A.J.C, J.A.T e I.L reconocen la financiación de la Comisión Europea a través del proyecto Horizonte 2020 ACEnano (Subvención no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z reconoce la financiación de doctorado del Consejo de Becas de China (CSC, No. 201507060011). R.R reconoce el apoyo financiero del programa de subvenciones Vidi de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO Vidi 723.0160330).

El uso de biofluidos humanos fue aprobado según las pautas del protocolo IRB de la Universidad de Leiden y la Universidad Médica de Innsbruck. Cuando se investigan biofluidos humanos o animales, se requiere la aprobación ética de la institución de investigación, y se ha obtenido en el caso de los resultados mostrados en este protocolo. Además, también deben realizarse informes adecuados para garantizar la transparencia y la reutilización de los datos en los trabajos futuros9,29,30.
1. Preparación de electrolitos de fondo (BGE)
NOTA: Todos los disolventes deben prepararse en una campana de humos adecuada y se debe usar equipo de protección personal adecuado para todos los pasos (bata de laboratorio, guantes y gafas). En cada paso, se requieren viales de plástico de baja unión para minimizar la pérdida de analitos y la contaminación de la muestra con sales lixiviadas de la cristalería.
<ol><li>Preparar 10% de ácido acético BGE (v/v), pH 2.2 diariamente para la metabolómica.<ol>
<li>En un matraz amétrico de 10 ml agregue 1 ml de ácido acético, seguido de la adición de agua desionizada (DI) a la línea marcada y una mezcla completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 100 mM de ácido acético, pH 2.9 diariamente para la proteómica.<ol>
<li>En un matraz amétrico de 10 ml agregue 57 μL de ácido acético, seguido de la adición de agua DI a la línea marcada y una mezcla completa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación NM
<ol><li>Dispersar vigorosamente los NM en el agua utilizando las directrices publicadas31,32,33. NOTA: En el desarrollo de este protocolo, se utilizaron 7 NM de la siguiente manera: se utilizó poliestireno carboxilado de 100 y 1.000 nm para la proteína y el metabolito corona, respectivamente. Se utilizaron NM de poliestireno no modificados de 100 nm, NM de anatasa TiO2 de 13 nm que no se modificaron o recubrieron con polímeros de poliacrilato o PVP y NM de SiO 2 sin modificarde 22 nm para coronas de proteínas y metabolitos. Si bien el método se desarrolló y demostró utilizando estos NM, debe tenerse en cuenta que este enfoque sería aplicable a una amplia gama de composiciones, tamaños, formas y morfologías de NM.</li>
	<li>Caracterizar el tamaño de partícula utilizando dispersión dinámica de luz34,35,espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente a partículas individuales36,análisis de seguimiento de nanopartículas37,o microscopía electrónica de transmisión y carga superficial como potencial zeta utilizando un escalador zeta34.</li>
</ol>3. Formación de corona biomolecular
<ol><li>Divida 2 ml de plasma humano (o biofluido de elección) en alícuotas de 1 ml, una para el metabolito y la proteína corona y la segunda para la caracterización del metaboloma plasmático.</li>
	<li>Incubar 1 mg/ml de NM en el plasma humano durante 1 h a 37 °C mientras se mezcla suavemente a 500 rpm en un termomezclador. Después de la incubación, centrífuga la muestra a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C para gletizar los NM.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante plasmático para el análisis de la corona del metabolito. Retener el complejo corona de proteína NM para la caracterización de la corona de proteína.</li>
