Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo de la planta con respecto a la distribución de fitohormonas reguladoras del crecimiento. Mediante el uso de biosensores FRET genéticamente codificados, por ejemplo nlsGPS1 que detecta gibberellins, es posible medir la distribución dinámica de compuestos importantes en los tejidos de Arabidopsis en la solución celular. Generalmente, los individuos nuevos en esta materia tendrán problemas, porque el análisis de biosensores FRET implica imágenes ratiométricas que han aumentado el ruido y pasos analíticos adicionales en comparación con la intención de imágenes métricas.
Comience por sembrar aproximadamente 20 semillas de Arabidopsis esterilizadas en placas cuadradas de 1/2 Murashige y Skoog o MS agar. Selle las placas con cinta quirúrgica de poros y envuélvalas con papel de aluminio durante uno a tres días de incubación a cuatro grados Celsius para la estratificación. Para imágenes radiculares, transfiera las placas a una cámara de crecimiento en orientación vertical durante tres días en las condiciones indicadas.
Para el Hipocotilo de crecimiento oscuro, transfiera las placas a la cámara de crecimiento durante un pulso de luz de una a cuatro horas para sincronizar la germinación. A continuación, envuelva las placas con papel de aluminio y colóquelas en la cámara de crecimiento en una orientación vertical durante tres días. Para mediciones de estado estacionario, agregue 50 microlitros de solución simulada a un portaobjetos limpio y coloque suavemente tres sensores de percepción de gibberellin localizados nuclearmente, uno o nlsGPS1 que exprese plántulas en la diapositiva.
A continuación, coloque una gota de grasa al vacío en cada esquina de un resbalón de cubierta limpio y colóquela suavemente para cubrir el deslizamiento sobre las plántulas. Añadiendo cuidadosamente una solución simulada adicional para eliminar cualquier burbuja de aire según sea necesario. Antes del tratamiento con gibberellin four o GA4, utilice una jeringa de 20 mililitros llena de grasa al vacío y equipada con una punta de pipeta de 200 microlitros modificada con una abertura de un milímetro de diámetro para dibujar un rectángulo de tres centímetros y medio de largo por dos centímetros y medio de ancho en un portaobjetos de vidrio limpio.
Agregue 50 microlitros de solución simulada al centro del rectángulo y utilice fórceps limpios para levantar nlsGPS1 expresando plántulas por la parte inferior de sus cotiledones para una transferencia cuidadosa en la solución simulada. Coloque un resbalón de cubierta manchado con grasa al vacío como se acaba de demostrar en el centro del rectángulo de grasa al vacío y llene cuidadosamente el depósito con una solución simulada adicional sin perturbar las plántulas. A continuación, adquiera imágenes de las plántulas en un microscopio confocal equipado con láseres apropiados para que CFP y YFP sean emocionantes para realizar imágenes de transferencia de energía por resonancia de Forster.
Para GA4 para el tratamiento, retire la diapositiva de la etapa del microscopio y ajuste un temporizador durante 20 minutos. Retire inmediatamente la solución simulada del lado derecho del resbalón de la cubierta mientras agrega 17 microlitros de un cuarto de líquido MS complementado con un micro molar GA4 al lado izquierdo del resbalón de la cubierta hasta que se haya reemplazado toda la solución simulada. A continuación, vuelva a colocar el vaso en la etapa del microscopio y espere otros 10 minutos antes de adquirir la imagen de tratamiento después de GA4.
Para establecer un curso de tiempo para un tejido de interés, agregue 200 microlitros de solución simulada al centro del canal de perfusión de un deslizamiento pegajoso ibidi, y coloque suavemente las plántulas nlsGPS1 en la solución simulada como se ha demostrado. Utilice fórceps para colocar suavemente un resbalón de cubierta sobre las plántulas usando la parte posterior de los fórceps para presionar suavemente en los bordes exteriores del resbalón de la cubierta hasta que forme un fuerte vínculo con el material pegajoso en la periferia del deslizamiento pegajoso. A continuación, utilice dos conectores Luer de codo de diámetro interno de 0,8 milímetros y una pieza de tubo de silicona de diámetro interior de 0,8 milímetros para conectar el deslizamiento adhesivo a una jeringa de 20 milímetros llena de solución simulada y para conectar la corredera a un contenedor de salida para recoger la solución de salida.
