Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Los autores quieren reconocer que esta investigación ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea para el proyecto PATROLS, en virtud del acuerdo de subvención Nº 760813

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las aplicaciones para modelos hepáticos 3D varían considerablemente dependiendo de la variable bioquímica particular o la vía de resultado adversa que se dirige. Cada modelo tiene sus beneficios y limitaciones, desde la variación interdonor en los modelos primarios de hepatocitocito humano (PHH) hasta la reducción de la actividad del citocromo p450 en modelos basados en líneas celulares, pero todos son valiosos por derecho propio6,12,18,19. Al evaluar la genotoxicidad hay limitaciones en la compatibilidad de los modelos con los puntos finales aprobados por la reglamentación, como el ensayo de micronucleos in vitro, ya que se requiere proliferación activa. Esto es necesario, ya que la evaluación de la genotoxicidad requiere la cuantificación de los daños fijos del ADN para ser evaluados después de la división celular cuando hay oportunidad de reparación del ADN para corregir lesiones transitorias. Desafortunadamente, los esferoides a base de hepatocitos altamente diferenciados (es decir, HepaRG) o microtissues PHH, que se consideran que exhiben las características hepáticas más fisiológicamente relevantes forman modelos estáticos (no proliferativos)12,19,20. Como resultado, el modelo esferoide 3D HepG2 presentado aquí proporciona un modelo adecuado y alternativo capaz de soportar pruebas de genotoxicidad. Los esferoides basados en líneas celulares HepG2 tienen suficientes células divisorias activas en la superficie externa de los esferoides manteniendo características básicas similares al hígado, como la producción de albúmina y urea y alguna actividad cyp4505,12,19. Principalmente este modelo hepático in vitro se ha desarrollado para complementar el ensayo de micronucleus, ya que este es uno de los dos ensayos in vitro recomendados en la batería para pruebas de genotoxicidad8,10,11,21. Sin embargo, el modelo se puede aplicar fácilmente a las tecnologías de análisis de secuenciación de ADN y expresión génica (ARN), mientras que tiene el potencial de adaptarse y utilizarse aún más para otras variables de daño de ADN, como el ensayo del cometa. No obstante, es importante considerar el papel que desempeña la interferencia en el MEDE en algunos análisis de puntos finales. Por ejemplo, los análisis basados en citometría de flujo pueden no ser adecuados para la evaluación de la genotoxicidad en OCA específicamente debido a la interferencia de partículas22.
Un factor limitante de los modelos esferoides que se someten activamente a la división celular es su tamaño. La optimización de la densidad de siembra es crítica, ya que debe haber suficientes células que permitan que el modelo siga proliferando; pero no demasiado alto un número de células, lo que resulta en el esferoide se vuelve demasiado compacto, lo que conduce a un aumento del núcleo necrótico. Se cree que la causa de esta necrosis es la difusión restringida de oxígeno y nutrientes, ya que se cree que el límite de esta difusión es de aproximadamente 100 – 150 μm de tejido23,24. Sin embargo, esto depende del tipo de celda, el número de celda, las interacciones de andamios y las condiciones de cultivo25. Desde entonces, se ha demostrado que aproximadamente 700 μm de diámetro es el límite para evitar la aparición prematura de necrosis en el centro de esferoides C3A, la siembra de 4000 células HepG2 por esferoide asegura que el diámetro del modelo en el momento de la exposición sea ≤500 μm26. Además, Shah et al. establecieron que las células HepG2 sembradas por encima de 5000 células por esferoide presentaban una reducción del 25% en la viabilidad después de 7 días de cultivo, que podrían pertenecer al diámetro medio de 680 μm y una disponibilidad limitada de nutrientes en una caída colgante de 20 μL5. Para superar esto, el modelo ideado en el presente protocolo se somete a un paso crítico donde la gota colgante se transfiere a pozos recubiertos de agarose después de la formación inicial del esferoide. Esto garantiza un mayor volumen de medio de cultivo está presente para mantener el número cada vez mayor de células dentro de los esferoides. Como resultado, el modelo esferoide HepG2 sigue siendo más del 70% viable después de 10 días en cultivo y se puede utilizar para la evaluación de riesgos a largo plazo invitro.
Mientras que el modelo esferoide HepG2 puede soportar regímenes de exposición tanto agudos como a largo plazo, el medio de cultivo celular refrescante durante períodos de cultivo prolongado está restringido para este modelo, ya que no se recomienda la sustitución completa del medio debido a la pérdida potencial de los esferoides. Se presume que con las exposiciones en el ENM, la tendencia a las dispersiones homogéneas de ENM a aglomerar y sedimentos es alta. Sin embargo, es notable que la velocidad a la que un sedimento ENM puede variar dependiendo de los parámetros de partículas (por ejemplo, tamaño, forma y densidad) y se puede determinar teóricamente utilizando el modelo de sedimentación in vitro, difusión y dosimetría (ISDD), o sus derivados recientes, a menudo referidos cuando con respecto a la exposición ENM (suspensión) se acerca a27,28. Con esto es mente, se supone que si sólo el 50% del medio de cultivo celular se elimina cuidadosamente de la superficie del cultivo celular, la interrupción y posterior eliminación de la dosis de ENM debe ser en teoría mínima. Sin embargo, con el movimiento browniano en juego, esto puede no ser estrictamente el caso y se deben seguir trabajando en la deposición y sedimentación de cada ENM en particular que se va a probar para garantizar que la dosimetría correcta se conserve a lo largo de los regímenes de exposición a largo plazo27. Principalmente, se trata de una limitación potencial a tener en cuenta al realizar regímenes de dosificación repetidos, ya que esto podría ser crítico para la concentración final y acumulada. Por otra parte, las exposiciones basadas en productos químicos, si bien no están exentos de sus propias limitaciones a tener en cuenta, ofrecen un enfoque más simplista en el sentido de que las sustancias químicas tienden a permanecer en solución y, por lo tanto, una sustitución directa de la concentración química original, además de la concentración recién añadida, garantiza que cualquier producto químico perdido durante la actualización de los medios de comunicación se sustituye en consecuencia29. Las aplicaciones futuras incluirían la evaluación de la idoneidad del modelo de regímenes de exposición repetidos durante períodos de cultivo a largo plazo, ya que las estrategias de dosificación repetidas son cruciales para evaluar la capacidad de un sistema de órganos en particular para mejorar o superar los efectos adversos, si los hubiera, inducidos por la bioacumulación de una sustancia xenóbiótica.
