cosecha selectiva y el posterior proceso de secado. El polvo de hoja secas generalmente puede almacenarse en un recipiente hermético en un lugar fresco, seco y oscuro, pero idealmente en un desecador bajo vacío. Esto depende de la estabilidad del compuesto de interés. Tenga cuidado si decide almacenar en un congelador de-80 ° C. Asegurarse de que las secas hojas están en un recipiente resistente al agua y en salida de almacén, permite este contenedor a temperatura ambiente antes de su apertura. No hacerlo resultará en remojo de las hojas, dificultando el proceso corriente abajo.
Los pasos posteriores a la cosecha en este protocolo se proporcionan con fines ilustrativos y para ayudar a aquellos investigadores que pueden haber limitado química práctica de la experimentan. Puede ser sustituidas por muchas otras técnicas de extracción/purificación de productos naturales. Como se indica en la introducción, PSE tiene muchas ventajas, sin embargo el capital coste de aparatos disponibles en el mercado de PSE puede ser prohibitivo, y no es esencial. Tratamiento de la resina básica de intercambio iónico es un método muy conveniente para reemplazar a saponificación tradicional seguido por partición líquido-líquido. Sin embargo, no es conveniente para los productos que contienen grupos de ácido carboxílico o grupos funcionales que se hidroliza bajo condiciones básicas, tales como esteres. Estos productos se espera a ser retenidos en la resina básica de intercambio iónico. Sin embargo, hay potencial para explotar esto para una captura y liberación de procedimiento (no documentado aquí). Donde saponificación tradicional sería apropiado, tratamiento de resina de intercambio iónico básicas sirve como una alternativa conveniente. El método de cromatografía se describe en el paso 9, se ha encontrado para ser generalizable para los compuestos descritos en la figura 3. Sin embargo, compuestos de polaridad creciente pueden requerir un largo periodo de elución 100% acetato de etilo. Paso 9.2, purificación fina descendente es enteramente compuesto específico y también es dependiente de la escala. Reiteradas rondas de cromatografía flash de pequeña escala con gradientes optimizados, es suficiente para lograr una pureza adecuada para el análisis de NMR. En escalas más grandes, la cristalización es a menudo una alternativa conveniente. En casos difíciles, preparativa o semi-preparativa alta cromatografía líquida (HPLC) se puede emplear dependiendo de la cantidad deseada de compuesto aislado. Ejemplos de procesos de purificación de aguas abajo para una gama de compuestos representativos se pueden encontrar en otra parte8.
El protocolo actual, tal como se presenta aquí, se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio y ha demostrado utilidad. Sin embargo, es todavía significativo alcance para la mayor optimización de la plataforma de expresión. Está trabajando en nuestro laboratorio para investigar cómo más ingeniería de vías y control diferencial de los niveles de expresión de la proteína podría mejorar la producción de triterpeno, mientras mediadores de toxicidad para las células del huésped. También existe la posibilidad para investigar la manipulación de los sistemas de transporte intracelular20,21y la dirección de las enzimas a diferentes compartimentos celulares22,23, avenidas que podrían mejorar la eficiencia de varios eventos de oxidación. Beneficios potenciales para la modificación de la morfología subyacente de orgánulos claves también podrían explorarse. Por ejemplo, se ha observado sobreexpresión del dominio de membrana de Arabidopsis thaliana HMGR para inducir la hipertrofia del retículo endoplásmico en plantas24; un sitio clave para la actividad de CYP450. Este protocolo es ideal para la producción de mg para cantidades de gramo-escala de productos de triterpeno y puede emplearse en un entorno de investigación a compuestos para estudio aguas abajo (por ejemplo, la exploración sistemática de la estructura y actividad relaciones y las investigaciones preliminares en las propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas de compuestos de plomo de interés clínico). Sin embargo, la plataforma es linealmente y confiablemente escalable simplemente incrementando el número de plantas utilizadas y el sentido práctico de expresión transitoria mediante agroinfiltration se ha demostrado a escala industrial para la producción de proteínas farmacéuticas 14, por lo tanto hay potencial de esta plataforma para ser extendido para la producción comercial de triterpenos de alto valor. Por otra parte, también es posible visualizar la producción de transformantes estables llevando el camino biosintético del deseo finalizado multigénica, permitiendo el cultivo masivo y continuo 'cultivo' de N. benthamiana de transgénicos cepas la producción de diferentes compuestos de valor comercial.