</ol>4. Aislamiento de proteínas corona
<ol><li>Resuspend el complejo DE PROTEÍNA NM (el pellet) en 1 ml de 10x PBS Buffer y vórtice vigorosamente durante 2 min para eliminar las proteínas no unidas. Centrifugar la solución de PBS a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C para peletizar los NM, y retirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
	<li>Resuspend el pellet en 1 mL de tampón de bicarbonato de amonio (ABC) (100 mM, pH 8.0) y vórtice vigorosamente durante 2 min para eliminar las proteínas no unidas y las sales no deseadas. Centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C para gletizar los NM; retire y deseche el sobrenadante. Repita este paso.</li>
	<li>Reducir los enlaces disulfuro de proteína disolviendo el pellet de proteína NM en 20 μL de tampón ABC (100 mM pH 8) que contiene 10 mM de ditioteritol. Incubar la solución reductora durante 30 min a 56 °C.</li>
	<li>Para digerir las proteínas, agregue 2 μg de tripsina de grado de secuenciación a 20 μL de ABC que contengan 0.1% de surfactante. Incubar la solución digesto durante 16 h a 37 °C.</li>
	<li>Alquilar la muestra mediante la adición de 20 μL de yodoacetamida a 55 mM en ABC de 100 mM e incubar a temperatura ambiente durante 20 min.</li>
	<li>Añadir 20 μL de 0,1 M HCl para escindir el surfactante y dejar actuar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Enriquezca y desalar péptidos usando una punta de pipeta desalineada empaquetada C18.<ol>
<li>Humedezca la punta con 80 μL 0.1% de ácido fórmico 50% acetonitrilo 5 veces, limpie con 80 μL 0.1% de ácido fórmico 5 veces, extraiga y elute la muestra 10 veces, desalte la muestra enjuagando 80 μL 0.1% de ácido fórmico 5 veces y elute la muestra 2 veces con 80 μL 0.1% de ácido fórmico 70% acetonitrilo en un tubo limpio de PCR de baja unión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Liofilizar las muestras y conservar a -20 °C hasta su análisis.</li>
</ol>5. Aislamiento de la corona del metabolito
<ol><li>Tome el plasma de control y el sobrenadante de la incubación de plasma NM del Paso 3.3 y manténgalo en hielo durante la preparación de la muestra.</li>
	<li>Tome 50 μL de cada uno en viales separados y diluya 1 de cada 10 con agua DI. Tome 50 μL de cada muestra diluida y pase a nuevos viales para el paso 5.3.</li>
	<li>Agregue 200 μL de cloroformo, 250 μL de metanol y 350 μL de agua DI y vigorosamente la mezcla de vórtice durante 2 min. Centrifugar durante 10 min a 20.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Tomar 500 μL de sobrenadante y filtrar a través de un filtro centrífugo de 3 kDa durante 2 h a 10.000 x g a 4 °C. Tomar 430 μL de ultrafiltrado y secar en una aspiradora de velocidad. Las muestras ahora se pueden congelar antes del análisis.</li>
</ol>6. Preparación del sistema CESI-MS38
NOTA: Antes de la instalación de los capilares, compruebe que la entrada y el extremo de salida de los capilares estén intactos y que no haya roturas visibles en el capilar.
<ol><li>Instalación de un capilar de recubrimiento neutro para análisis de proteínas corona39.<ol>
<li>Coloque un nuevo capilar recubierto neutro (90 cm de longitud con 30 μm de diámetro interno) en el instrumento CESI siguiendo las directrices del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de capilares CESI para análisis proteómico.<ol>
<li>Enjuague el capilar de separación en la dirección hacia adelante usando 100 mM de HCl durante 5 min a 100 psi y verifique la formación de gotas en la salida del capilar. Enjuague el capilar de separación con BGE a 100 psi durante 10 min y luego agua DI a 100 psi durante 30 min (esto solo se requiere para capilares nuevos).</li>