En conclusión, este modelo hepático in vitro 3D tiene la capacidad de ser utilizado para evaluar una gama de escenarios de exposición realistas, proporcionando así un enfoque in vitro futuro para apoyar mejor tanto la evaluación de riesgos enemis como químicos de una manera rutinaria y de fácil acceso.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Debido al rápido desarrollo e implementación de una amplia gama de nanomateriales de ingeniería (ENM) a través de una plétora de aplicaciones basadas en humanos (por ejemplo, alimentos, cosméticos, ropa, equipos deportivos, electrónica, transporte y medicina), es inevitable que los seres humanos estén expuestos a LAM de forma regular. Con esto, hay mayores preocupaciones de que las características fisioquímicas específicas de tamaño novedosas que consideran estos materiales ventajosos en numerosas aplicaciones podrían causar efectos adversos sobre la salud humana y el medio ambiente de manera concomitante. Actualmente existen muchas actividades internacionales para reflejar activamente exposiciones más fisiológicamente relevantes a estos ENM y evaluar la toxicidad potencial de estos materiales en escenarios agudos, a largo plazo y repetidos de exposición a dosis bajas.
La toxicología hepática es clave a la hora de considerar la exposición a la ENM, ya que es ampliamente conocido que el hígado es un sitio importante de acumulación de ENM después de la exposición1,2. Además, el hígado es el sistema de órganos primarios para el metabolismo y desintoxicación de sustancias que entran en circulación sistémica3. Sobre la base de la comprensión aceptada de que los modelos de hepatocitos 2D no imitan con precisión las complejidades de interacciones multicelulares intrincadas o representan adecuadamente la actividad metabólica observada in vivo, se ha establecido un mayor enfoque en el desarrollo de modelos hepáticos 3D in vitro robustos y fisiológicamente relevantes para tecnologías sustitutivas in vivo4,5. La utilización de tecnologías avanzadas de cultivo 3D mejora la longevidad de los modelos hepáticos in vitro, lo que permite investigar regímenes de exposición repetida a largo plazo. Además, este formato de cultivo avanzado promueve la formación de características fisiológicas y organotípicas mejoradas como biliar canaliculi, procesos de transporte activo y capacidades mejoradas de metabolización de fármacos CYP450, mejorando así la predictividad de los modelos6. Los modelos hepáticos in vitro 3D actuales que consisten en monocultivos (sólo hepatocitos) o co-cultivos (hepatocitos con células no parnquimales) existen en varios formatos, que van desde microtissues o esferoides en placas de adhesión ultrarrápidas, esferoides colgantes, células incrustadas en matrices y/o andamios y plataformas de cultivo celular microfluídico, todos los cuales se consideran modelos in vitro avanzados eficaces para la evaluación de toxicidad hepática6,7. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas modelo son de alto mantenimiento, requieren equipos especializados y son caros. Además, estos modelos suelen ser estáticos (es decir, modelos celulares que no cumplen) que impiden su uso en la evaluación de puntos finales de riesgo, como pruebas de genotoxicidad utilizando métodos que cuantifican el daño fijo del ADN. La genotoxicidad es un requisito previo básico en la toxicología regulatoria, y es un componente vital de la evaluación del riesgo de cualquier tóxico8. No hay un solo ensayo que pueda aplicarse para cuantificar todas las formas de daño del ADN que puedan surgir después de la exposición a un agente exógeno. Sin embargo, un componente central de la batería de pruebas de genotoxicidad in vitro es el ensayo de micronucleos, que es una técnica fiable y multifacética que mide el daño cromosómico bruto9. Es una técnica estándar de oro descrita por la Guía de Examen 487 de la OCDE, para evaluar los daños in vitro del ADN y la genotoxicidad y forma parte del requisito de batería de prueba para la evaluación de riesgos reglamentarios10,11.
La línea celular de carcinoma hepatocelular humano, HepG2, se utiliza ampliamente para la detección inicial de evaluación de riesgos, ya que las células están disponibles, relativamente baratas de obtener, fáciles de cultivar y aptos para un cribado de alto rendimiento12,13. Cuando se cultivan en estructuras esféricas 3D, se ha demostrado que recapitulan bien el microambiente hepático y ofrecen un modelo hepático con capacidades proliferativas suficientes para soportar el ensayo micronucleus3. Se estableció un mayor desarrollo de los modelos esferoides HepG2 para mejorar la longevidad y la funcionalidad hepática del modelo con el fin de apoyar la evaluación del riesgo de genotoxicidad a largo plazo, regímenes de exposición repetida (≤14 días). Así, en consonancia con los principios de los 3R para sustituir, reducir y refinar la experimentación con animales, se ha establecido el presente protocolo para proporcionar un modelo hepático in vitro 3D avanzado capaz de evaluar de forma fiable múltiples variables toxicológicas (por ejemplo, funcionalidad hepática, marcadores inflamatorios (pro), citotoxicidad y genotoxicidad) siguiendo exposiciones químicas y ENM agudas, a largo plazo y repetidas de forma rutinaria y de fácil acceso.
Aquí, presentamos un método para establecer una línea celular hepatocito 3D fisiológicamente relevante basada en el sistema modelo in vitro para la evaluación de riesgos de genotoxicidad después de exposiciones agudas o repetidas enM a largo plazo. El protocolo se puede dividir en 6 etapas clave: cultivar células HepG2 criopreservadas; Preparación de esferoides hepG2; Transferencia de esferoide hepG2 de caída colgante a suspensión de agarose; Cosecha de esferoides hepG2; ensayo y puntuación de micronucleus; y análisis de datos.

