Name: pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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Los datos representativos se financiaron a través del Instituto Nacional del Cáncer (K22CA218549 a S.T.S). Además de su asistencia en el desarrollo del método de análisis integral que se informa en este documento, agradecemos a The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Director – Krista La Perle, DVM, PhD) por los servicios de histología e inmunohistoquímica y al Pathology Imaging Core por el desarrollo y análisis de algoritmos.

El uso de animales siguió las regulaciones de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad (ULAR) bajo el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de OSU 2007A0120-R4 (PI: Dra. Gina Sizemore).
1. Inyección de células de cáncer de mama en la vena de la cola
<ol><li>Preparación de células y jeringa para inyección<ol>
<li>Placa un número apropiado de células en función del número de ratones y la concentración de células que se utilizará. NOTA: El número de células inyectadas y el tiempo hasta el desarrollo de metástasis dependerá de la línea celular utilizada y deberá optimizarse. En esta demostración, 1 x 106 células MDA-MB-231 se inyectan por vía intravenosa en ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), y se observan lesiones pulmonares macroscópicas a más tardar 24 días después de la inyección. Para la línea celular tumoral mamaria murina MVT117, se inyectan 3 x 106 células en ratones FVB/N inmunocompetentes con numerosas metástasis pulmonares observadas a los 14 días22,23.</li>
		<li>Aspirar medios y enjuagar placas celulares con 1x PBS. Tripsinizar las células en un volumen mínimo, agregar el volumen apropiado de medios y contar las células utilizando un hematocitómetro u otro método preferido. El azul de tripano (0,4%) u otros colorantes de células vivas / muertas se pueden usar para determinar recuentos de células viables.</li>
		<li>Células de pellets girando a 180 x g durante 5 min.</li>
		<li>Resuspender el número apropiado de células en 1x PBS estéril de tal manera que se inyecte un volumen de 100 μL por ratón. Mantenga la suspensión celular en hielo para mantener la viabilidad.</li>
		<li>Antes de la inyección, resuspenda completamente las células con una pipeta de 200 μL o 1 ml para evitar la aglomeración. Extraiga 100 μL en una jeringa de insulina de 28 G (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Elimine las burbujas de aire manteniendo la jeringa vertical, golpeando la jeringa y ajustando lentamente el émbolo. Es probable que la inyección de burbujas de aire en la vena cause una embolia de aire / gas que puede ser fatal.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección lateral de la vena de la cola NOTA: Para los ensayos experimentales de metástasis de cáncer de mama, las inyecciones se realizan en ratones hembra de > 6 semanas de edad.<ol>
<li>Manipule el ratón por la cola y deslice al animal en un tubo ranurado / dispositivo de sujeción de un tamaño apropiado (consulte la Tabla de materiales para el dispositivo de sujeción utilizado).</li>
		<li>Inserte la parte del tapón del dispositivo de sujeción y coloque el mouse de lado de modo que su vena de la cola lateral sea fácil de ver. El ratón tiene una arteria ventral en línea con los genitales, una vena dorsal y dos venas caudales laterales.</li>
		<li>Limpie la superficie de la cola del ratón con una toallita aséptica. Agarre la cola entre el dedo índice y el pulgar con la mano no dominante y aplique una ligera tensión.</li>
		<li>Comenzando en la porción distal de la cola, inserte la aguja paralela a la vena con el bisel terminado.</li>
		<li>Si está permitido, vuelva a tapar cuidadosamente la aguja y doblar a un ángulo de 20-30 °. Se recomienda encarecidamente un enfoque con una sola mano o un dispositivo de recapitulación con aguja. NOTA: No es necesario aspirar, ya que esto puede hacer que la vena colapse. Sin embargo, se puede ver un pequeño destello de sangre cuando se coloca por primera vez. La aguja avanzará suavemente hacia la vena con la colocación adecuada.</li>
		<li>Dispense lentamente el volumen completo en la vena. No debe haber resistencia cuando se empuja el émbolo.</li>
		<li>Si se siente alguna resistencia, retire inmediatamente la aguja de la jeringa. Si es necesario, vuelva a insertar la aguja (idealmente no más de 3 intentos) moviéndose hacia el extremo proximal de la cola o la vena lateral opuesta.</li>
		<li>Es probable que un pequeño volumen de sangre se desplace después de la inyección. Aplique una presión suave con una gasa estéril y limpie con una toallita aséptica.</li>
		<li>Deseche rápidamente la jeringa en un recipiente apropiado para objetos punzantes.</li>
		<li>Devuelva el ratón a una jaula limpia y ventilada y monitoree los signos de angustia.</li>
		<li>Monitoree a los ratones 2-3 veces por semana para detectar signos de formación de metástasis (dificultad para respirar, postura encorvada, pérdida de peso) y angustia general. El tiempo hasta el desarrollo de la metástasis dependerá de la línea celular y la tensión del ratón.</li>
		<li>Si se utiliza un dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo, tome imágenes de ratones inmediatamente después de la inyección de la vena de la cola para confirmar la inyección exitosa de células y obtener datos de tiempo "cero" (los detalles específicos sobre las imágenes de bioluminiscencia in vivo no se incluyen aquí, pero se describen por Yang et al.24).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fijación del tejido pulmonar y análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica
<ol><li>Inflado del tejido pulmonar para mantener el formato estructural de los pulmones para la histopatología<ol>
<li>Después de seguir los procedimientos de eutanasia aprobados (por ejemplo, dióxido de carbono al 30 - 70% de desplazamiento del volumen de la cámara / min), asegure la carcasa del ratón a una placa de disección con alfileres. Rocíe o aplique etanol al 70% para mantener el pelaje del ratón fuera del camino durante la disección. NOTA: La asfixia por dióxido de carbono puede causar hemorragia pulmonar como una lesión de fondo esperada, especialmente a velocidades de flujo más lentas.</li>
		<li>Abra el tórax con una incisión en la línea media, extienda la incisión cranealmente / caudalmente a través del peritoneo y corte el diafragma agarrando el proceso xifoideo.</li>