		<li>Enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE a 90 psi durante 5 minutos y asegúrese de que se formen gotas en el extremo de salida de ambos capilares.</li>
		<li>Enjuague el capilar de separación con agua DI a 90 psi durante 10 min, luego 50 psi durante 10 min con 0.1 M HCl, seguido nuevamente por 90 psi durante 10 min con agua DI y finalmente BGE a 90 psi durante 10 min. Acopla CESI al MS usando una fuente de nanospray y un adaptador como se describió anteriormente38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instalación de capilar de sílice fundida desnuda para caracterización de metabolito corona38.<ol>
<li>Coloque un nuevo capilar de sílice fundido desnudo (90 cm de longitud con un diámetro interno de 30 μm) en el instrumento CESI siguiendo las pautas del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de capilares CESI para análisis metabolómico.<ol>
<li>Enjuague el capilar de separación en la dirección hacia adelante usando 100% MeOH a 50 psi durante 15 min y verifique la formación de gotas en la salida del capilar. Enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE a 90 psi durante 5 minutos y asegúrese de que se formen gotas en la salida de ambos capilares.</li>
		<li>Enjuague el capilar de separación con agua DI a 90 psi durante 10 min, luego 50 psi durante 10 min con 0.1 M NaOH, seguido nuevamente por 90 psi durante 10 min con agua DI y finalmente BGE a 90 psi durante 10 min. Acopla CESI al ESI-MS usando una fuente de nanospray y un adaptador como se describió anteriormente. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS para el análisis de proteínas corona
<ol><li>Muestras de resuspend del paso 4.8 en 20 μL de 50 mM de acetato de amonio pH 4.0.</li>
	<li>Realizar 5 psi 10 s de inyección hidrodinámica de muestra. Separe utilizando un voltaje de separación de 30 kV con el siguiente gradiente de presión: 0-10 min a 1 psi, 10-35 min a 1.5 psi y 35-45 min a 5 psi usando 100 mM, pH 2.9 ácido acético como BGE.</li>
	<li>Recopile espectros de masas entre 250-2000 m/z con la adquisición de fragmentación dependiente de los 10 datos principales.</li>
	<li>Entre muestras, enjuague capilar con 0,1 M HCl durante 3 min a 100 psi y 10 min 100 psi de BGE para separación capilar y durante 3 min a 100 psi para el capilar líquido conductor.</li>
</ol>8. CESI-MS para el análisis de la corona de metabolitos
NOTA: Todas las muestras deben analizarse dos veces, una en modo positivo para la detección de cationes y una vez en modo negativo para la detección de aniones. Las muestras de plasma de control deben analizarse al menos 5 veces.
<ol><li>Resuspend NM expuesto y no expuesto muestras de plasma del paso 5.4 en 430 μL de agua DI y vórtice vigorosamente durante 2 min. Filtrar a través de un filtro de membrana de 0,1 μm.</li>
	<li>Tomar 95 μL de filtrado y añadir 5 μL de normas internas a 200 μM para cationes (L-metionina sulfona) y 400 μM para aniones (ácido 2,2,4,4-D4-cítrico) y vórtice vigorosamente. Centrifugar a 4.000 x g a 4 °C durante 10 min antes del análisis CESI-MS.</li>
	<li>Inyecte la muestra hidrodinámicamente durante 30 s (cationes) y 40 s (aniones) a 2 psi.</li>
	<li>Metabolitos separados en ácido acético al 10% con un voltaje de separación de 30 kV en modo hacia adelante (cationes) y hacia atrás (aniones). El modo de separación inversa se ayuda con una presión de avance de 0,5 psi en el capilar de separación.</li>
	<li>Configure el espectrómetro de masas para recopilar datos en modo positivo (cationes) o negativo (aniones) en el rango de masas 65-1000 m / z. Entre muestras, enjuague capilarmente con 0.1 M HCl, 0.1 M NaOH, agua DI y BGE a 50 psi durante 2 min.</li>
</ol>

