Este protocolo describe la recopilación de datos masivos de microarray de unión proteína-ADN para primasa, una enzima que se une transitoriamente a secuencias de ADN específicas y a su vez cataliza la formación de imprimaciones de ARN. Este video cubrirá cómo la tecnología de microarray puede ayudar a redefinir los sitios de reconocimiento de secuencias de primasa y cómo un enfoque de alto rendimiento puede complementar la bioquímica clásica. Esta técnica combina dos enfoques: microarray de unión al ADN de primasa y ensayo de actividad de primasa.
El microarray proporciona datos masivos de unión de primasa a secuencias de ADN, donde como el ensayo bioquímico proporciona información sobre la formación de imprimación de ARN por primasa de ADN. La actividad enzimática probada depende de la información del experimento de microarray y de su menor rendimiento en su naturaleza. Se sondea el vínculo entre la eficiencia de la unión, la selección de la secuencia de ADN y la actividad de la enzima.
La identificación de la determinación de la secuencia mediante microarray, nos permite sacar conclusiones precisas basadas en datos masivos del microarray. Este enfoque se ha utilizado hasta ahora para describir secuencias de unión de ADN de factores de transcripción. Los factores de transcripción son proteínas estáticas que se unen estrechamente al ADN.
Demostrar el procedimiento será Stefan Ilic. Para comenzar este procedimiento, humedezca previamente la diapositiva del microarray colocándola en un frasco de coplina que contenga 0,01%Triton-X 100. Y girando sobre un rotador de laboratorio, agregue 125 rpm durante cinco minutos.
Pipetear la solución de bloqueo en una caja de plástico. A continuación, retire la diapositiva de microarray del frasco de coplina. Utilice una toallita fina para conducir el lado no ADN y los bordes de la diapositiva.
Coloque lentamente el microbarra en la caja de plástico. Incubar a temperatura ambiente durante una hora con agitación lenta. Después de esto, lave el portaobjetos una vez con 0.01%Tween-20 en PBS.
En un rotador de laboratorio a 125 rpm durante cinco minutos. Retire el Tween-20 y enjuague el portaobjetos una vez con 0.01%Triton-X 100 en PBS en un rotador de laboratorio a 125 rpm durante dos minutos. A continuación, transfiera rápidamente la diapositiva a un frasco de coplina que contenga PBS.
En primer lugar, monte la cámara PMB como se describe en el protocolo de texto. Coloque la diapositiva en el espacio designado. Usa pinzas para empujarla hacia abajo y hacia la izquierda.
Coloque la junta de silicio en la parte superior, asegurándose de que esté bien alineada con la parte inferior de la cámara PBM. A continuación, cierre la cámara y apriete los tornillos diagonalmente. Pipetear la mezcla de unión a proteínas en cada pozo de la junta.
Luego, incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para comenzar, pipetear 0.05%Tween-20 en PBS en la cámara PBM para lavar brevemente el portaobjetos. Con un aspirador de vacío, retire la solución de los pozos de la cámara teniendo cuidado de no tocar las manchas de ADN.
Repita esto, lave brevemente el portaobjetos con PBS. Y utilice el vacío para extraer la solución de los pozos de la cámara mientras tenga cuidado de no tocar las manchas de ADN. A continuación, agregue Alexa 488 conjugado anti-Su Anticuerpo a cada pozo de la cámara PBM.
Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de esto, lave brevemente el portaobjetos dentro de la cámara PBM añadiendo unas gotas de 0.05%Tween-20 en PBS en cada pozo. Y utilice el aspirador de vacío para eliminar la solución de los pozos de la cámara, teniendo cuidado de no tocar las manchas de ADN.
Desmonte la cámara PBM y retire la corredera. Enjuague los portaobjetos dos veces en 0.05%Tween-20 en PBS, con cada enjuagar durante tres minutos. Luego, enjuague los portaobjetos dos veces en PBS, con cada enjuagar durante tres minutos cada uno.
Y una vez en agua destilada doble durante tres minutos. Seque los portaobjetos con aire comprimido. Y guárdelos en una caja deslizante oscura hasta que estén listos para escanear.
Cuando esté listo, utilice un escáner de microarray para escanear el chip con una excitación de 495 nanómetros y una emisión de 19 nanómetros. Y recoger la intensidad de fluorescencia media. En este estudio pi rendimiento de perfiles de primasa se utiliza para asignar los sitios de enlace de primasa, incluidos aquellos que son difíciles si no imposibles de observar utilizando herramientas clásicas.
Es importante destacar que la generación de perfiles de primasa de rendimiento pi permite revisar la comprensión tradicional de los sitios de enlace de primasa. Especialmente pi throughput primasse profiling revela especificidades vinculantes además de las secuencias de reconocimiento 5'GTC3', que conduce a cambios en las actividades funcionales de la primasa de ADN T7. A saber, se identifican dos grupos de secuencias.
Secuencias de ADN de unión fuertes que contenían TG en los flancos y secuencias de ADN de unión débiles que contenían AG en los flancos. No se detectó ningún enlace de primasa a las plantillas de ADN que faltaban 5'GTC3'dentro de sus secuencias. Los sitios de reconocimiento de ADN de primasa que contiene características específicas como flancos ricos en TG, aumentan la unión de ADN de primasa hasta 10 veces.
Sorprendentemente, también aumentan la longitud del ARN recién formado. Es importante destacar que el perfilado de primasa de alto rendimiento nos permite observar y cuantificar la variabilidad en la longitud de imprimación en relación con la secuencia de la plantilla de ADN. Al realizar este procedimiento, los pasos de lavado deben ser sutiles.
Y los buffers deben contener componentes que registraron la primasa en el ADN. También se determina bioquímicamente un umbral de eventos de unión inútiles. Por lo tanto, el análisis de la microarray es insuficiente.
Métodos como una resonancia plasmática superficial y ensayos de desplazamiento de gel pueden determinar la afinidad de unión de la primasa para seleccionar las secuencias de ADN. Mi laboratorio implementa modelos de predicción de aprendizaje automático para detectar determinantes de secuencia de primasa que producen imprimaciones productivas que pueden ser extendidas por la polimerasa del ADN. En la era del big data, una implementación de métodos estadísticos para analizar big data, la técnica definitivamente ayudará a caracterizar mejor las secuencias de ADN específicas y vincular el reconocimiento de secuencias a la actividad de la primasa.
Cualquier persona que trabaje con radiación debe tener una comprensión exhaustiva de las regulaciones y los peligros asociados con el uso de radiación ionizante. Debe someterse a capacitación y debe trabajar con equipos de seguridad.
