El aislamiento y la proliferación de células madre derivadas de tejido adiposo producen un gran número de células madre que pueden utilizarse para varias aplicaciones posteriores y técnicas experimentales. Un uso importante previsto para los adipocitos diferenciados en este protocolo son los ensayos metabólicos, como la absorción de glucosa estimulada por insulina, la lipogénesis y la lipólisis estimulada. Para empezar, cree un ambiente de trabajo estéril desinfectando la campana de bioseguridad y todas las herramientas.
Pipetear aproximadamente 10 mililitros de cinco tampón PBS en cuatro placas de cultivo celular de 100 milímetros. Transfiera una muestra adiposa de 50 gramos a uno de los platos y lávela cuatro veces transfiriéndola secuencialmente a través de los otros platos que contienen cinco PBS. Luego transfiera el tejido adiposo lavado a una placa de cultivo limpia de 100 milímetros y pique bien con tijeras o pinzas estériles.
Transfiera una sección de uno a tres centímetros del tejido picado a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 13 mililitros de tampón colagenasa. Enjuague el tejido restante de la placa de cultivo con dos mililitros de tampón de colagenasa para asegurar un volumen total de 15 mililitros. Mezclar bien la muestra con una pipeta serológica de 25 mililitros e incubar el tubo a 37 grados centígrados en un balancín durante 30 a 60 minutos.
Para neutralizar la actividad enzimática, agregue 10 mililitros de medio de crecimiento ADSC en el tubo después de la incubación y mezcle bien con una pipeta para separar cualquier agregado tisular. Transfiera la porción líquida a un nuevo tubo cónico estéril de 50 mililitros, dejando el tejido sólido. Lave el pañuelo tres veces usando siete mililitros de dos PBS y transfiera el líquido al nuevo tubo.
A continuación, centrifugar el tubo a 500 veces G durante cinco minutos y retire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar el pellet. Resuspenda el pellet en un mililitro de 1X tampón de lisis de glóbulos rojos o glóbulos rojos y cúbralo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego lave las células dos veces agregando cinco mililitros de medio de crecimiento ADSC al tubo y centrifugando para eliminar el sobrenadante.
Después del último lavado, vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de medio de crecimiento ADSC y fílelo a través de un filtro de células de 70 micras en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Enjuague el colador con dos mililitros adicionales del medio y transfiera cuatro mililitros de la suspensión a un plato de cultivo estéril de 100 mililitros. Enjuague el tubo cónico dos veces con tres mililitros de medio para recoger un volumen total de 10 mililitros en la placa de cultivo.
Observe las células recolectadas bajo un microscopio invertido con un aumento de 10X para verificar si hay células flotantes. Incubar las células durante 24 horas en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 100% de humedad relativa. Para garantizar la esterilidad de los medios de cultivo, incluya una placa con medios solos.
Después de 24 horas, observe las células bajo el microscopio invertido para verificar la adherencia celular. Retire y reemplace el medio con medio caliente cada 48 horas hasta que las células sean 80 a 90% confluentes. Para la proliferación, retire el medio de crecimiento de las células ADSC confluentes y lávelas dos veces con dos mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente.
Aspirar el PBS y añadir dos mililitros de 0,25% de tripsina EDTA en cada placa de cultivo, cubriendo toda la superficie de la placa. Incubar la placa durante siete minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, luego desalojar mecánicamente las células tripsinizadas mediante un pipeteo contundente. Agregue dos mililitros de medio de crecimiento ADSC y mezcle suavemente las células.
Transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros, enjuagando el plato con dos mililitros adicionales de medio para garantizar la máxima recuperación celular de la placa. A continuación, centrifugar el tubo a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente y decantar el sobrenadante para obtener el pellet celular. Resuspender el pellet celular en cinco a seis mililitros de medio de crecimiento ADSC por millón de células.
Cuente las células usando un hemocitómetro y colóquelas como se describe en el texto manuscrito. Una vez que las células alcancen 80 a 90% de confluencia, aspire el medio de crecimiento y enjuague las células con PBS estéril a temperatura ambiente, luego agregue 10 mililitros de medio de diferenciación ADSC. Reemplace el medio cada tres días durante aproximadamente 14 a 21 días.
Observe las células para detectar la presencia de gotas de lípidos bajo el microscopio invertido con un aumento de 40X. Los adipocitos maduros generalmente se observan después de 14 días. El día del chapado, los ADSC no eran adherentes y flotaban en la cultura.
Las células se volvieron 80% confluentes después de 72 horas y estaban listas para la diferenciación de adipocitos. Después de 14 días de diferenciación ADSC, los adipocitos maduros exhibieron fuertes características adipogénicas que se observaron bajo un aumento de 40X. El día 14, las células se tiñeron y fijaron con Oil Red O y BODIPY para la visualización de gotas de lípidos.
Se pudieron observar adipocitos diferenciados con un aumento de 20X. Al intentar este protocolo, es importante recordar que un ambiente de trabajo estéril es crítico para el aislamiento saludable, la expansión adecuada y la diferenciación eficiente de las células madre derivadas de tejido adiposo. Después de este procedimiento, estas células se pueden utilizar para varios ensayos metabólicos, como la absorción de glucosa, la lipogénesis y la lipólisis, que es un enfoque importante de nuestra investigación.
Esta técnica permite la investigación de cómo el alcohol crónico y el VIS afectan la capacidad metabólica de los adipocitos.