J.A.T es un empleado de AB Sciex UK Ltd que participa como socio de la industria en el proyecto ACEnano, J.A.T y todos los demás autores no tienen conflicto de intereses en este trabajo.

Este es el primer método propuesto para caracterizar la corona biomolecular completa incorporando proteínas y metabolitos, a partir de la misma muestra, utilizando CESI-MS. La capacidad de caracterizar tanto las proteínas como los metabolitos de la misma muestra aumentará significativamente la cantidad de datos recopilados de una sola exposición experimental, lo que permitirá nuevos conocimientos sobre el proceso de formación de corona y sus impactos para la toxicidad y eficacia de los NM como nanomedicamentos. Además, CESI-MS es una plataforma ideal para caracterizar ambas clases de biomoléculas con solo un cambio de capilar requerido. En el futuro, los nuevos métodos desarrollados para la CE no acuosa permitirán que la lipidómica se realice utilizando CE-MS40, por lo que ahora es posible analizar proteínas, metabolitos y lípidos utilizando una sola plataforma. Los enfoques convencionales actuales requerirían dos plataformas LC-MS dedicadas, una para la proteína corona y otra para el metabolito corona. Por lo tanto, este enfoque puede recopilar el doble de datos utilizando una sola plataforma analítica.
Hay algunas advertencias a este enfoque, particularmente con el metabolito corona, ya que este protocolo propone una medición indirecta de la corona. Como tal, el problema puede surgir cuando los niveles de metabolitos están presentes en altas concentraciones en relación con los NM y la posterior caída en la concentración de metabolitos en la matriz es pequeña. Sin embargo, a diferencia de la proteína corona, es poco probable que se desarrolle un enfoque de "talla única" para aislar el metabolito corona debido a que cada NM tiene químicas de superficie únicas. Sin embargo, en el futuro es más probable que se desarrollen y validen enfoques específicos de NM para aislar el metabolito corona; esto será aplicable solo a ese NM específico. A pesar de esto, el CESI-MS seguirá siendo una plataforma muy adecuada para la caracterización de los metabolitos con carga polar independientemente de cómo estén aislados. También cabe destacar que si no se forma un pellet durante los pasos de centrifugación diseñados para peletizar los NM, se puede requerir una fuerza centrífuga más alta; esto es más probable que ocurra con NM menos densos. También es fundamental que todos los pasos de filtrado se cumplan dentro del protocolo debido al estrecho orificio de los capilares, estos pueden bloquearse fácilmente si alguna partícula no se ha eliminado adecuadamente de la muestra.
Si bien la proteína corona ha sido un área intensa de investigación durante varios años, la capacidad de combinarla con el metabolito corona es un nuevo campo de interés para los científicos que investigan la interfaz bio-nano6,14. Hasta la fecha, la mayoría de estos estudios se han centrado en la fracción lipídica no polar del metabolito corona9,28. Este método actual permite la caracterización de los metabolitos altamente polares y cargados en la corona, que incluye metabolitos importantes involucrados en el metabolismo energético, la glucólisis y la síntesis de ADN. Como resultado, cuando se combina con el flujo de trabajo de proteómica, es posible una caracterización más holística de la corona biomolecular. Esto permite un análisis más profundo de las interacciones bio-nano en el futuro. Este método permite una mayor comprensión mecanicista de la endocitosis mediada por receptores a través de interacciones de proteínas y metabolitos con receptores de membrana. Además, se pueden explorar las interacciones inter e intra corona entre proteínas y moléculas pequeñas; por ejemplo, recientemente se ha demostrado que las proteínas de la corona juegan un papel clave en el reclutamiento de metabolitos15. Vale la pena señalar que los resultados representativos en la Figura 3 y la Figura 4 son la cuantificación absoluta de los metabolitos, sin embargo, un enfoque no dirigido que utilice el análisis de datos multivariante para comparar todas las características de CE-MS en los controles en comparación con el plasma expuesto también dilucidaría la unión a metabolitos. Por lo tanto, existe un margen significativo para investigar cómo, y cuáles, los metabolitos y proteínas influyen en su respectivo reclutamiento en las coronas NM. Estos estudios adicionales pueden ayudar a diseñar coronas para optimizar la administración de nanomedicamentos o descubrir más obstáculos para su desarrollo, como la supresión de la acción farmacéutica debido al bloqueo biomolecular de la corona o las funcionalidades de enmascaramiento dirigidas.
CESI-MS con sus caudales a nanoescala de alrededor de 20 nL/min y el uso mínimo de disolventes orgánicos ofrece una mejora en las credenciales ecológicas y económicas sobre el estándar LC-MS y nanoLC-MS en términos de uso de disolventes, los principales desafíos para los estudios de metabolómica y proteómica, respectivamente. CESI-MS ofrece resultados altamente reproducibles tanto para el tiempo de migración como para el área pico que se comparan favorablemente con los métodos basados en LC-MS11,15. Además, en comparación con nanoLC-MS, el arrastre no es un problema en CESI-MS. Por lo tanto, no se requiere una limpieza exhaustiva del sistema entre los análisis de muestras, lo que mejora en gran medida el rendimiento de la muestra11.
En resumen, el flujo de trabajo propuesto es el primero en detallar un enfoque para caracterizar los componentes de proteínas y metabolitos de la corona biomolecular completa de los NM. Esto desbloquea un nuevo aspecto de las interacciones bio-nano, el metabolito corona, lo que permite la recopilación del doble de datos de la misma muestra, lo que permite una comprensión más completa de las interacciones en la interfaz bio-nano.

