El objetivo general de este procedimiento es esbozar los pasos quirúrgicos involucrados en la implantación de matrices de microelectrodos para el registro electrofisiológico crónico en marmotas de libre comportamiento. Los marmosets son pequeños primates que se utilizan cada vez más en la investigación de la neurociencia. Estos animales comparten muchas de las ventajas prácticas y logísticas de los roedores.
Su propensión al hermanamiento y la alta fecundidad a edades tempranas significa un acceso listo a cohortes grandes y genéticamente similares. Además, su pequeño tamaño corporal los hace fáciles y relativamente baratos de cuidar. Como primates, el marmoset tiene un sistema nervioso central que es mucho más similar al humano que al de un roedor.
Esto incluye un sistema visual y corteza prefrontal altamente desarrollado. Una ventaja que los marmotas tienen sobre muchas otras especies de primates, sin embargo, es el progreso realizado en la modificación genética de los mismas. Con un genoma profundamente secuenciado y un éxito que genera animales fundadores, que se llaman y noquean, está claro que el marmoset está listo para convertirse en un modelo poderoso para estudiar la función cerebral en la salud y la enfermedad.
Un método común para estudiar la función cerebral consiste en implantar electrodos en lugares anatómicamente específicos. Esto permite registrar crónicamente la actividad neuronal en diferentes áreas objetivo en animales despiertos y de comportamiento libre. Antes de la cirugía determinar la coordenada cero intraoral para todos los implantes y guías.
Para ello, conecte cada matriz de electrodos que se implantará en un soporte de electrodo y ajuste un microambrado al cero intraoral. Aquí es donde se encuentran las barras de los oídos. Repita esto para las matrices y soportes de electrodos adicionales, si es necesario.
Además, repita esto con una aguja de calibre 24 unida de forma similar a un soporte de sonda estereotaxico. Para matrices electrofisiológicas, se debe soldar un cable de tierra a cada otro tornillo que se utilizará. Por último, organice y estelice todos los instrumentos, equipos y desechables en preparación para el procedimiento quirúrgico.
El día de la cirugía asegurar que el animal no ha comido durante seis horas antes de comenzar la anestesia. La atropina y la ketamina se utilizarán para inducir la anestesia mediante inyecciones intramusculares secuenciales. A continuación, afeitar la cabeza de los animales con cortadoras de barbero.
Es importante intubar al animal durante la cirugía. Nuestro método preferido consiste en fijar una banda elástica a la mesa quirúrgica que insertamos detrás de los animales caninos mientras está en una posición supina. A continuación, usamos una sonda con punta de algodón para secar la lengua del marmoset y agarrarla con una mano.
Esto permite a un técnico abrir la boca y las vías respiratorias con una sola mano. Después de insertar el tubo endotraqueal, adjúntelo al conjunto de anestesia con el respirador artificial establecido en 40 respiraciones por minuto. Asegure el tubo y el montaje con cinta adhesiva, según sea necesario.
Con el marmoset ahora en posición propensa fijar la cabeza del animal en el marco estereotaxico. Para ello, primero, inserte la punta de la barra de la oreja derecha en el canal auditivo derecho del animal. Seguido por la barra de la oreja izquierda en el canal auditivo izquierdo.
A continuación, la cabeza debe nivelarse de modo que el plano horizontal sea paralelo al marco, mientras que el plano anterior/posterior está centrado. Esto se logra centrando primero la cabeza del animal usando las medidas de la barra de la oreja aseguradas a distancias iguales. Después de esto, la pieza de la boca se inserta en la boca del animal, y se ajusta hasta que toca la paleta del animal, mientras que las barras orbitales sólo están tocando el margen inferior del hueso orbital.
Como el plano horizontal se define como el plano que pasa a través del margen inferior del hueso orbital y el centro de los médicos externos, uno debe asegurarse de que la superficie inferior del hueso orbital ahora está alineada horizontalmente con el centro de las barras de las orejas antes de continuar. Durante el procedimiento, es importante mantener todos los signos vitales. Por lo tanto, se debe conectar un oxímetro de pulso portátil a la mano del marmoset para asegurarse de que la frecuencia cardíaca y la saturación de oxígeno están dentro de los rangos aceptables.
Además, una sonda de temperatura rectal conectada a una almohadilla de calentamiento homeotérmica para 37 grados centígrados, y pegada a la cola, asegurará que la temperatura corporal del marmoset no se vea afectada negativamente por la anestesia. El último paso preoperatorio es limpiar y desinfectar la cabeza afeitada del animal con clorhexidina y yodo, antes de cubrir al animal con un campo quirúrgico esterilizado. Realizar una incisión en la línea media del cuero cabelludo después de aplicar un analgésico local en este sitio.
Para preparar la superficie del cráneo, primero, desasocie cuidadosamente el músculo temporal del cráneo. Esto se hace cortando la fosa en su inserción en el cráneo con un bisturí. Después de lo cual, el músculo temporal debe separarse suavemente del cráneo, utilizando una raspación periosteal.