Los triterpenos son uno de los más grandes y más familias estructuralmente diversas de productos naturales. A pesar de su inmensa diversidad, triterpeno todos los productos naturales se creen para ser derivado del mismo precursor lineal 2,3-oxidosqualene, un producto de la vía del mevalonato en plantas. Ciclización del oxidosqualene 2.3 es iniciado y controlado por una familia de enzimas denominado cyclases del oxidosqualene (OSCs). Este paso de ciclización representa el primer nivel de diversificación, con cientos de andamios diferentes triterpeno haber divulgado de la naturaleza1. Estos andamios están más diversificados por sastrería enzimas incluyendo pero no limitado a, cytochrome p450s (CYP450s)1,2. Tales vías biosintéticas pueden llevar a complejidad inmensa, a veces dando por resultado productos finales que son apenas reconocibles desde el triterpeno del padre. Por ejemplo, la estructura compleja de la potente insecticida y antialimentario limonoide de azadiractina se cree que derivan de un triterpeno tetracíclico de los tirucallane tipo3.
Muchos derivados de triterpenos productos naturales, incluso aquellos con andamios de padres relativamente sin modificar, han demostrado poseer actividad biológica medicinal relevantes4,5,6,7. Sin embargo, hasta ahora este potencial no se ha traducido en una gran cantidad de medicamentos derivados de triterpenos en la clínica. Podría decirse que se trata (al menos parcialmente) una consecuencia de acceso sintético práctico limitado a esta clase de compuesto, un problema que puede sofocar la exploración de las relaciones estructura-actividad y desarrollo de llevar candidatos por tradicionales medicinales flujos de trabajo de química.
La expresión transitoria de las enzimas biosintéticas triterpeno de otras especies de plantas en hojas de N. benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno (figura 1). Este proceso puede utilizarse para caracterizar funcionalmente enzimas candidato y reconstruir las vías de biosíntesis de metabolitos natural importantes. Igualmente, también puede ser explotada en enfoques biosíntesis combinatorios triterpeno nuevos productos, una estrategia que puede resultar en bibliotecas de análogos estructuralmente relacionados, que permite la exploración sistemática de las relaciones estructura y actividad de plomo biológicamente activo, compuestos de8,9.
Agroinfiltration es un medio eficiente y simple para lograr la expresión transitoria en hojas de N. benthamiana . El proceso consiste en la infiltración de hojas con una suspensión de a. tumefaciens llevando la expresión binaria construct(s) de interés. Esto se logra mediante la aplicación de presión que fuerza el líquido a través de los estomas, desplazando el aire en el espacio intercelular y sustituirla por la suspensión de a. tumefaciens . La bacteria transferir las respectivas DNAs de T al interior de las células de la planta, dando por resultado la expresión de la proteína localizada y transitoria en el tejido de la hoja infiltrada.
Mientras que cualquier vector binario adecuado para generar plantas transgénicas puede ser empleado para la expresión transitoria, utilizamos derivados del fríjol mosaico Virus CPMV Hypertranslational (HT) proteína expresión sistema10, 11. en este sistema el gen de interés es flanqueado por regiones no traducidas (UTR) de CPMV RNA-2. El UTR 5' contiene modificaciones dando como resultado niveles muy elevados de la traducción de la proteína con ninguna dependencia de la replicación viral12. Esta técnica se ha convertido en la serie de vector binario de fácil y rápido (pEAQ) que incluye la recombinación específica del sitio clonación compatible con protocolo de construcciones (pEAQ -HT- DEST)10,11. La mayoría pEAQ vectores contienen también un tomate achaparramiento arbustivo derivado de virus P19 silenciamiento supresor gen13 dentro de la porción del T-ADN del cassette de expresión, que evita la necesidad de coinfiltrate una cepa de P19-llevar separada y es muy expresión de proteínas de alto nivel en la sede de la planta celular10,11.
El uso de N. benthamiana como un anfitrión de expresión tiene ventajas particulares cuando se trabaja con vías biosintéticas de la planta. La arquitectura de la célula apoya intrínsecamente correspondiente mRNA y proteína procesamiento y compartimentación adecuada, además de poseer la necesarias Co-enzimas, reductasas (para CYP450s) y precursores metabólicos. La fuente de carbono es la fotosíntesis; así, simplemente pueden cultivarse plantas en compost de buena calidad, que requieren sólo agua, CO2 (desde el aire) y la luz del sol como entradas. La plataforma es también muy conveniente para la expresión de diferentes combinaciones de proteínas, como esto puede lograrse suelen Co la infiltración de diferentes cepas de a. tumefaciens, negando la necesidad de construir grandes expresión multigénica cassettes. Además, el proceso puede ser linealmente y confiablemente escala simplemente incrementando el número de plantas utilizadas en el experimento.
Trabajos previos en nuestro laboratorio han demostrado la utilidad de esta plataforma de experimentos escala preparativa. Esto incluye la preparación de nuevos triterpenos para uso en ensayos de bioactividad y escala hasta alcanzar cantidades de gramo del producto aislado. Además, se puede aumentar la acumulación de productos heterogéneos triterpeno varios doblan coexpresión de una forma truncada N-terminal, insensible a la retroalimentación de la 3-hidroxi, 3-methyglutary-coenzima A reductasa (tHMGR), una limitación de velocidad por aguas arriba enzima en el camino de mevalonate8.