Las interacciones bio-nano, en la interfaz entre las superficies de nanomateriales (NM) y las matrices biológicas a partir de las cuales las biomoléculas se adsorben al NM, es un área intensa de investigación que sustenta la nanoseguridad y la nanomedicina1. Esta capa de biomoléculas adsorbidas confiere una identidad biológica a las NM, por lo que las células las identifican como "propias", influyendo posteriormente en la captación celular, distribución y puntos finales biológicos2,3,4. La gran mayoría de los estudios bio-nano se han centrado en las proteínas dentro de la corona, y han demostrado que las proteínas varían cuantitativa y cualitativamente entre NM de diferentes composiciones5. Esta variación depende tanto de las propiedades del NM como del tamaño, la funcionalización y el material, además de las propiedades de la matriz biológica, incluida la composición y el contenido de sal5. Un área de interés creciente en la interfaz bio-nano son los metabolitos que se adsorben a los NM6. Varios estudios han demostrado que, al igual que con las proteínas, las propiedades nm son un factor clave para determinar la composición de los metabolitos en la corona y que pueden influir en los resultados biológicos de la exposición a NM6,7,8.
En los estudios de la corona biomolecular existen cuatro fases distintas para su caracterización, la formación de corona, el aislamiento de las biomoléculas dentro de la corona, su detección mediante espectrometría de masas cualitativa o cuantitativa y la identificación9. Hasta la fecha, se han adoptado una serie de técnicas para aislar la proteína corona, incluida la ebullición en tampón SDS-PAGE, extracciones de solvente y sal o digestión directa de proteínas in situ en la superficie de los NM. En cuanto a los metabolitos en la corona, el aislamiento es más complejo con diversos métodos utilizando disolventes o incluso la disolución de los NM propuestos como soluciones8,10,11. Sin embargo, a diferencia de la proteína corona, es poco probable que se aplique un enfoque de "talla única" al aislamiento de metabolitos de NM, debido al amplio espacio químico ocupado por el metaboloma y la diversidad de posibles NM. Un enfoque alternativo es caracterizar la matriz biológica antes y después de la exposición a NM con la diferencia en las concentraciones de metabolitos atribuidas a la adsorción de metabolitos a NM.12
Este enfoque alternativo sería aplicable a todos los biofluidos y NM y, aunque requiere el doble de análisis, en consecuencia ofrece una medida mucho más precisa del metabolito corona y no tiene riesgo de que las recuperaciones de metabolitos bajos de la superficie NM se confundan con una baja unión del metabolito específico.
El segundo paso para el análisis biomolecular de la corona es la detección de las biomoléculas. Tradicionalmente para las proteínas en la corona, este ha sido el mandato de nano-LC-MS, el caballo de batalla de la proteómica; también se han aplicado otros enfoques como NMR13,1D y 2D SDS-PAGE. En cuanto al metabolito corona LC-MS7,GC-MS8 y espectrometría de masas de infusión directa se han utilizado14. Sin embargo, un nuevo enfoque ha comenzado recientemente a ganar tracción, a saber, la electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE-MS)11,15 y ha estado presente en los laboratorios nm como una técnica independiente para caracterizar diversas propiedades físicas y químicas de los NM16. CE-MS es una técnica de separación ortogonal a nanoLC-MS y GC-MS y es capaz de permitir la detección de metabolitos altamente polares y cargados17,18. Además, CE-MS es muy adecuado para el análisis de proteínas y sus modificaciones posttraduccionales como la fosforilación y la glicosilación19,20,21,22. El paso final, la identificación y el análisis de datos se pueden realizar de varias maneras dependiendo de si se está utilizando un enfoque cuantitativo / cualitativo o dirigido / no dirigido, esto, sin embargo, queda fuera del ámbito de este protocolo.
CESI-MS, una combinación de CE y una interfaz nanoESI, es un avance reciente en la tecnología CE que utiliza una interfaz sin vase. Esto permite la conexión directa de CE de flujo ultra bajo (<20 nL / min) a un espectrómetro de masas de alta resolución sin dilución, lo que resulta en una sensibilidad de detección significativamente mejorada23,24,25. CESI-MS permite analizar muestras de volumen limitado (< 10 μL) manteniendo un análisis altamente sensible26. CESI-MS también se compara favorablemente con los enfoques tradicionales de nanoLC-MS de bajo caudal utilizados en proteómica y metabolómica en términos de reproducibilidad27,28, rendimiento y arrastre, lo que lo convierte en una perspectiva emocionante para la caracterización completa de la corona biomolecular.
Para resaltar el potencial de CESI-MS para los análisis de interacciones bio-nano, este trabajo describe la preparación de muestras requerida para aislar la corona biomolecular NM de una sola muestra de plasma humano de tal manera que maximice los datos de los aspectos proteicos y metabolitos de la corona NM biomolecular completa. Si bien informamos sobre el uso de plasma humano, este protocolo sería igualmente apropiado para otros biofluidos como el suero sanguíneo, el medio de cultivo celular completo, el lisato celular, el líquido cefalorraquídeo o la orina. Los análisis de estos dos componentes (proteínas y metabolitos) se describirán utilizando capilares CESI recubiertos neutros para la proteína corona y capilares de sílice fusionados desnudos para metabolitos catiónicos y aniónicos.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internal standard anion</td></tr><tr><td>Ammonium Acetate &gt;98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate &gt;99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cartridge coolant</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic, use in a fume hood</td></tr><tr><td>Glacial Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internal standard cation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in a fume hood</td></tr><tr><td>Microvials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Surface Cartridge 30 &amp;micro;M ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &amp;micro;m ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered saline 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips, 100 &amp;micro;L bed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactant)</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide solution</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 uncoated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