<table><tbody><tr><td>Aflotoxin B1</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG Albumin Assay</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Powder</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell Freezing Aid</td><td>Thermo Fisher Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Filter Cards for Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, UK</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Glass Slides</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td><td>VWR Chemicals, UK</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer and Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil for Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Class II Tissue Culture Hood</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Filtered, Sterile 200&amp;micro;l and 1000&amp;micro;l Pipette tips</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, Denmark</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and P200 micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 and P50 multi-channel pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Buffer Tablets</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&quot; - Probe</td><td>Branson, USA</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>T-25 (690175) and T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Urea Assay Kit</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon Disinfectant</td><td>DuPont, UK</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath (37?C)</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;micro;m Filter Unit</td><td>Millex HA, MF-Millipore, UK</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL Syringe</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, UK</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Germany</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL Pasteur Pipette</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Conical Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL or 100mL Glass Bottles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Skirted Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm Square, Petri Dish</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

Debido al rápido desarrollo e implementación de una amplia gama de nanomateriales de ingeniería (ENM), la exposición a ENM es inevitable y el desarrollo de sistemas de prueba in vitro robustos y predictivos es esencial. La toxicología hepática es clave al considerar la exposición a la ENM, ya que el hígado desempeña un papel vital en la homeostasis metabólica y la desintoxicación, además de ser un sitio importante de acumulación de ENM después de la exposición. Sobre la base de esto y la comprensión aceptada de que los modelos de hepatocitos 2D no imitan con precisión las complejidades de las intrincadas interacciones multicelulares y la actividad metabólica observada in vivo, hay un mayor enfoque en el desarrollo de modelos hepáticos 3D fisiológicamente relevantes adaptados para fines in vitro de evaluación de riesgos ENM. De acuerdo con los principios de los 3R para reemplazar, reducir y refinar la experimentación con animales, se ha desarrollado un modelo hepático basado en líneas celulares 3D HepG2, que es un sistema fácil de usar y rentable que puede soportar regímenes de exposición ENM extendidos y repetidos (≤14 días). Estos modelos esferoides (≥500 μm de diámetro) conservan su capacidad proliferativa (es decir, modelos de células divisorias) lo que les permite combinarse con el ensayo de micronucleus 'estándar de oro' para evaluar eficazmente la genotoxicidad in vitro. Su capacidad para informar sobre una gama de puntos finales toxicológicos (por ejemplo, función hepática, (pro)respuesta inflamatoria, citotoxicidad y genotoxicidad) se ha caracterizado utilizando varios ENM en regímenes de exposición agudos (24 h) y a largo plazo (120 h). Este modelo hepático in vitro 3D tiene la capacidad de ser utilizado para evaluar exposiciones enM más realistas, proporcionando así un enfoque in vitro futuro para apoyar mejor la evaluación de riesgos enM de una manera rutinaria y de fácil acceso.