Continuar con la raspación periosteal eliminar el periosteo de todo el cráneo expuesto raspando. A continuación, marque la ubicación de la craneotomía creando agujeros de rebaba poco profundos en la superficie ósea y perforando el perímetro de la craneotomía. Taladre de seis a ocho orificios de tornillo, según sea necesario, en el cráneo e implante los tornillos.
En este momento, enrolle los cables de tierra soldados a un tornillo dado alrededor del tornillo adyacente sin soldar. Retire el hueso en el centro de la craneotomía usando fórceps McPherson. Mientras que el cerebro y la dura mater están descubiertos mantenerlos hidratados con solución salina estéril.
Para extraer el dura mater, se debe doblar una aguja de calibre 25 o 26 a aproximadamente 90 grados para facilitar la punción y el levantamiento de la superficie de la dura mater lejos de la superficie del cerebro. En este punto, las micro tijeras se utilizan para extirpar la dura mater. Fije los electrodos al micromanipulador estereotaxico y colótelo, de modo que el electrodo esté en las coordenadas anteriores/posteriores y mediales/laterales deseadas.
Ahora, baje la punta del electrodo hasta que toque la superficie del cerebro. Inserte lentamente la matriz en el cerebro, hasta que alcance las coordenadas dorsales/ventrales deseadas. Agregue una gota de pintura plateada entre el cable de tierra y cada tornillo para garantizar una conexión eléctrica.
Asegure el electrodo al cráneo aplicando acrílico dental al cráneo expuesto, un tornillo y la matriz de electrodos. Repita este procedimiento de implantación con cualquier matriz adicional. Por último, utilizando acrílico dental, hacer una tapa de cabeza resistente alrededor de la extensión lateral de las matrices y completamente en caso de que los cables de tierra y cualquier cráneo o tornillos expuestos.
Si es necesario, se puede insertar una barra de soporte en la tapa de la cabeza y sellarla en su lugar con acrílico dental. Después de la creación de la sutura de la tapa de la cabeza la piel si el músculo o el tejido óseo está expuesto. También se debe aplicar una solución antiséptica a la herida en este momento.
Con la cirugía completada es hora de comenzar la recuperación. En primer lugar, apague el suministro de isoflurano, pero no el oxígeno, y retire al animal del marco estereotaxico. Coloque el animal en la página de calentamiento, con el oxígeno mantenido a través del tubo endotraqueal.
Cuando comience el primer signo de reflejos neurogénicos como espasmos laríngeos, retire el tubo endotraqueal. Ahora se debe suministrar oxígeno con una máscara hasta que el animal presente signos claros de recuperación anestésica, como reflejos protectores, tono postural e intentos de ambulate. El marmoset debe ser alojado individualmente, y dejado para recuperarse en una jaula limpia y espacio durante 24 a 48 horas, antes de regresar a su jaula de origen.
Los animales implantados deben estar alojados en jaulas separadas. Es importante observar al animal durante al menos una hora después de la cirugía para observar los signos de angustia y, específicamente, los movimientos descoordinados. Los antibióticos y analgésicos y los medicamentos antiinflamatorios deben administrarse en los días siguientes a la cirugía para controlar el dolor y prevenir la infección.
En cirugías exitosas, el animal debe ser completamente recuperado dentro de tres a cinco días. Recomendamos que las sesiones de grabación electrofisiológicas comiencen al menos una semana después de la cirugía. Al comienzo de cada sesión de grabación anestesia ligeramente al animal usando isoflurano y conecta el conector de matrices de electrodos a un sistema de grabación neuronal.
Coloque el animal dentro de la cámara experimental y espere a la recuperación anestésica completa antes de comenzar las grabaciones. Después de una cirugía exitosa, es posible registrar picos y potenciales de campo locales de los electrodos implantados durante varias semanas. En última instancia, una confirmación final de que las matrices de electrodos se implantaron con éxito en las estructuras de destino debe ser preformada post mortem.
Las secciones teñidas de Nissl que contienen electro tracks se pueden utilizar para determinar la posición de cada microeléditos implantado. Las grabaciones electrofisiológicas crónicas en animales que se comportan despiertos son técnicas poderosas utilizadas en muchas líneas de investigación en neurociencia. Como el marmoset común ofrece muchas ventajas sobre los modelos históricamente populares, el propósito de este video, es ayudar a otros neurocientíficos a adoptar el marmoset común para su investigación.
Además de la implantación de electrodos de grabación crónica, como se detalla en este video, el mismo protocolo de cirugía estereotaxica se puede adaptar para muchos otros extremos experimentales, incluyendo la implantación de electrodos estimulantes, cánulas guía y microinycciones. Al adaptar este protocolo para una de las técnicas mencionadas, el cirujano modificará principalmente el procedimiento de perforación para ajustarse al tamaño del implante deseado. Además, el procedimiento de tierra no es necesario para muchas de estas técnicas y, por lo tanto, puede omitirse.
Independientemente del objetivo experimental, después de ver este video usted debe tener una comprensión sobre cómo realizar con éxito la neurocirugía estereotáctera en el marmoset común.