La adsorción de biomoléculas de las matrices biológicas circundantes a la superficie de los nanomateriales (NM) para formar la corona ha sido de interés durante la última década. El interés en la interfaz bio-nano surge del hecho de que la corona biomolecular confiere una identidad biológica a los NM y, por lo tanto, hace que el cuerpo los identifique como "propios". Por ejemplo, estudios previos han demostrado que las proteínas en la corona son capaces de interactuar con los receptores de membrana para influir en la captación celular y han establecido que la corona es responsable del tráfico celular de NM y su eventual toxicidad. Hasta la fecha, la mayoría de las investigaciones se han centrado en la proteína corona y han pasado por alto los posibles impactos de los metabolitos incluidos en la corona o los efectos sinérgicos entre los componentes de la corona biomolecular completa. Como tal, este trabajo demuestra metodologías para caracterizar los componentes proteicos y metabolitos de la corona biomolecular utilizando enfoques de proteómica y metabolómica de abajo hacia arriba en paralelo. Esto incluye una digestión en partícula de la proteína corona con un surfactante utilizado para aumentar la recuperación de proteínas, y una caracterización pasiva del metabolito corona mediante el análisis de matrices de metabolitos antes y después de las exposiciones a NM. Este trabajo introduce la electroforesis capilar – espectrometría de masas (CESI-MS) como una nueva técnica para la caracterización de la corona NM. Los protocolos descritos aquí demuestran cómo CESI-MS se puede utilizar para la caracterización confiable de la proteína y el metabolito corona adquiridos por los NM. El cambio a CESI-MS disminuye en gran medida el volumen de muestra requerido (en comparación con los enfoques tradicionales de cromatografía líquida – espectrometría de masas (LC-MS)) con múltiples inyecciones posibles desde tan solo 5 μL de muestra, lo que lo hace ideal para muestras de volumen limitado. Además, las consecuencias ambientales del análisis se reducen con respecto a LC-MS debido a los bajos caudales (<20 nL/min) en CESI-MS, y al uso de electrolitos acuosos que eliminan la necesidad de disolventes orgánicos.

