Teniendo en cuenta el papel emergente del microbioma intestinal en varias enfermedades humanas, varios moduladores de microbioma intestinal como probióticos, prebióticos, dietas y medicamentos pueden ayudar a aliviar las dolencias de salud asociadas al microbioma intestinal. Sin embargo, no hay un sistema de cribado rápido y asequible disponible para predecir los efectos de estos moduladores del microbioma intestinal, pero este sistema es lo suficientemente simple como para predecir cómo las intervenciones particulares pueden afectar el microbioma intestinal que en última instancia puede afectar la salud del huésped. Este protocolo es simple, asequible y práctico para los laboratorios que investigan los moduladores del microbioma intestinal y sus efectos sobre la microbiota y la salud del huésped.
El mantenimiento de condiciones asépticas y anaeróbicas es crucial para este experimento. También se debe utilizar de nuevo el espécimen fecal, inmediatamente después de la recolección. De lo contrario, si el experimento se planifica más adelante, la muestra debe almacenarse en menos 80 inmediatamente después de la recolección, sin ninguna exposición a la temperatura ambiente y al aire.
La precisión de manipulación durante la preparación de alícuotas y pipeteo también es importante para mantener la precisión y la reproducibilidad. Tomará menos de 12 horas durante el día. Podemos construir una cultura de la noche a la mañana si necesitan las muestras en 24 horas.
Luego, seguido de los ácidos grasos de cadena corta y la determinación del microbioma. Este proceso lo demostrarán dos grandes estudiantes uni, Shokouh Ahmadi y Rabina Mainali de mi laboratorio. Para preparar los medios de fermentación bajo una campana de humo, en una botella de reactivo sobre la mezcla de imán, mezclar la solución A, la solución B, la solución mineral traza, la solución de vitamina soluble en agua, la solución de biotina de folato, la solución de riboflavina, la solución de heminina, la mezcla de ácidos grasos de cadena corta y la resazurina.
A continuación, añadir en la botella extracto de levadura, carbonato de sodio, clorhidrato de cisteína monohidrato, y tripticasa. Añadir 296,1 mililitros de agua destilada, ajustar el pH con un hidrocloruro normal o hidróxido de sodio para asegurarse de que es alrededor de 7.0. Transfiera el vaso de precipitados a una estación de trabajo aséptica y utilice un filtro de vacío con tamaño de poro a 0,22 micrómetros para filtrar el medio para esterilizar.
Para preparar una solución de dilución anaeróbica de un litro, disolver cinco gramos de cloruro de sodio, dos gramos de glucosa y 0,3 gramos de clorhidrato de cisteína monohidrato en el agua ionizada. Autoclave la botella de reactivo con tapa a 121,1 grados Centígrados durante 15 minutos, y guárdela dentro de la cámara anaeróbica. Antes del inicio del experimento de fermentación, conservar todos los materiales, soluciones y herramientas necesarias para el experimento de fermentación dentro de la cámara anaeróbica durante al menos 48 horas, para asegurarse de que se elimina cualquier residuo de oxígeno.
Al menos 24 horas antes del experimento de fermentación, pesa 300 miligramos de inulina, y lo transfiere a un tubo de 50 mililitros, que luego se coloca dentro de la cámara anaeróbica. Añadir 26 mililitros de medios de fermentación esterilizados en el tubo, y vórtice para mezclar. Permitir la hidratación de la fibra durante aproximadamente 24 horas.
El día del experimento de fermentación, preparar el inóculo fecal. Primero, pesa cinco gramos de muestra fecal fresca en un tubo cónico de 50 mililitros. Añadir solución de dilución anaeróbica al tubo para alcanzar un volumen final de 50 mililitros.
Vórtice durante 15 minutos, o hasta que se homogeneice por completo. Mantenga los tubos inoculados a 37 grados Celsius dentro de la cámara anaeróbica, e invierta suavemente una vez cada hora para resuspender las fibras y el inóculo. Después de tres, seis, nueve o 24 horas, saque la cantidad adecuada de medios fermentados y centrifugar las muestras a 14.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Congelar inmediatamente el sobrenadante y el pellet en nitrógeno líquido, luego después de congelar, almacenar el sobrenadante para el análisis de ácidos grasos de cadena corta, y pellet para el análisis del microbioma, a menos 80 grados Celsius. Este protocolo se utiliza para demostrar el efecto de un prebiótico específico. Las heces de sujetos humanos sanos, después del tratamiento con inulina, mostraron un pH relativamente estable durante nueve horas, mientras que disminuyeron drásticamente después de 24 horas.
La inoculación de la inulina aumentó significativamente los niveles de ácidos grasos de cadena corta y el lactato en la muestra fecal tratada con inulina se compara con el cultivo de microbiota fecal no tratado. El análisis de coordenadas principales muestra una composición de microbiota diferente a las medidas UniFrac ponderadas y no ponderadas de la diversidad beta entre las muestras tratadas con inulina y las no tratadas. Los índices de diversidad alfa frente a la diversidad filogenética a través de PD árbol entero, riqueza de especies, unidades taxonómicas operativas, paridad de especies, así como abundancia relativa de estatus y géneros importantes, presentan diferentes firmas de microbiota intestinal entre las muestras tratadas con inulina y no tratadas.
El cladograma taxonómico, derivado del análisis lineal del tamaño del efecto discriminante de las secuencias 16S, representa los taxones diferencialmente abundantes entre diferentes grupos de muestras. Siga todos los pasos cuidadosamente. Lo más importante es mantener condiciones asépticas y anaeróbicas estrictas.
El sobrenadante y del experimento se puede utilizar para tratar los cambios de nivel de ácidos grasos de cadena corta como resultado de la fermentación a base de fibras. Además, el en el pellet se puede utilizar para analizar los cambios en la composición del microbioma intestinal. Algunos productos químicos utilizados para fabricar los medios de cultivo son potencialmente peligrosos.
Por favor, la hoja MSDS y tome precauciones en consecuencia.