La idoneidad de este modelo esferoide hepático 3D basado en líneas celulares para el cultivo a largo plazo y la evaluación de riesgos genotóxicos se evaluó mediante la realización de caracterización basal para determinar la viabilidad y la funcionalidad hepática del modelo durante la duración de 14 días en el cultivo, así como su aplicabilidad para el ensayo de micronucleus.
Caracterización basal del modelo esferoide hepg2 hepático 3D Antes de cualquier evaluación toxicológica in vitro, es importante comprobar que los esferoides 3D HepG2 se han formado correctamente antes de realizar la transferencia de agarose o tratamiento químico/ENM. Los esferoides hepG2 producidos utilizando el método de caída colgante suelen tardar de 2 a 3 días después de la siembra (4000 células/esferoides) en formar esferoides compactos en forma esférica con un diámetro promedio de 495,52 μm W x 482,69 μm H como se muestra en la Figura 5A-5C. Los esferoides hepG2 que se han formado correctamente y son aceptables para ser utilizados para la evaluación toxicológica in vitro deben tener una estructura compacta, en forma esférica con una superficie lisa y sin proyecciones visuales. La Figura 5 proporciona ejemplos de buena calidad (Figura 5D-F) y una mala calidad (Figura 5G-I) esferoides. Este último debe descartarse. Por lo general, el 90-95% de los esferoides formados por placa se formarán correctamente y serán viables para una mayor experimentación.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figura 5: Imágenes de microscopía ligera que muestran la morfología natural de los esferoides HepG2 formados a través del método de caída colgante. (A-C) mostrar día 2 y (D-I) Día 4 Esferoides hepG2 después de la siembra. (D-F) son ejemplos de esferoides HepG2 de buena calidad, mientras que (G-I) muestra esferoides mal formados. Todas las imágenes fueron tomadas con un objetivo X20 usando un microscopio. La barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para confirmar aún más la viabilidad esferoide hepg2, se puede realizar un ensayo básico colorimétrico bromocresol verde albúmina (BCG) o ensayo Urea para evaluar su funcionalidad similar al hígado. La funcionalidad similar al hígado se evaluó de acuerdo con la viabilidad utilizando el ensayo trypan blue exclusion durante un período de cultivo de 14 días para determinar la longevidad del modelo de esferoides hepáticos y establecer si podría apoyar la evaluación de riesgos a largo plazo o repetida basada en ENM/química (Figura 6). La concentración de albúmina se mantuvo constante durante el período de cultivo. La producción de Urea muestra un aumento en la concentración de urea producida por esferoide durante una semana en el cultivo antes de llegar a una meseta para el día 7. Es importante tener en cuenta que los niveles de albúmina y urea producidos en los esferoides 3D HepG2 son sustancialmente más altos que los observados en la misma línea celular cultivada en un formato 2D. De hecho, los cultivos 2D de células HepG2, pico de albúmina y niveles de urea fueron 0,001 mg/ml y 0,010 ng/μL respectivamente. Además, en trabajos anteriores publicados por Shah et al. utilizando un sistema esferoide HepG2 casi idéntico, los autores destacan una notable mejora en la actividad metabólica (CYP1A1 y CYP1A2) en los sistemas de modelos in vitro HepG2 3D en comparación con las células HepG2 cultivadas en 2D5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figura 6: Datos de caracterización basal de 14 días para esferoides hepáticos HepG2. Después de la transferencia de caída colgante, (A) destaca la viabilidad del modelo esferoide HepG2 durante un período de 14 días, mientras que (B) y (C) resaltan la funcionalidad de albúmina y urea similar al hígado respectivamente. Datos medios ± SEM presentados, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Con el inevitable desarrollo de un núcleo necrótico, una limitación conocida de los cultivos esferoides hepáticos 3D, la viabilidad de este modelo basado en HepG2 tuvo que establecerse para demostrar que era capaz de sostener regímenes de exposición a largo plazo (5-10 días) manteniendo la capacidad proliferativa necesaria para soportar el ensayo micronucleus5. De hecho, este modelo de esferoide hepático 3D se ha demostrado que conserva >70% viabilidad durante 10 días en el cultivo. Basándose en esto y en conjunto con la funcionalidad hepática sostenida observada durante el período de cultivo ≥14 días, este modelo de esferoide hepático 3D puede así apoyar regímenes de exposición en ENM repetidos a largo plazo de hasta 10 días de duración (es decir, antes de que la viabilidad de los esferoides caiga por debajo del 70%). Como referencia, se aconseja que los niveles de albúmina para esferoides HepG2 sembrados a 4000 células/esferoides deben ser ≥20.0 ng/μL, mientras que la producción de urea debe ser ≥0.25 ng/μL antes de realizar una evaluación toxicológica in vitro con este modelo.
