Este trabajo fue apoyado por la subvención GM118085 de los Institutos Nacionales de Salud y en parte por la Fundación Robert Welch (subvención F-1811 a R.M.H.).

1. Aislamiento de mutantes supresores en cepas deficientes en motilidad
Nota : utilice este método como un amplio 'catch-all' para identificar la naturaleza general del defecto de motilidad.
<ol><li>Preparación de placas de agar blando NOTA: El agar blando, también conocido como motilidad o agar nadador, es un agar de bajo porcentaje (~ 0.2-0.35% p / v), utilizado durante mucho tiempo para ensayar quimiotaxis31,32.<ol>
<li>Añadir 3 g de bacto-agar (0,3% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O (agua doble destilada) al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.</li>
		<li>Autoclave durante 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Dejar enfriar con agitación suave usando la varilla / placa como arriba. Cuando la temperatura alcance aproximadamente 50 °C, vierta 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm), y deje que el agar fundido se ajuste con la tapa en su lugar durante al menos 1 h, para su uso dentro de 16 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de cultivo, inoculación y aislamiento de mutantes supresores NOTA: E. coli inoculada en el centro de medios ricos en nutrientes solidificados con agar blando consumen nutrientes localmente, creando un gradiente de nutrientes que siguen. A medida que se mueven hacia el exterior, aparecen "anillos" definidos (Figura 1A), que están relacionados con quimioatrayentes específicos a los que responden las bacterias. Los defectos en el sistema de quimiotaxis o los componentes estructurales del motor de flagelos pueden comprometer el rendimiento en este ensayo. A menudo, los mutantes con una ventaja de motilidad surgen durante el cribado, y se pueden ver emergiendo de puntos únicos o múltiples a lo largo de la periferia del anillo, desde donde 'estallan' hacia fuera (Figura 1C). Uno notará que el borde más externo del frente de natación contrasta fácilmente con el agar suave virgen no colonizado.<ol>
<li>Cultivar durante la noche cultivos de la cepa deficiente en motilidad deseada en 5 mL de Caldo Lennox (LB; 10 g/L triptona, 5 g/L de extracto de levadura, y 5 g/L de NaCl, Tabla de Materiales)a 30 °C con agitación horizontal (220 r.p.m.). Al día siguiente, sub-cultivo (dilución 1:100) en LB fresco, creciendo en las mismas condiciones a fase exponencial (OD600 de 0,6).</li>
		<li>Inocular 6 μL del cultivo en el centro de una placa de agar blando (1.1) usando una pipeta, empujando la punta estéril cargada en el agar para expulsar suavemente el contenido. Transferir a 30 °C e incubar (Figura 1B), hasta que la motilidad 'brotes' son evidentes, emanando del punto de inoculación o de la periferia de los anillos de motilidad, típicamente en 24-36 h (Figura 1C). NOTA: En ensayos de motilidad, inocular una cepa de tipo salvaje junto con los aislados mutantes para la comparación. Esta cepa de tipo salvaje mostrará los anillos quimiotácticos concéntricos característicos(Figura 1A)y llenará la placa dentro de 8-10 h.</li>
		<li>Use un lazo de alambre estéril para levantar las células de la región de "llamarada" y la raya para purificar colonias individuales en una placa de agar duro LB (LB preparado como el anterior, solidificado con 15 g / L bacto-agar).</li>
		<li>Recoger colonias individuales de la placa de raya utilizando un bucle de alambre estéril y volver a purificar por rayas para colonias individuales para asegurar el aislamiento de un aislado de colonia "pura".</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmación, y caracterización de mutantes supresores
	<ol>
<li>Confirme que los mutantes supresores aislados han restaurado la motilidad. Preparar placas de agar blando (1.1) y cultivos para cepas de interés (como en 1.2.1), incluyendo el tipo salvaje y la cepa inicial "deficiente en motilidad" para la comparación.</li>
		<li>Inocular las placas (como en 1.2.2) e incubar a 30 °C durante 8-10 h.</li>
		<li>Registre el diámetro del anillo más externo (borde del círculo) y compare para establecer cuál de los aislados ha restaurado sustancialmente la motilidad. NOTA: Se recomienda que las placas sean fotografiadas a lo largo del tiempo-curso del experimento. Para obtener los mejores resultados, utilice un dispositivo de "cubo de luz"30,donde se monta una cámara digital sobre una fuente de luz para una mejor iluminación para medir el diámetro de la colonia de natación y distinguirla del agar no colonizado.</li>