El método descrito es el primero en caracterizar tanto las proteínas como los metabolitos en la corona biomolecular NM utilizando la misma muestra de plasma humano. Este método es capaz de detectar >200 proteínas y metabolitos >150, lo que permite determinar la visión general más completa de la corona biomolecular completa, lo que permite una mejor comprensión de la unión celular NM, la absorción y los impactos.
El uso de CESI-MS tanto para la separación y detección de proteómica(Figura 1)como para metabolómica(Figura 2)muestra buenas ventanas de separación en ambos capilares para cada abordaje.
Este método es capaz de distinguir entre las proteínas de la corona a través de una amplia gama de composiciones de NM, demostrando así la aplicabilidad de los métodos a las NM a través de una amplia gama de características físicas y químicas (Tabla 1).
Las huellas dactilares únicas del metabolito corona también se pueden distinguir utilizando la rama metabolómica de esta metodología (Figura 3). Aunque este enfoque utiliza un enfoque pasivo para caracterizar el metabolito NM corona, todavía es capaz de descubrir ideas interesantes sobre el papel de los metabolitos en la corona biomolecular, como la adsorción diferencial de isómeros(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figura 1: Electroferograma ejemplar de una separación de corona de proteína SiO2 utilizando CESI-MS después de una digestión en partícula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplo de electroferogramas iónicos extraídos obtenidos de compuestos endógenos en plasma por CE-MS. Los compuestos numerados son los siguientes: 1. Ornitina; 2. Lisina; 3. Arginina; 4. Histidina; 5. Creatina; 6. Glicina; 7. Alanina; 8. Valina; 9. Isoleucina; 10. Leucina; 11. Serina; 12. Treonina; 13. Asparagina; 14. Metionina; 15. Glutamina; 16. Ácido glutámico; 17. Fenil-D5-alanina; 18. Fenilalanina; 19. Tirosina; 20. Prolina; 21. Metionina sulfona (estándar interno). Publicado bajo una licencia Creative Commons CC BY de acceso abierto y reproducido de Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Análisis de la proteína corona en una matriz de 6 NM. Mapa de calor de las clases de proteínas identificadas en sílice (SiO2),titania (TiO2),titania con tapa de PVP (TiO2-PVP), titania con tapa de dispex (TiO2-Dispex), poliestireno y NM de poliestireno carboxilado. Los porcentajes se refieren a la abundancia de proteínas en relación con el contenido total de proteínas en función de la abundancia de 3 péptidos principales para cada proteína. Dadas las diferencias observadas en las abundancias relativas de proteínas en las diferentes coronas NM, está claro que este protocolo propuesto es lo suficientemente sensible como para diferenciar entre la proteína corona de diferentes NM. Figura reproducida a partir de un análisis CESI-MS de la proteína corona, publicado bajo una licencia Creative Commons CC BY de acceso abierto11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figura 3: Análisis dirigido de los metabolitos catiónicos en la corona NM. Adsorción de cationes a Los NM de SiO2 y TiO2. El rojo se refiere a la concentración inicial de metabolitos, mientras que el azul se refiere a la concentración de metabolitos después de una incubación de 1 h con los NM a 37 °C. La reducción en la concentración de metabolitos en la solución es el resultado de la adsorción de metabolitos a la superficie NM. No se observó una adsorción significativa de metabolitos para los NM de poliestireno. Los diagramas de caja representan los valores mínimo y máximo, los rangos de mediana e intercuartílico. Figura reproducida de un análisis dirigido CESI-MS del metabolito corona publicado bajo una licencia Creative Commons CC BY de acceso abierto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figura 4: Análisis dirigido de los metabolitos aniónicos en la corona NM con un enfoque en la adsorción de isómeros. La adsorción de aniones a una gama de NM de titania muestra claras diferencias entre varios isómeros, como los fosfatos de azúcar. El rojo se refiere a la concentración inicial de metabolitos, mientras que el azul se refiere a la concentración de metabolitos después de una incubación de 1 h con el NM a 37 °C. La reducción en la concentración de metabolitos en solución es el resultado de la adsorción de metabolitos a la superficie NM. No se observó una adsorción significativa de metabolitos para el SiO2 y los NM de poliestireno. Las gráficas de caja representan los valores mínimo y máximo, los rangos de mediana e intercuartílico. Figura reproducida de un análisis dirigido por CESI-MS del metabolito corona publicado bajo una licencia Creative Common CC BY de acceso abierto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analito</td>
			<td>Área media de pico de RSD</td>
			<td>Tiempo medio de migración de RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>Péptidos de 1928 intradía (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationes intradía (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationes entre días (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Reproducibilidad de réplicas técnicas de CESI-MS para péptidos y metabolitos catiónicos. DSR: desviación estándar relativa, como medida de reproducibilidad. La reproducibilidad de CESI-MS en términos de áreas pico y tiempos de migración es muy buena, con todos los analitos con una RSD media <15% y tiempos de migración <2,2%. Estos resultados demuestran el alto grado de confianza que se puede atribuir a los datos recopilados mediante esta técnica y confirman que las variaciones detectadas se deben a diferencias genuinas en la composición de la muestra (enriquecimiento en NM) más que a la variación analítica. La Tabla 2 se genera a partir de los resultados presentados anteriormente11,15.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Aquí presentamos un protocolo para caracterizar la corona biomolecular completa, proteínas y metabolitos, adquiridos por nanomateriales a partir de biofluidos utilizando un enfoque de electroforesis capilar – espectrometría de masas.

Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.4K vistas.  University of Birmingham. Aquí presentamos un protocolo para caracterizar la corona biomolecular completa, proteínas y metabolitos, adquiridos por nanomateriales a partir de biofluidos utilizando un enfoque de electroforesis capilar – espectrometría de masas.

Video: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Sheathless electroforesis capilar-espectrometría de masas de perfiles metabólicos de muestras biológicas

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Investigación

Bioquímica

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para análisis metabolómicos por electroforesis capilar-espectrometría de masas

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Investigación sobre el cáncer

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Caracterización de proteínas por cromatografía de exclusión de tamaño acoplada a dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Química

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biología

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

De la onda T de movilidad de iones-espectrometría de masas: Basic Procedimientos experimentales para el análisis de proteínas complejas

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

El descubrimiento de las interacciones de proteínas y caracterización de la función de proteínas utilizando HaloTag Tecnología

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales

Resumen

Explorar más videos

PLAYLIST