Clave para tales experimentos escala preparativo es capaz convenientemente para arriba-escala el proceso de infiltración. En un experimento típico, se requiera decenas a cientos de plantas para lograr la cantidad de destino del producto aislado. Infiltración de hojas individuales a mano (utilizando una jeringa no hace falta) es operacionalmente exigente y a menudo prohibitivo desperdiciador de tiempo, haciendo este método impráctico para escala-para arriba rutinario. Infiltración vacío ofrece ventajas sobre la infiltración de la mano, ya que no es dependiente en el nivel de habilidad del operador y permite la infiltración de una mayor área de la superficie foliar. Este procedimiento se utiliza comercialmente para la producción a gran escala de proteínas farmacéuticas14. Este protocolo utiliza un aparato de infiltración vacío fácilmente replicables, que puede construirse de piezas disponibles en el mercado. Esto permite la infiltración simultánea de hasta 4 plantas, con infiltración batch-wise rápida y práctica de cientos de plantas en un corto periodo de tiempo (Figura 2a -2b). El aparato de vacío de infiltración consiste en un horno de vacío que forma la cámara de infiltración (figura 2f). El horno está conectado a una bomba a través de un depósito vacío. Esto reduce considerablemente el tiempo necesario para lograr el vacío deseado en la cámara de infiltración. Las plantas son garantizadas en un soporte a medida e invertidas en un baño de agua de acero inoxidable de 10 L con suspensión de a. tumefaciens (Figura 2a -2 c). Inmersión completa de las partes aéreas de las plantas es importante infiltración eficiente. El baño de agua se coloca dentro de la cámara de infiltración (Figura 2d -2e) y el vacío aplicado para dibujar el aire de los espacios intersticiales de la hoja. Una vez que la presión se ha reducido en 880 mbar (un proceso que toma aproximadamente 1 minuto) la cámara de infiltración vuelva rápidamente a la presión atmosférica 20-30 s con la apertura de la válvula de entrada del horno, con lo cual la infiltración es completa.
Cinco días después de la infiltración el material vegetal está listo para la cosecha y la posterior extracción y aislamiento del producto deseado. Desde este punto el proceso es simplemente uno de los productos naturales extracción y purificación a partir de material de la hoja, un flujo de trabajo que es familiar a cualquier químico de productos naturales. Muchos diversos métodos de extracción inicial y posterior purificación existen15. La opción más adecuada de los métodos y las condiciones exactas que se utiliza es altamente dependiente de las propiedades químicas del compuesto de interés, además de la disponibilidad de destrezas y/o equipo. No es posible incluir en este protocolo un método totalmente generalizable, paso a paso para la transformación aguas abajo de la hoja cosechada de la planta al producto aislado que podría seguir ciegamente cualquier producto triterpeno de interés, ni sería apropiado para intentar hacerlo. Sin embargo, este protocolo proporcionará una visión general del flujo de trabajo básico utilizado en nuestro laboratorio y algunos métodos para las primeras etapas del proceso, que en nuestra experiencia han demostrado ser generalizables para los productos de triterpeno aglicona más oxigenados. Esto incluye dos técnicas relativamente poco común, es decir, extracción de solvente presurizado (PSE) y un método conveniente de fase heterogénea para eliminación de clorofila usando una resina de intercambio iónico fuertemente básico.
PSE es una técnica muy eficiente para la extracción de pequeñas moléculas orgánicas de matrices sólidas. Las extracciones se realizan bajo presión (ca. 100-200 bar), la principal ventaja es la habilidad de usar temperaturas aliviadas que excedan el punto de ebullición punto del solvente de extracción. Esto puede reducir significativamente el tiempo y la cantidad de disolvente necesaria para lograr una extracción exhaustiva, en comparación con otras técnicas solvente caliente como reflujo simple o de extracciones Soxhlet16. Comercial Banco PSE instrumentos están disponibles, que utilizan las células de extracción intercambiables y solvente automatizado manejo, calefacción y control. Esto hace que esta técnica muy conveniente. También es sin duda menos peligroso, particularmente para los operadores con experiencia de química práctica limitada.
Saponificación de los extractos de hoja cruda bajo seguido de partición líquido/líquido de reflujo es una técnica común para el retiro a granel de clorofilas antes de purificación posterior o análisis. Sin embargo, esto puede a menudo ser operacionalmente exigentes en escalas más grandes. Además, la detección de la interfaz, o pérdida del producto debido a la formación de emulsiones puede ser problemática. El uso de resinas de intercambio iónico fuertemente básico para llevar a cabo la hidrólisis de fase heterogénea puede servir como una alternativa conveniente. La porción pigmentada de la clorofila hidrolizada permanece adherida a la resina y puede eliminarse simplemente por filtración. Este protocolo utiliza una adaptación de la escala preparativa de un procedimiento analítico previamente divulgados17 que emplea una resina de intercambio iónico básicas disponibles en el mercado.
A continuación se describe un protocolo detallado y rápido para la producción a escala preparativa de triterpenos utilizando esta plataforma basada en plantas. Este protocolo se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para preparar decenas hasta cientos de miligramos de producto triterpeno aislado para aplicaciones tal una caracterización por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), o estudiar más funcional ensayos.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