		<li>El tema verificó aislantes a WGS según lo requerido, permitiendo suficiente " cobertura de la secuencia" para identificar positivamente las mutaciones que restauraron el salvaje-tipo función.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cuantificación del comportamiento motor de los flagelos a través del atado celular
Nota : utilice este método cuando el comportamiento normal de correr-caída (quimiotaxis) parece estar comprometido.
<ol><li>
Preparación del cultivo y esquila de flagelos
	<ol>
<li>Preparar un cultivo de fase exponencial de la cepa de interés como se describe en el paso 1.2.1.</li>
		<li>Pellet 10 mL de células por centrifugación a 2.000 x g durante 3 min antes de resuspender en 10 mL de Tampón de Motilidad esterilizado por filtro (MB; tampón de fosfato de potasio de 10 mM [0,0935 M K2HPO4,0,0065 M KH2PO4,pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). NOTA: MB apoya la motilidad, pero no apoya el crecimiento bacteriano</li>
		<li>Repetir el paso 2.1.2 dos veces más antes de volver a gastar el pellet final en 1 mL de MB.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular a una jeringa de 1 ml y coloque una aguja de 23G al extremo. Monte un aparato idéntico de jeringa/aguja y coloque los dos juntos a través de 6 pulgadas de tubo de polietileno (diámetro interior de 0,58 mm) firmemente envainado sobre cada punta de aguja.</li>
		<li>Esquile los flagelos (son frágiles y se rompen fácilmente) pasando suavemente la suspensión celular de un lado a otro de una jeringa a la otra 50x, con 1 min de pausa entre cada 10 pasadas.</li>
		<li>Centrifugar las células cizalladas a 2.000 x g durante 3 min y resuspend en un volumen final de 500 μL de MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de diapositivas y atado celular
	<ol>
<li>Prepare una cámara de fijación celular apilando una cubierta de 18 mm x 18 mm sobre una corredera de microscopio de vidrio de 3 pulgadas x 1 pulgada x 1 mm, separada por cinta adhesiva de doble cara (Figura S1).</li>
		<li>Enjuague la cámara con solución de poli-lisina al 0,01% (p/v) aplicándola en la parte superior de la cámara. Incline el borde inferior (el cubrebocas al ras con la corredera del microscopio) sobre un limpiaparabrisas de tarea (papel tisú) para ayudar a dibujar la solución a través de la cámara (Figura S1). Luego incubar a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Lavar la cámara tres veces con 40 μL de MB utilizando como se describe en el paso 2.2.2</li>
		<li>Añadir 40 μL de la suspensión de células cizalladas (preparada arriba) en la parte superior de la cámara e incubar a temperatura ambiente durante 10 min para permitir que las células se adhieran al cubrebocas.</li>
		<li>Enjuague suavemente la cámara con 40 μL de MB como en 2.2.3 para eliminar las células no unidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Registro y cuantificación de la rotación celular
	<ol>
<li>Transfiera el portaobjetos del microscopio cargado con células atados a la etapa del microscopio.</li>
		<li>Usando microscopía de contraste de fase y un objetivo de 100x, escanee la población en busca de células que estén fijas en su lugar, y gire en un solo eje, es decir, rotaciones suaves en un punto fijo en lugar de presentarse en un ángulo en el que la célula se mueva dentro y fuera del enfoque (Video 1).</li>
		<li>Utilice un microscopio comercial y una cámara asociada. Abra el software asociado, asegúrese de que las celdas de interés estén enfocadas y haga clic en adquisición de video para grabar la rotación de celdas durante un minuto (a 10 cuadros por segundo o más).</li>
		<li>A partir de la reproducción de vídeo, cuantifique el número de rotaciones completas por minuto y el número de veces que la celda cambia de dirección (frecuencia de conmutación). NOTA: Las velocidades de rotación y la frecuencia de conmutación pueden ser demasiado rápidas para medir a simple vista, por lo que se recomienda utilizar un software de vídeo que ofrezca una reproducción lenta/fina, o que adopte un sistema de software automatizado para cuantificar los patrones de rotación33. Una alternativa sería aumentar la viscosidad del MB usando metilcelulosa (o agente similar) para ayudar a ralentizar y resolver la rotación de bacterias más rápidas o compensar cuando se utilizan cámaras con bajas tasas de fotogramas.</li>
		<li>Repita el paso 2.3.2 con réplicas biológicas para compilar una representación de la población de interés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparación de enjambres en un ensayo de cruce de fronteras