		<li>Usando un juego separado de tijeras para no opacar las cuchillas, corte las costillas a lo largo de cada lado del esternón y retire cuidadosamente la caja torácica dejando espacio para que los pulmones se expandan.</li>
		<li>Aislar la tráquea mediante la extirpación de las glándulas salivales submandibulares y la musculatura infrahioidea. Colocar alfileres a cada lado de la tráquea puede evitar el movimiento no deseado durante la inserción de la aguja.</li>
		<li>Llene una jeringa de 26 G con 2-3 ml de formalina tamponada neutra al 10% e insértela en la tráquea.</li>
		<li>Inyecte lentamente formalina y observe si los pulmones se expanden (generalmente requiere ~ 1.5 ml de formalina).</li>
		<li>Una vez que la formalina comienza a filtrarse de los pulmones (evite el inflado excesivo), pellizque la tráquea con un par de fórceps, retire la aguja de la jeringa y desprenda todo el aparato respiratorio. Coloque los pulmones, el corazón, etc. directamente en la formalina, ya que se puede realizar un recorte adicional del tejido después de la fijación.</li>
		<li>Procesamiento completo, incrustación, seccionamiento de tejido y tinción de hematoxilina y eosina (H&E) utilizando métodos estándar.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica<ol>
<li>Escanee las secciones pulmonares teñidas con H&E en un escáner deslizante de alta resolución con un aumento de 40x (Figura 3).</li>
		<li>Importe imágenes en software de análisis de imágenes (por ejemplo, Visiopharm Image Analysis) para la cuantificación de metástasis pulmonares. NOTA: Recomendamos que los nuevos usuarios obtengan capacitación in situ o en línea para usar el software de análisis de imágenes. Numerosos seminarios web también están disponibles a través de la página web comercial.</li>
		<li>Seleccione la aplicación Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis de la biblioteca de aplicaciones del software. NOTA: El propósito de esta aplicación es etiquetar y cuantificar la metástasis pulmonar en diapositivas teñidas de H&E. Como parte de la aplicación 10118 H&E Lung Metastasis, el primer paso de procesamiento de imágenes segmenta el tejido pulmonar con la aplicación de detección de tejidos. El segundo paso de procesamiento de imágenes utiliza la aplicación Metastasis Detect que identifica las metástasis dentro del tejido pulmonar. Las metástasis se identifican a través de la forma junto con regiones que están demasiado deformadas, demasiado rojas o demasiado escasas para ser identificadas como metástasis.</li>
		<li>Ajuste los parámetros que definen la forma y la dispersión para que se ajusten mejor a las imágenes representativas. Las áreas segmentadas de metástasis tumorales y tejido pulmonar normal se pueden mostrar utilizando etiquetas de diferentes colores para cada tipo de tejido. Nota : en el caso de que la aplicación no pueda separar con precisión las metástasis del tejido pulmonar normal, es posible que sea necesario escribir una aplicación personalizada que use el programa Bosque de decisión de Visiopharm como se hizo para los experimentos (consulte la Figura 2 y la Figura 3). Los detalles para escribir un algoritmo personalizado siguen a continuación. De lo contrario, continúe con el paso 2.2.9.</li>
		<li>Abra el programa Decision Forest, que funciona entrenando múltiples clases [es decir, tejido pulmonar (no neoplásico), metástasis, glóbulos rojos, epitelio y / o espacio en blanco] en una imagen deseada. En la Figura 2, las metástasis tumorales son azules, el tejido normal es verde y el epitelio bronquiolar es amarillo. Además, los glóbulos rojos están en rojo y los espacios de aire en rosa.</li>
		<li>Siga la serie de preguntas de sí o no que se le indique para entrenar adecuadamente a cada clase para una imagen. La precisión del algoritmo determinará el número de preguntas sí/no. Para el análisis, el algoritmo / aplicación personalizado se escribió con una precisión establecida en 50 (rango 0-100).</li>
		<li>Ajuste las características de cada clase aplicando filtros para enfocar, desenfocar, ordenar por forma, etc. para mejorar la precisión del algoritmo/aplicación. Visiopharm ve cada clase a través de uno o varios objetivos conocidos como características. Las características cambian la forma en que la clase ve la imagen para resaltar ciertos colores o intensidades. NOTA: Para el algoritmo personalizado, las metástasis que miden 8500 μm2 y superiores se etiquetan y miden como metástasis. Esto explica la varianza de tamaño y las metástasis demasiado pequeñas para detectarlas. En la cuantificación normal de tejidos se incluyeron pequeñas áreas mal formadas y pequeñas áreas metastásicas inferiores a 8500 μm2 .</li>
		<li>Guarde la configuración modificada de la aplicación o del algoritmo personalizado y, a continuación, aplique el algoritmo/aplicación a un conjunto completo o serie de tejidos teñidos con H&E.</li>
		<li>Por último, exporte todas las variables de salida, que incluyen las enumeradas en la Tabla 1. El área en micras al cuadrado (μm2) se puede cuantificar para cada tipo de tejido y los porcentajes se derivan del área neta total de tejido de la muestra (es decir, el tejido total menos el espacio de aire).</li>
		<li>Al crear un algoritmo personalizado, revise las marcas de tejido en consulta con un patólogo veterinario certificado por el Colegio Americano de Patólogos Veterinarios para garantizar mediciones precisas y diferenciar entre los tipos de tejidos.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer.">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist.">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li><li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Microscopy,+Image+Analysis,+and+Virtual+Slide+Repository.">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A medida que los investigadores continúan utilizando la inyección intravenosa de células tumorales como modelo experimental para la metástasis, faltan prácticas estándar para analizar la carga tumoral metastásica resultante. En algunos casos, se pueden observar diferencias significativas en la carga tumoral metastásica tras la manipulación de líneas celulares particulares y/o el uso de compuestos químicos por vía macroscópica. Sin embargo, en otros casos, las diferencias sutiles en la siembra y el crecimient...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
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Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