Los triterpenos son uno de los más grandes y más familias estructuralmente diversas de productos naturales. Muchos derivados triterpénicos han demostrado poseer actividad biológica medicinal relevante. Sin embargo, hasta ahora este potencial no se ha traducido en una gran cantidad de medicamentos derivados de triterpenos en la clínica. Podría decirse que se trata (al menos parcialmente) una consecuencia de acceso sintético práctico limitado a esta clase de compuesto, un problema que puede sofocar la exploración de las relaciones estructura-actividad y desarrollo de llevar candidatos por tradicionales medicinales flujos de trabajo de química. A pesar de su inmensa diversidad, triterpenos todos derivan de un único precursor lineal, oxidosqualene 2.3. Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en N. benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno que no son producidos naturalmente por este host. Infiltración del agro es un medio eficiente y simple para lograr la expresión transitoria en N. benthamiana. El proceso consiste en la infiltración de hojas de las plantas con una suspensión de Agrobacterium tumefaciens llevando la construct(s) de expresión de interés. La infiltración de un adicional de a. tumefaciens cepa lleva una construcción de expresión codificación enzima que aumenta el suministro de precursores significativamente aumenta los rendimientos. Después de un período de cinco días, el material de hoja infiltrada puede cosechado y procesado para extraer y aislar los productos resultantes del triterpeno. Este es un proceso que es linealmente y confiablemente escalable, simplemente incrementando el número de plantas utilizadas en el experimento. Es en este documento se describe un protocolo para la rápida producción a escala de preparativo de triterpenos utilizando esta plataforma basada en plantas. El protocolo utiliza un aparato de vacío fácilmente replicable de la infiltración, que permite la infiltración simultánea de hasta cuatro plantas, lo que permite la infiltración batch-wise de cientos de plantas en un corto período de tiempo.