NOTA: Utilice este método para evaluar el impacto de una mutación o condición en la motilidad del grupo. Enjambre-agar se refiere al agar donde el porcentaje es típicamente más alto que el del agar blando. En el agar blando (0,3 %), las células nadan individualmente dentro del agar. En el agar enjambre (0,5% y más), las células se mueven como un grupo en la superficie. Mientras que las placas de enjambre deben usarse como se detalla aquí, las placas de natación tienen una vida útil más larga y se pueden usar durante varios días. Nuestra preferencia personal es utilizar en 1-2 días.
<ol><li>
Preparación del agar enjambre
	<ol>
<li>Añadir 5 g de agar Eiken (0,5% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.</li>
		<li>Autoclave durante 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Deje enfriar con una agitación suave para evitar cualquier burbuja de aire usando la varilla / placa como se indicó anteriormente. Cuando sea aproximadamente 50 °C, añadir glucosa esterilizada por filtro para una concentración final del 0,5 %.</li>
		<li>Verter 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm) y dejar fijar a temperatura ambiente durante al menos 14 h y no más de 20 h. No almacenar para uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inoculación e incubación de placas de enjambre
	<ol>
<li>Inocular 6 μL de un cultivo exponencial medio (preparado como en 1.2) manchando en la parte superior del agar.</li>
		<li>Deje la tapa apagada durante 5-10 minutos y reemplácela cuando el inóculo se haya secado en la superficie del agar.</li>
		<li>Incubar a 30 °C durante 8 h. Evite la tentación de inspeccionar el progreso del enjambre quitando la tapa, ya que esto contribuirá al secado del agar y perjudicará el enjambre. NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del fenotipo de la cepa. Algunas mutaciones aisladas pueden dificultar la capacidad de enjambre y requerirán un porcentaje reducido de agar o un período más prolongado de incubación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de placas de ensayo para cruzar la frontera NOTA: Este ensayo utiliza una placa de Petri modificada, donde una división plástica (borde) crea dos cámaras, en lugar de una(Figura 2A). Cada cámara se puede preparar independientemente de la otra, ofreciendo diferentes condiciones para el enjambre, antes de 'conectar' los dos. Dependiendo del diseño experimental, la primera cámara (designada a la izquierda) se puede preparar con agar de baño (0.3% p/v) o agar de enjambre (0.5% p/v) desde donde las bacterias pueden migrar a través de la frontera hacia la cámara derecha que contiene agar enjambre +/- cualquier suplemento o desafío requerido (por ejemplo, antibióticos). La migración en cualquiera de los agares se mide/compara típicamente registrando el diámetro más ancho de la colonización bacteriana (de borde a borde) desde el punto original de inoculación.<ol>
<li>Prepare el agar para nadar como se describe en 1.1 si es necesario.</li>
		<li>Preparar el agar enjambre como se describe en 3.1.</li>
		<li>Verter ~ 30 mL de agar enjambre (con la suplementación deseada si es necesario) en la cámara derecha de una placa de Petri de doble compartimento (100 mm x 15 mm), hasta el punto en que esté nivelado con el divisor de plástico entre las cámaras, pero no desbordando hacia la izquierda (Figura 2B).</li>
		<li>Después de que el agar se haya endurecido, llene la cámara izquierda con ~ 30 mL de agar de baño o enjambre, de nuevo hasta el punto de contacto con la división de plástico (Figura 2C). Antes de que se establezca, utilice una punta de pipeta estéril para arrastrar suavemente el agar sobre el borde para conectar los dos lados con un puente de agar de ~ 1 mm de altura que abarca toda la longitud de la división (Figura 2D).</li>
		<li>Dejar secar la placa a temperatura ambiente (3.1). NOTA: Un método alternativo de creación de puente es permitir que el agar de la cámara izquierda se seque y luego pipetee lentamente ~ 100 μL de agar enjambre fundido a lo largo del divisor de plástico para unir las dos cámaras (3.4). Inocular las placas en la cámara izquierda como se detalla anteriormente para nadar (1.2.2) o enjambre (3.2) agar, antes de incubar a 30 °C durante 12-16 h, o hasta que los enjambres hayan progresado lo suficiente sobre la cámara derecha para permitir comparaciones entre cepas de interés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El aislamiento y caracterización de mutaciones supresoras han contribuido con éxito a identificar componentes clave del sistema de quimiotaxis35,36,37,así como la propia maquinaria motora38,39,40. Durante el uso del Protocolo 1, es importante incluir múltiples réplicas independientes para asegurar el aislamiento de un amplio espect...