Evaluación de genotoxicidad de nanomateriales modificados Para la evaluación de la genotoxicidad, el ensayo de micronucleus se utilizó para determinar la presencia de micronuclei después de exposiciones agudas (24 h) y a largo plazo (120 h) ENM. Aflatoxina B1 es un conocido carcinógeno hepático16,17 y es un control positivo recomendado para el ensayo de micronucleus. Los experimentos de optimización han demostrado que 0,1 μM de Alfatoxin B1 induce una respuesta genotóxica positiva significativa (≥2,0 veces mayor) en los esferoides hepológicos 3D HepG2 y, por lo tanto, se utiliza en cada ensayo de micronucleus realizado con este modelo. Para garantizar la validez de los resultados del ensayo de micronucleus utilizando el modelo esferoide HepG2, la frecuencia de micronucleus de fondo para las células HepG2 utilizadas en este modelo in vitro 3D debe estar dentro de un rango de 0.6% – 1.2%. Como resultado, Alfatoxin B1 debe inducir una respuesta genotóxica de al menos dos veces mayor que la observada con el control negativo; por lo tanto, 0,1 μM de Alfatoxina B1 debe inducir una frecuencia de micronuclei entre el 1,5% y el 3,0%. Utilizando estos parámetros de control, la genotoxicidad in vitro asociada a ENM se puede evaluar de forma fiable. Sobre la base de la Orientación 487 de la OCDE sobre ensayos, es importante tener en cuenta que al probar un ENM o un producto químico, las concentraciones seleccionadas no deben inducir más del 55 % ± 5% de citotoxicidad (indicado por una reducción de los valores de CPBI o RVCC en relación con el control negativo)11. La Figura 7 ilustra los datos generados cuando la Aflatoxina B1 y dos ENM (dióxido de titanio (TiO2)y astilla (Ag)) fueron evaluados después de exposiciones agudas y a largo plazo en los esferoides HepG2, y se analizó el potencial genotóxico posterior utilizando el ensayo de micronucleus. Ambas ENM evaluadas se probaron a una dosis no citotóxica y baja de 5,00 μg/ml sobre una exposición aguda (24 h) y un régimen de exposición a largo plazo (120 h). Se puede observar una tendencia similar de genotoxicidad tanto en tiO2 como en ag enms, por lo que la respuesta de genotoxicidad elevada que resultó después de la exposición de 24 h no fue evidente después de una exposición a largo plazo de 5 días. Esto fue a pesar de la genotoxicidad sostenida inducida por el control positivo de la Aflatoxina B1 en ambos momentos.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figura 7: Evaluación de la genotoxicidad después de la exposición TiO2 y Ag ENM en esferoides hepG2. Evaluación de la genotoxicidad (frecuencia de micronucleus)utilizando la exposición aguda (24 horas) yb)a largo plazo (120 horas) a 5,00 μg/ml de TiO2 y Ag ENM. El control negativo es sólo un medio, mientras que el control positivo es de 0,1 μM de aflatoxina B1. Datos medios (n=2) presentados ± SD. Significado indicado en relación con el control negativo: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Este procedimiento se estableció para ser utilizado para el desarrollo de cultivos hepáticos 3D avanzados in vitro, que pueden proporcionar una evaluación más fisiológicamente relevante de los peligros genotóxicos asociados con exposiciones nanomateriales a lo largo de un régimen de dosis aguda o repetida a largo plazo.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K vistas.  Swansea University Medical School. Este procedimiento se estableció para ser utilizado para el desarrollo de cultivos hepáticos 3D avanzados in vitro, que pueden proporcionar una evaluación más fisiológicamente relevante de los peligros genotóxicos asociados con exposiciones nanomateriales a lo largo de un régimen de dosis aguda o repetida a largo plazo.