Típicos rendimientos aislados dependen de la combinación de la enzima enzimático bajo investigación, la estabilidad química del compuesto blanco, y como desafiando el proceso de purificación fue. Hemos divulgado previamente aislada producción de β-amirina derivados de nuestros experimentos de biosíntesis combinatoria desde 0.12 hasta 3,87 mg por gramo de polvo de hoja de N. benthamiana seco. Estos compuestos se extendieron ampliamente en el nivel de oxidación e incluyen la combinación natural de enzimas (figura 3)8. Este protocolo se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para producir decenas o centenares de miligramos del producto purificado para la caracterización por espectroscopia RMN y análisis funcionales descendentes. También hemos demostrado la utilidad preparativa de esta plataforma mediante la producción de 0.8 g de triterpeno andamio β-amirina en una pureza superior al 98%. Este experimento utiliza 459 plantas y representa una producción aislada de 3,3 mg por gramo de seco N. benthamiana de la hoja en polvo8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Figura 1: esquema Resumen. Representación esquemática del proceso de explotación de la expresión transitoria de las enzimas biosintéticas en hojas de N. benthamiana desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción preparación de nuevos productos de alto valor triterpeno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Figura 2: construcción infiltrado y proceso de vacío un) A medida separada de una ala planta titular. alas de b) Bespoke planta titular adjuntadas. c) la inversión y la inmersión de las plantas. d) inserción de la bañera de infiltración. baño e) infiltración en lugar dentro de la cámara de infiltración. infiltrado vacío f) completo: bomba de vacío (1) (2) conexión de bomba de vacío a la válvula de aislamiento de depósito depósito vacío vacío (3) (4) conexión entre depósito vacío y la válvula de admisión de aire del calibrador de presión (5) (6) infiltración cámara (7) Tanque de vacío de cámara (8) infiltración. g) representante sale de una planta que se infiltraron con una construcción de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) después crecimiento de infiltración después de cinco días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Figura 3: previamente divulgados resultados representativos para la producción de preparación de derivados de la β-amirina usando este protocolo8. Esta tabla se ordena por producciones aisladas. Formatean condicional de columnas con indicación del valor relativo del color. Rojo = alto, verde = bajo (aunque intermedio amarillo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en las hojas de Nicotiana benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno. Es en este documento se describe un protocolo detallado para rápido (5 días) escala de preparativo de triterpenos y análogos utilizando esta potente plataforma basada en plantas.

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.2K vistas.  John Innes Centre. Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en las hojas de Nicotiana benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno. Es en este documento se describe un protocolo detallado para rápido (5 días) escala de preparativo de triterpenos y análogos utilizando esta potente plataforma basada en plantas.

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Investigación

Medio ambiente

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Expresión recombinante de celulasa de Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; En plantas de tabaco

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Bioquímica

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Biología

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

La optimización y utilización de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Extracción y purificación eficiente de GFP-His de hojas de N. benthamiana

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

Autor destacado: Optimización de la extracción de proteínas Apoplast para la recuperación eficiente de proteínas recombinantes de células vegetales

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

Método basado en la extracción de apoplastos para mejorar la pureza de la proteína recombinante producida por plantas  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

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