En este protocolo detallamos un modelo in vitro de tauopatía humana. Este método llena una necesidad de materiales que pueden ser útiles para la detección de fármacos y estudios del mecanismo de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que el paradigma del cultivo celular permite una evaluación más rápida de la toxicidad tau y las posibles terapias tau en comparación con los estudios en animales para comenzar este procedimiento descongelar el recubrimiento de la matriz de membrana del sótano para placas de cultivo a cuatro grados Celsius.
Haga alícuotas de un mililitro y guárdelas a menos 20 o menos 70 grados centígrados. A continuación, reconstituir el factor de crecimiento de fibroblastos básico en PBS estéril a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Haga alícuotas de 10 microlitros y guárdelas a cuatro grados centígrados.
A continuación, establezca una nueva botella sin abrir de 500 mililitros de DMEM-F12 con glutamina. Añadir 10 mililitros de B27, cinco mililitros de N2, y cinco mililitros de penicilina-estreptomicina para preparar los medios de células madre neurales. Coloque 50 mililitros del medio NSC en un tubo cónico y agregue 10 microlitros del bFGF preparado.
Almacene este NSC más medios bFGF a cuatro grados centígrados. En primer lugar, retire una alícuota de recubrimiento de matriz de membrana sótano congelado para placas de cultivo celular del congelador y permite descongelar a cuatro grados centígrados. Agregue 385 microlitros del recubrimiento de la matriz de membrana del sótano descongelado a cinco mililitros de medios DMEM-F12 que contengan penicilina-estreptomicina.
Si las células se están descongelando de las existencias de NSC congeladas, tome un vial de células congeladas del congelador y caliente en un baño de agua calentado a 37 grados Celsius moviendo el vial hacia adelante y hacia atrás en el agua. Después de esto, rocíe el vial con 70%etanol. Luego, bajo una capucha de cultivo celular, transfiera las células a aproximadamente 10 mililitros de medios DMEM-F12 que contienen penicilina-estreptomicina.
Centrifugar a temperatura ambiente a 1.000 g durante cinco minutos. A continuación, aspirar los medios y resuspender las células en medios NSC. Diluir las células en medios NSC para obtener la densidad de siembra adecuada para el recipiente de cultivo celular que se está utilizando.
Añadir suficientes células suspendidas en medios NSC para sembrar los platos de cultivo recubiertos de matriz de membrana del sótano. Crecer las células a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono hasta que sean 75 a 80%confluentes, asegurándose de cambiar los medios cada dos días. Para transducir neuronas con lentivirus, utilice un recuento de títulos de 340.000 unidades transducibles por célula.
Diluir las unidades transducibles en medios de cultivo celular a la concentración necesaria, y añadirlas a las células. Dos días después de agregar el lentivirus, lave las células una vez con medios frescos que no contengan bFGF. Continúe cultivando las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en los medios sin bFGF.
Mantener las células durante unas ocho semanas después de la transducción, asegurándose de cambiar los medios de cultivo celular cada dos días. Utilice un microscopio de luz para visualizar rutinariamente las células y garantizar la viabilidad. Después de la transducción, retire los platos de cultivo de la incubadora asegurándose de mantener la tapa en ellos para mantener el cultivo bien estéril.
Utilice un microscopio fluorescente capaz de obtener imágenes de células vivas para visualizar las células bajo un objetivo 10X con una excitación de 514 nanómetros y un filtro de emisión de 527 nanómetros. En este estudio, las neuronas transducidas con lentivirus tau-RDLM-YFP se etiquetan fluorescentemente con YFP. Los cultivos culturales transducidos por RDLM se ven para mostrar agregados después de la transducción.
Estas inclusiones manchan positivas para tioflavina. La diferenciación neuronal se confirma mediante el inmunoetiquetado del marcador específico de la neurona beta-tubulina III en cultivos. Es importante recordar que los anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente deben tener un espectro de emisión de excitación que no se superponga con el de YFP.
Aunque los agregados tau de fluorescencia amarilla serán visibles en ausencia de tinción, la tioflavina también debe utilizarse para la toma de imágenes con el fin de confirmar que la señal fluorescente es tau agregada y no residuos celulares. Después de la generación de células sobreexpresantes de tau, se pueden realizar una serie de evaluaciones de la salud neuronal y la agregación tau. Por ejemplo, hemos descubierto que estas células muestran degeneración axonal.
Además de los estudios de cultivo celular, hemos utilizado este método para examinar la patogenicidad de la tau derivada exosomal.