Presione suavemente el émbolo para dispensar suficiente solución a la cámara para asegurarse de que no haya burbujas de aire y, a continuación, cargue la jeringa en una bomba de jeringa programable. A continuación, inicie la bomba para iniciar el curso de tiempo. Para los tratamientos GA4 durante el curso del tiempo, detenga la bomba para detener la perfusión y reemplace el tampón simulado que contiene la jeringa por una jeringa llena de un cuarto de líquido MS complementado con GA4.
Para el análisis de imágenes 3D, importe los archivos en el programa de software de análisis de imágenes IMARIS y abra el asistente de superficies. Establezca la resta de fondo en tres micras y el umbral predeterminado. Durante la segmentación de los núcleos tenga cuidado de no incluir los muchos núcleos con fluorescencia tenue, ya que la ración señal-ruido del objeto con niveles de señal de fondo cercanos será demasiado baja para el análisis de imágenes ratiométricas.
A continuación, enmascarar los canales de emisión CFP y FRET en función de las superficies creadas utilizando la emisión YFP. Utilice la extensión de la relación de intensidad media XT para calcular una relación de emisión del aceptador de excitación del donante dividida por la emisión del donante de excitación entre los valores de intensidad media de las superficies individuales en los dos canales. Para colorear las superficies individuales con la relación de emisión nlsGPS1, seleccione la codificación de color con estadísticas y establezca la relación de intensidad media como el tipo de estadísticas.
En el icono de estadísticas, exporte las proporciones de valores individuales de la tabla y copie y pegue los valores en una hoja de cálculo para la representación gráfica de los datos. En la raíz de Arabidopsis, el gradiente de la relación de emisión nlsGPS1 es indicativo de niveles bajos de GA4 en las zonas meristemática y de división y altos niveles de GA en la zona de elongación tardía. Por el contrario, no se observa un gradiente de relación de emisión en raíces no respuestas nlsGPS1, lo que sugiere que el gradiente ENDógeno GA4 no es un artefacto.
Un gradiente de relación de emisión nlsGPS1 también se forma en hipocotilos de crecimiento oscuro con niveles bajos en los cotiledones y el gancho típico y altos niveles en la región basal de rápidamente alargando del hipocotilo. Por el contrario, no se observa un gradiente de relación de emisión en los hipocotilos no respondes nlsGPS1. Además, el GA4 suministrado exógenamente se acumula preferentemente en la zona de elongación en comparación con la zona de división de la raíz de Arabidopsis, lo que indica que nlsGPS1 se puede utilizar para estudiar el patrón endógeno y exógeno de GA.
Además, el análisis del curso de tiempo de las plántulas nlsGPS1 tratadas con GA4, revela una acumulación más rápida de GA4 exógeno en el alargamiento de la raíz en comparación con la zona de división. Al intentar este procedimiento es importante recordar evitar píxeles saturados durante la imagen cuantitativa para mantener los parámetros de imagen constantes y minimizar los problemas de deriva y cambio focal durante la perfusión de la muestra. Siguiendo este procedimiento elaborado métodos, como las raíces de imagen que crecen en dispositivos de profusión de control de tipo de chip raíz se pueden realizar para responder preguntas adicionales sobre cómo los gradientes GA cambian en las puntas de raíz de Arabidopsis que crecen a diferentes velocidades o en respuesta al estrés Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo del crecimiento de la planta para explorar la distribución dinámica de las gibberellinas en tejidos y órganos arabidopsis thaliana adicionales.