Las bacterias emplean muchos apéndices para el movimiento y la dispersión en sus nichos ecológicos1. La motilidad impulsada por flagelos es la más rápida de ellas, promoviendo la colonización de localizaciones favorables en respuesta a las señales ambientales, y contribuyendo significativamente a la capacidad patógena de algunas especies2,3. Las bacterias flageladas pueden nadar individualmente en líquido a granel, o enjambre como un colectivo sobre una superficie semisó sólida4. Los flagelos extracelulares se unen y son accionados por motores rotativos incrustados en la membrana, que aprovechan la potencia de los gradientes iónicos para generar un par que provocala rotación 1,2,4,5,6,7,8. En E. coli,cuyos motores funcionan a un par constantede 9,la salida del motor se puede clasificar en términos de velocidad de rotación y conmutación del rotor entre las direcciones en sentido contrario a las agujas del reloj (CCW) y en el sentido de las agujas del reloj (CW). La rotación CCW promueve la formación de un haz flagelar coherente que impulsa la célula hacia adelante (run), mientras que un interruptor transitorio en dirección rotacional (CW) hace que el haz se desmonte parcial o totalmente10,y la célula reoriente su dirección de natación (caída). E. coli típicamente corre por un segundo y cae por una décima de segundo. La frecuencia de conmutación del rotor o 'sesgo de caída' es controlada por el sistema de señalización quimiotaxis, en el que los quimiorreceptores transmembrana detectan señales químicas externas y las transmiten a través de fosforelay al motor flagelar para extender las corridas en respuesta a los atrayentes, o suprimirlas en respuesta a productos químicos tóxicos11,12. La motilidad de natación se ensaya en agar blando al 0,3%.
Durante el enjambre, las bacterias navegan en una superficie semisólida como un colectivo denso, donde los paquetes de bacterias fluyen en un movimiento continuo de remolino2,13,14,15. Los enjambres de E. coli exhiben fisiología quimiosensorial alterada (menor sesgo de caída), velocidades más altas y mayor tolerancia a los antimicrobianos sobre las células que nadan en líquido a granel16,17. Los enjambres varían en su despliegue de una gran cantidad de estrategias que ayudan al movimiento, incluyendo la producción de surfactante, hiperflagelación y elongación celular2. El enjambre ofrece a las bacterias una ventaja competitiva tanto en entornos ecológicos como clínicos18,19,20. Hay dos categorías de bacterias de enjambre: enjambres templados, que pueden enjambre sólo en medios solidificados con 0,5-0,8% de agar, y enjambres robustos, que pueden navegar a través de concentraciones de agar más altas21.
Existe una variedad de ensayos para interrogar la motilidad de la natación y su regulación. Cuando se ve afectada por mutaciones o condiciones ambientales, la motilidad en sí misma ofrece una fuerte selección para identificar mutaciones supresoras de ganancia de función. Estos supresores pueden ser revertientes genuinos de la mutación original, o pseudo-revertores, donde una segunda mutación restaura la funcionalidad. Tales mutantes pueden ser identificados por secuenciación del genoma completo (WGS). Una alternativa a la selección imparcial del supresor es una estrategia sesgada de la mutagénesis apuntada (e.g., mutagénesis de la polimerización en cadena). Estas metodologías a menudo arrojan luz sobre la función o la regulación ambiental del aparato de motilidad. Si el objetivo es estudiar la función motora, entonces la restauración de la motilidad de tipo salvaje medida en agar blando puede no indicar necesariamente la restauración de la salida del motor de tipo salvaje. El ensayo de atado celular, en el que las células se unen a una superficie de vidrio por un solo flagelo y la rotación del cuerpo celular se supervisa posteriormente, puede ser el ensayo inicial de elección para evaluar el comportamiento motor. Aunque ahora se dispone de metodologías más sofisticadas para supervisar las propiedades del motor, la configuración requerida de la cámara de alta velocidad y la aplicación de paquetes de software para el análisis de movimiento limitan su uso generalizado22,23,24,25. El ensayo de atado celular requiere solo que los flagelos estén cortados, lo que permite la unión de los filamentos cortos a un portaobjetos de vidrio, seguido de grabar en video la rotación del cuerpo celular. Aunque las velocidades registradas del motor sean bajas en este ensayo debido a la alta carga que el cuerpo celular ejerce sobre el flagelo, este ensayo ha contribuido sin embargo a información valiosa sobre las respuestas quimiotácticas26,27,28,29,y sigue siendo una herramienta de investigación válida como se discute a continuación.
La motilidad del enjambre plantea un conjunto diferente de desafíos a los investigadores. La selección de supresores de ganancia de función sólo funciona en enjambres que producen tensioactivos copiosos y enjambres fácilmente13. Los no productores de surfactantes como E. coli son exigentes con respecto a la elección del agar, la composición de los medios y la humedad del ambiente2,13,14,21. Una vez que se establecen las condiciones de enjambre, el ensayo de cruce de fronteras17 es una metodología útil para interrogar la capacidad de un enjambre para navegar por condiciones nuevas / duras. Aunque los protocolos presentados a continuación se relacionan con E. coli,pueden ser fácilmente adaptados para su aplicación en otras especies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

