Este protocolo permite que el FSB y la recolección de sangre en la corrección cuantitativa de los niveles de proteína del FCA mida en una síntesis de proteínas del ratón en modelos de ratón de trastornos neurológicos. Este procedimiento proporciona una línea de base, contra la cual se puede evaluar el origen fisiopatológico de las proteínas de interés del CSF, y la estabilidad y la importancia funcional del cáncer de contraprocidad en sangre. El análisis de la síntesis de proteínas interteales y la integridad de la barrera se puede aplicar a otros modelos animales y estudios en humanos.
Por ejemplo, para comprobar si hay enfermedades del sistema nervioso central. La recolección de volúmenes significativos de FPC limpio puede ser técnicamente difícil en ratones, por lo que se recomienda practicar la técnica hasta obtener grandes volúmenes de muestras no contaminadas. Demostrando los procedimientos estará Micheal Linzey, un estudiante de posgrado del programa de medicina experimental y molecular de Dartmouth, en nuestro nuevo grupo de investigación en inmunología.
Para la recolección de suero a través de sangrado orbital retro. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal en un ratón anestesiado de más de 15 gramos, agarre la piel suelta detrás de las orejas con el pulgar y el dedo índice de la mano no dominante, y utilice el dedo índice para extraer la piel por encima de los ojos. Usando el pulgar para extraer la piel debajo de los ojos, coloque la punta de una pipeta Pasteur, sostenida en un ángulo de aproximadamente 45 grados, en la cavidad del ojo debajo del globo ocular, dirigida hacia el centro de la cavidad ocular, mientras gira la pipeta entre los dedos.
A continuación, aplique una presión suave y suave y suéltelo para permitir que la sangre entre en la pipeta. Cuando se haya recogido la muestra de sangre, retire suavemente el capilar sin herir el ojo y transfiera la sangre a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Después de cerrar el párpado, aplique una presión leve con gasa para evitar más sangrado.
Deje que la sangre coagule durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente antes de girar la muestra por centrifugación. Con una técnica de pipeta limpia, recoja el suero separado en un nuevo vial de 500 microlitrotro etiquetado e inmediatamente congele el suero a 80 grados centígrados. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, retire un área lo suficientemente grande del cabello para permitir la recolección del líquido cefalorraquídeo inmediatamente en el extremo caudal del cráneo del ratón anestesiado.
Coloque el ratón en una posición propensa en un dispositivo estereotaxico en condiciones estériles y estacione la cabeza con barras de oído. Swab el sitio quirúrgico con 30%clorhexidina diacetate, y hacer una incisión de la piel sagital inferior al occipucio para exponer los músculos que sobrepasan la cisterna magna. Usando fórceps, disecciona el tejido subcutáneo y los músculos, y usa micro retractores para mantener los músculos separados para exponer la capa meningeal dura mater sobre la cisterna magna.
Lave suavemente el tejido con PBS estéril para eliminar cualquier posible contaminación de la sangre, y use un hisopo de algodón estéril para borrar la dura mater seca. Colocar la punción inicial en la cisterna magna es esencial para obtener un CSF abundante y no contaminado. Con una aguja de calibre 30, perfore suavemente la membrana que cubre la cisterna magna, e inserte rápida y suavemente un pequeño tubo capilar de vidrio en la punción.
Cuando se hayan recogido cinco a 12 microlitros de líquido cefalondidor, retire cuidadosamente el tubo de la membrana y utilice un trozo de tubo de polietileno para conectar el tubo a una jeringa de tres mililitros. Inyecte el lesc sobre hielo en un tubo de 500 microlitros etiquetado y utilice una aguja desechable y suturas variadas de polidioxanona para cerrar la incisión. Limpie el área de cualquier sangre o tejido seco, y coloque el ratón en una jaula limpia y cálida con monitoreo hasta la recumbencia completa.
Recoger el FV por centrifugación, e inspeccionar visualmente el pellet y supernarlo en busca de cualquier signo de contaminación de la sangre. A continuación, utilizando la técnica de pipeta limpia, transfiera el supernato que contiene CSF a un nuevo tubo de 200 microlitros, y diluya el CSF en una proporción de uno a tres con PBS para su almacenamiento inmediato a 80 grados centígrados. Para la recolección de suero por punción cardíaca, inmediatamente después de la recolección de CSF, como acaba de demostrar, coloque el ratón en la posición supina.
Frota la piel abdominal con 70%alcohol. Use tijeras para abrir la cavidad torácica, exponiendo el corazón e inserte una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de 3 mililitros en el ventrículo izquierdo. A continuación, aplique suavemente presión negativa en el émbolo de la jeringa, retirando la aguja después de que se haya recogido la sangre.
Presione el émbolo para expulsar la sangre recogida en un vial de 1,5 mililitros. Ahora, deje que la sangre coagule durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente antes de separar el suero por centrifugación. A continuación, utilizando una técnica de pipeta limpia, transfiera el suero a un nuevo vial de 500 microlitro etiquetados para su almacenamiento inmediato a 80 grados centígrados.
Para cuantificar las proteínas objetivo y albúmina en muestras de suero y CSF coincidentes, utilice un ensayo de cuantificación de proteínas estándar, utilizando proteínas estándar referenciadas para preparar una curva estándar para cada proteína de interés. Después del análisis, exporte los datos sin procesar a un programa de gráficos de software adecuado y grafique la intensidad de fluorescencia de la señal de detección frente a las concentraciones de proteína estándar para crear una curva estándar para cada proteína de interés. A continuación, utilice las curvas estándar para calcular las concentraciones de cada analito de interés en las muestras.
Por último, utilice las concentraciones de analito de albúmina y de destino para calcular los valores Q y el índice intratecal. Los niveles reales de IgG total se incrementan significativamente en el CSF de dos modelos de roedores probados de esclerosis múltiple, en comparación con los controles falsos coincidentes con la edad correspondiente. Los ratones R-EAE muestran valores de cociente de albúmina significativamente mejorados, lo que indica una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica en estos ratones.
No esversa que no existan diferencias en el cociente del albúmina entre TMEV-IDD y los ratones falsos, corroborando los hallazgos anteriores de una barrera intacta en ratones TMEV-IDD. Además, en los animales TMEV-IDD, se observan valores de índice IgG significativamente más altos y, por lo tanto, la producción intratecal de IgG. El cálculo de un índice de proteínas facilita la identificación de nuevos biomarcadores proteicos útiles para el diagnóstico precoz, la predicción de resultados y el seguimiento de los cursos de enfermedades para enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas.