A pesar de ser un proceso altamente complejo e ineficiente1, la metástasis es un contribuyente significativo a la morbilidad y mortalidad de los pacientes con cáncer2. De hecho, la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer se atribuyen a la propagación metastásica de la enfermedad3,4. Para que las células tumorales hagan metástasis con éxito, deben desprenderse del sitio primario, invadir a través del estroma contiguo, intravasar en la circulación sanguínea o linfática, viajar al lecho capilar de un sitio secundario, extravasar en el tejido secundario y proliferar o crecer para formar lesiones metastásicas5. El uso de modelos de ratón ha sido fundamental para avanzar en la comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la siembra y el crecimiento metastásico6,7. Aquí, nos centramos en la metástasis del cáncer de mama, para la cual a menudo se utilizan tanto modelos de ratón modificados genéticamente como métodos de trasplante, cada uno con su propio conjunto de ventajas y limitaciones.
Los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados hacen uso de promotores específicos de la glándula mamaria, incluyendo MMTV-LTR (repetición terminal larga del virus tumoral mamario de ratón) y WAP (Proteína ácida de suero de leche), para impulsar la expresión de transgenes en el epitelio mamario8. Los oncogenes que incluyen el antígeno T medio del polioma (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 y el virus simio 40 (SV40) se han expresado de esta manera9,10,11,12,13, y aunque estos modelos genéticos son útiles para estudiar el inicio y la progresión del tumor primario, pocos hacen metástasis fácilmente en órganos distantes. Además, estos modelos genéticos de ratón son a menudo más prohibitivos en tiempo y costo que los modelos de metástasis espontáneas o experimentales. Dada la limitación de la mayoría de los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados para estudiar la metástasis, las técnicas de trasplante se han convertido en métodos atractivos para estudiar este complejo proceso. Esto incluye la inyección ortotópica, de la vena de la cola, intracardíaca e intracraneal de líneas celulares adecuadas.
Aunque varias líneas celulares de cáncer de mama hacen metástasis fácilmente después de la inyección ortotópica en la almohadilla de grasa mamaria14,15, la consistencia y reproducibilidad de la carga tumoral metastásica puede ser un desafío, y la duración de dichos estudios puede ser del orden de varios meses. Para evaluar la metástasis pulmonar, en particular, la inyección intravenosa en la vena de la cola es a menudo un método más reproducible y efectivo en el tiempo con diseminación metastásica que generalmente ocurre en el lapso de unas pocas semanas. Sin embargo, dado que el modelo de inyección intravenosa omite los pasos iniciales de la cascada metastásica, se debe tener cuidado al interpretar los resultados de estos estudios. En esta demostración, mostramos la inyección de células tumorales mamarias en la vena de la cola junto con un método de análisis preciso y completo.
A pesar de que la comunidad investigadora ha logrado avances significativos en la comprensión del complejo proceso de la metástasis del cáncer de mama, se estima que más de 150.000 mujeres tienen actualmente cáncer de mama metastásico16. De las pacientes con cáncer de mama en estadio IV, >36% de las pacientes presentan metástasis pulmonar17; sin embargo, el patrón específico del sitio y la incidencia de metástasis pueden variar según el subtipo molecular18,19,20,21. Las pacientes con metástasis pulmonares asociadas al cáncer de mama tienen una mediana de supervivencia de solo 21 meses, lo que pone de manifiesto la necesidad de identificar tratamientos efectivos y nuevos biomarcadores para esta enfermedad17. El uso de modelos experimentales de metástasis, incluida la inyección intravenosa de células tumorales, continuará avanzando en nuestro conocimiento de este importante desafío clínico. Cuando se combinan con la patología de imágenes digitales y el método de análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica descrito en este protocolo, las inyecciones de la vena de la cola son una herramienta valiosa para la investigación de metástasis del cáncer de mama.