La motilidad es crucial para la supervivencia y el éxito de muchas especies bacterianas. Existen muchas metodologías para explotar la motilidad para comprender las vías de señalización, para dilucidar la función y el ensamblaje de las partes flagelares, y para examinar y comprender los patrones de movimiento. Aquí demostramos una combinación de tres de estas metodologías. La motilidad en el agar blando es la más antigua, ofreciendo una fuerte selección para aislar las mutaciones supresoras de ganancia de función en cepas con problemas de motilidad, donde la motilidad se restaura a través de una segunda mutación. La técnica de atado celular, empleada por primera vez para demostrar la naturaleza rotatoria del motor flagelar, se puede utilizar para evaluar el impacto de los efectores de señalización en la velocidad del motor y su capacidad para cambiar la dirección de rotación. El ensayo de "cruce de fronteras" es más reciente, donde las bacterias nadadoras se pueden preparar para la transición a moverse colectivamente como un enjambre. En combinación, estos protocolos representan un enfoque sistemático y poderoso para identificar los componentes de la maquinaria de motilidad, y para caracterizar su papel en diferentes facetas de la natación y el enjambre. Se pueden adaptar fácilmente para estudiar la motilidad en otras especies bacterianas.

El aislamiento de pseudo-revertores en una cepa de E. coli cuya motilidad se ve afectada por altos niveles de la molécula de señalización c-di-GMP, fue detallado en un trabajo reciente de nuestro laboratorio34. Esta cepa (JP1442) albergaba dos mutaciones: ΔyhjH y ΔycgR. YhjH es la fosfodiesterasa más activa que degrada c-di-GMP en E. coli. La ausencia de YhjH conduce a niveles elevados de c-di-GMP y a la inhibición de la motilidad. YcgR es un efector c-di...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Muchas bacterias utilizan la motilidad provocada por flagelos para navegar por su entorno y colonizar entornos favorables tanto individualmente como colectivamente. Aquí se demuestra el uso de tres métodos establecidos que explotan la motilidad como una herramienta de selección para identificar componentes / vías que contribuyen a la natación y la motilidad de enjambre.

Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K vistas.  The University of Texas at Austin. Muchas bacterias utilizan la motilidad provocada por flagelos para navegar por su entorno y colonizar entornos favorables tanto individualmente como colectivamente. Aquí se demuestra el uso de tres métodos establecidos que explotan la motilidad como una herramienta de selección para identificar componentes / vías que contribuyen a la natación y la motilidad de enjambre.

Video: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Investigación

Biología

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

La detección de vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie

Resumen

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