Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de macrófagos, como cómo caracterizar el estado de activación bajo diversos ambientes a nivel proteico. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece la oportunidad de obtener la diferencia de expresión de muchas proteínas en macrófagos humanos utilizando el método de cuantificación sin etiquetas. Demostrar el procedimiento serán Marie Malier y Magali Court de mi laboratorio.
Para comenzar, añada 15 mililitros de solución de separación de células de gradiente de densidad en cada uno de dos tubos de centrifugación de 50 mililitros para que la solución pueda calentarse a temperatura ambiente antes de recibir el LRSC. Esto es esencial ya que la densidad depende de la temperatura. Vacíe el LRSC en un tubo de centrifugación de 50 mililitros.
Añadir 1x PBS hasta 50 mililitros y mezclar. A continuación, muy lentamente, añadir 25 mililitros de la mezcla en la parte superior de 15 mililitros de solución de gradiente de densidad equilibrada. Tenga cuidado de no mezclar las fases durante este paso.
Se debe añadir sangre en la solución de gradiente de densidad sin ninguna alteración de esta fase. Centrifugar ambos tubos de centrifugación durante 25 minutos a 700 G sin roturas. Al final de la centrifugación de gradiente de densidad, las capas de abajo a arriba son los eritrocitos y granulocitos, formando el pellet, la fase de solución de gradiente de densidad, una capa de PBMC y el plasma diluido.
Con una pipeta, pasar a través de la fase de plasma sin aspirarlo. A continuación, recoja la capa PBMC en un nuevo tubo de centrifugación de 50 mililitros. Añadir hasta 50 mililitros de 1x PBS a los PBMC como una configuración de lavado y centrífuga durante 10 minutos a 300 G.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 40 mililitros de medios de macrófagos.
Después de hacer seda los PBMC en una cámara De Malassez, transfiera la cantidad de PBMC necesaria para llevar a cabo el experimento a un tubo de centrifugación. Centrifugar las células durante 10 minutos a 300 G.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 80 microlitros del búfer de clasificación por cada 10 millones de PBMC. A continuación, agregue 20 microlitros de microperlas CD14 por cada 10 millones de PBMC.
Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 grados centígrados bajo agitación constante. Después de la incubación, agregue un mililitro de tampón de clasificación por cada 10 millones de PBMC como paso de lavado, y centrifugar como antes. A continuación, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de clasificación por cada 100 millones de PBMC.
Ahora, coloque una columna en el campo magnético del separador. Prepare la columna enjuagando con tres mililitros de búfer de clasificación. Aplique la suspensión de celda en la columna.
A continuación, recoja el flujo a través de las celdas sin etiquetar para su posterior tinción, si es necesario. Lave la columna tres veces con tres mililitros de búfer de clasificación. Tenga cuidado de no secar la columna.
A continuación, coloque un tubo de recogida debajo de la columna y retírelo del separador. Después del lavado, pipetee cinco mililitros de tampón de clasificación en la columna. Enjuague inmediatamente las células etiquetadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo hacia la columna.
Por último, repita estos pasos con una nueva columna antes de encolar los monocitos y realizar la polarización de macrófagos como se describe en el protocolo de texto. Mantener los monocitos y los macrófagos en un ambiente controlado por oxígeno para realizar análisis de condición hipoxica. Utilice una estación de trabajo de hipoxia para mantener las células bajo la presión parcial de oxígeno deseada durante el experimento.
Cuando se trabaja bajo baja presión de oxígeno, es importante preparar todos los medios y tampones de lavado debajo de la estación, y esperar lo suficiente para obtener la presión parcial correcta en el líquido. Realice la lysis celular en un búfer bajo una capucha adaptada. Cargue el equivalente proteico de 300.000 células por cada muestra en geles de acrilamida 4-12%bis-tris.
Controlar la duración de la migración electroforética para permitir que cada muestra de proteína se divida en seis bandas de gel como se muestra aquí. Después de la fijación y tinción como se describe en el protocolo de texto, excúles las bandas de proteínas con un bisturí limpio. En dados cada banda extirpada antes de colocarlos en tubos de 500 microlitros.
Ahora, lave las rodajas de gel tres veces en 200 microlitros de bicarbonato de amonio milimolar durante 20 minutos a 37 grados centígrados, descartando el bicarbonato de amonio entre cada paso. Siga esto con un lavado en bicarbonato de amonio de 25 milimolares y acetonitrilo. A continuación, deshidratar las piezas de gel con 200 microlitros de 100% acetonitrilo durante 10 minutos.
Incubar cada pieza de gel con 10 TDT milimétrica y bicarbonato de amonio mili evolucionador durante 45 minutos a 56 grados centígrados. A continuación, deseche la TDT e incubar la pieza de gel con 55 yodoaceta milimétricas en bicarbonato de amonio de 25 milimolar durante 35 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Para detener la alquilación, deseche la solución usada e incubar cada pieza de gel con 200 microlitros de TDT de 10 mililitrolares en bicarbonato de amonio milimolar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Lavar las piezas de gel en 200 microlitros de bicarbonato de amonio de 25 milimolares. A continuación, deshidratar con 200 microlitros de 100% acetonitrilo durante 10 minutos. Digerir las proteínas durante la noche a 37 grados Celsius con Trypsin/Lys-C Mix de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Extrae los péptidos resultantes de las piezas de gel añadiendo 50 microlitros de 50%acetonitrilo durante 15 minutos en tubos de baja absorción. Después de añadir 50 microlitros de 5% de ácido fórmico durante 15 minutos, añadir 50 microlitros de 100%acetonitrilo durante 15 minutos. Tire y seque cada fracción en tubos de baja absorción para limitar la absorción de péptidos y la pérdida de la muestra.
Almacene las muestras a 80 grados centígrados hasta que se sigan analizando como se detalla en el protocolo de texto. Aquí se muestra la pureza representativa evaluada por la citometría de flujo después de la selección de cuentas magnéticas de monocitos positivos CD14. Las imágenes de contraste de fase de macrófagos humanos diferenciados muestran heterogeneidad de morfologías obtenidas para dos polarizaciones diferentes después de nueve días de cultivo.
Se muestra un ejemplo de una digestión fuera de gel utilizando geles de página SDS manchados de plata. La evaluación de la proteína de la lelisis celular y después de la digestión en la solución muestra la ausencia de degradación durante la lelisis y la eficiencia de la digestión. Aquí se muestra un ejemplo de un espectro de disociación inducido por colisión de un péptido encontrado en la relación masa-carga de 597.29 en el espectro de la MS con una carga eléctrica de dos positivos.
A partir de este espectro, se determinó la secuencia correspondiente. El resultado final después del análisis es un mapa de calor que representa la agrupación jerárquica de todos los estados de polarización utilizando proteínas expresadas diferencialmente. El análisis revela un grupo de proteínas sobre-expresadas en todas las polarizaciones en la condición de oxígeno del 3%.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que primero tienes que decidir qué tipo de fraccionamiento realizarás en nuevas muestras para adaptar tu protocolo en consecuencia. El enfoque proteómico que utiliza este trabajo es complementario a los enfoques genómicos que se han utilizado durante los últimos años en el campo de los estudios de polarización de la biología de macrófagos. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que el investigador en el campo de la inmunología explore los diversos estados de activación de las células inmunitarias en los seres humanos y también en otros mamíferos.
No olvide que trabajar con TDT podría ser peligroso, por lo que necesita trabajar bajo una capucha adaptada para realizar este procedimiento.