Video: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

Estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado Modelo repoblado con la línea celular humana HepG2 carcinoma hepatocelular

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

Un modelo biomimético para el cáncer de hígado para estudiar las interacciones tumorales-estroma en un entorno 3D con propiedades biofísicos ajustables

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

Explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3D individuales utilizando el análisis de flujo extracelular

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Un Tejido Combinada 3D Diseñado<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmón para la predicción de la eficacia de drogas en Fondos Específicos mutacional

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bioingeniería

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

La fibrosis hepática Modelo dimetilnitrosamina inducida en la rata

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Medicina

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, a detailed series of methods is presented, enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis with human cell lines. In one method series, assembloid technology with hepatic (HEP) and mesenchymal (MES) spheroids are utilized, replicating early structures found in liver organogenesis, modeling early morphogenesis, and demonstrating interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. HEP spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Mesenchymal-conditioned media (M-CM) plays a significant role in initiating dose-dependent branching migration. All presented methods were shown to be highly reproducible with a high success rate. By linking these events together, our work will enable recreating sequential, morphogenetic events to reverse engineer organogenesis in vitro and in vivo.

Organoids revolutionize personalized tissue modeling for organ development, drug discovery, and disease research. Organoid engineering advances into creating intricate synthetic tissues. The aim is to integrate morphogenesis, assembloid technology, and biomatrices to advance tissue engineering. This protocol aids in modeling liver organogenesis and establishing guidelines for synthetic tissue construction.

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

DUCT: Fundición de doble resina seguida de tomografía microcomputarizada para análisis hepático 3D

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can progress to fibrosis and eventually to cirrhosis, a significant risk factor for hepatocellular carcinoma. The extracellular matrix (ECM) provides structural support and maintains liver homeostasis via matricellular signals. Liver fibrosis results from an imbalance in the dynamic ECM remodeling process and is characterized by excessive accumulation of structural elements and associated changes in glycosaminoglycans. The typical fibrosis pattern of NASH is called &#34;chicken wire,&#34; which usually consists of zone 3 perisinusoidal/pericellular fibrosis, based on features observed by Masson&#39;s trichrome stain and Picrosirius Red stains. However, these traditional thin two-dimensional (2D) tissue slide-based imaging techniques cannot demonstrate the detailed three-dimensional (3D) ECM structural changes, limiting the understanding of the dynamic ECM remodeling in liver fibrosis.
The current work optimized a fast and efficient protocol to image the native ECM structure in the liver via decellularization to address the above challenges. Mice were fed either with chow or fast-food diet for 14 weeks. Decellularization was performed after in situ portal vein perfusion, and the two-photon microscopy techniques were applied to image and analyze changes in the native ECM. The 3D images of the normal and NASH livers were reconstituted and analyzed. Performing in situ perfusion decellularization and analyzing the scaffold by two-photon microscopy provided a practical and reliable platform to visualize the dynamic ECM remodeling in the liver.

The present protocol optimizes the liver in situ perfusion/decellularization and two-photon microscopy methods to establish a reliable platform to visualize the dynamics of extracellular matrix (ECM) remodeling during non-alcoholic steatohepatitis (NASH).

Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Resumen

Explorar más videos

PLAYLIST