<table><tbody><tr><td>alcohol prep pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>&lt;strong&gt;for cleaning tail prior to injection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>dissection scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>&lt;strong&gt;for mouse dissection and lung tissue inflation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>used for resuspending tumor cells for injection</td></tr><tr><td>ethanol (70 % solution)</td><td>OSU</td><td></td><td>used to minimize mouse&#039;s fur during dissection; use caution - flammable</td></tr><tr><td>Evan&#039;s blue dye</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>cell culture media additive; used at 10% in DMEM</td></tr><tr><td>forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>for dissection and lung tissue inflation</td></tr><tr><td>FVB/NJ mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td>syngeneic mouse strain for MVT1 cells</td></tr><tr><td>hemacytometer (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>for use in cell culture to obtain cell counts</td></tr><tr><td>insulin syringe (28 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>for tail-vein injections (BD 329424)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>human breast cancer cell line</td></tr><tr><td>MVT1 cells</td><td></td><td></td><td>mouse mammary tumor cells</td></tr><tr><td>needles (26 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>used to inflate the mouse&#039;s lungs</td></tr><tr><td>neutral buffered formalin (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent</td></tr><tr><td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>cell culture media additive</td></tr><tr><td>sterile gauze</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>for applying pressue to mouse&#039;s tail if bleeding occurs</td></tr><tr><td>syringe (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>used to inflate mouse lung tissue</td></tr><tr><td>tail-vein restrainer</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>used to restrain mouse for tail-vein injections</td></tr><tr><td>Trypan blue (0.4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>used in cell culture to assess viability</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>used in cell culture to detach tumor cells from plate</td></tr></tbody></table>

pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells

La metástasis, la principal causa de morbilidad y mortalidad para la mayoría de los pacientes con cáncer, puede ser difícil de modelar preclínicamente en ratones. Pocos modelos de metástasis espontáneas están disponibles. Por lo tanto, el modelo experimental de metástasis que implica la inyección de la vena de la cola de líneas celulares adecuadas es un pilar de la investigación de metástasis. Cuando las células cancerosas se inyectan en la vena de la cola lateral, el pulmón es su sitio preferido de colonización. Una limitación potencial de esta técnica es la cuantificación precisa de la carga tumoral pulmonar metastásica. Mientras que algunos investigadores cuentan macrometástasis de un tamaño predefinido y/o incluyen micrometástasis después de la seccionamiento del tejido, otros determinan el área de lesiones metastásicas en relación con el área normal del tejido. Ambos métodos de cuantificación pueden ser extremadamente difíciles cuando la carga metastásica es alta. Aquí, demostramos un modelo de inyección intravenosa de metástasis pulmonar seguido de un método avanzado para cuantificar la carga tumoral metastásica utilizando un software de análisis de imágenes. Este proceso permite la investigación de múltiples parámetros de punto final, incluido el tamaño promedio de la metástasis, el número total de metástasis y el área total de metástasis, para proporcionar un análisis completo. Además, este método ha sido revisado por un patólogo veterinario certificado por el Colegio Americano de Patólogos Veterinarios (SEK) para garantizar la precisión.

Si se utilizan células no marcadas para la inyección de la vena de la cola, puede ser difícil confirmar la colonización pulmonar hasta (1) el momento de la necropsia si se pueden observar macrometástasis o (2) después del análisis histológico si existen metástasis microscópicas. Con una extensa carga de tumores pulmonares metastásicos, los ratones tendrán dificultad para respirar. Al igual que con cualquier estudio de tumores, los ratones deben ser monitoreados cuidadosamente durante toda la duración del est...

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Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.8K vistas.  The Ohio State University Medical Center. La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

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Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Ensayo experimental de metástasis

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Medicina

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

La inyección de células de melanoma murino singénico para determinar su potencial metastásico en los pulmones

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Resumen

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