Aquí presentamos protocolos mejorados para preparar muestras crio-EM con películas de soporte utilizando un novedoso bloque de flotación que facilita el manejo de películas tan delicadas. La ventaja clave de este método es que la muestra está protegida de la interfaz aire-agua donde pueden ocurrir efectos dañinos como la desnaturalización. Uno de los protocolos aquí presentados evita cualquier tipo de tratamiento costoso para hacer que la gráfica sea hidrófila, aumentando así su accesibilidad a toda la comunidad EM.
Los pequeños dispositivos de flotación aún no son ampliamente utilizados por la electromicroscopía para una buena preparación. Por lo tanto, estas demostraciones visuales pueden proporcionar un punto de referencia para su uso. Para comenzar, lave las rejillas TEM con agua destilada doble y acetato de ethel seguido de una limpieza por plasma.
Luego agregue de 10 a 12 microlitros de la muestra en el pozo de intercambio de tampón, el bloque de flotación y de 10 a 12 microlitros de solución de acetato urinario al 2% en el pozo de intercambio adyacente sin tampón para tinción negativa. Es esencial tomar las precauciones de seguridad adecuadas cuando se trabaja con manchas. Corte cuidadosamente dos pequeños trozos de mica con película de carbono predepositada en la parte superior.
Asegúrese de que los fragmentos de mica sean lo suficientemente anchos como para caber en el pozo y más largos que la longitud del pozo, de modo que el fragmento pueda sentarse en el pozo mientras el carbono está flotando y haya suficiente espacio para manejar el fragmento con las pinzas. Sumerja la mica en el pozo con un ángulo aproximado de 45 grados hasta que la mica se asiente en la rampa del pozo y se observe la capa de carbono en la superficie de la muestra líquida. Después de incubar el carbono con la muestra, retire la lámina de mica muy lentamente para recuperar la película de carbono y minimizar la retención residual de la muestra de viscus.
Seque cuidadosamente la mica golpeando la superficie inferior sin carbono con un papel de filtro para eliminar el exceso de líquido y sumerja el fragmento de mica en el pozo opuesto que contiene una solución de acetato urinario al 2% para intercambiar la capa de carbono con la mancha negativa. Recupere la capa de carbono flotante con el lado cubierto de carbono sagrado de la rejilla EM lavada y limpiada con plasma. Luego deje que las rejillas se sequen al aire hasta obtener imágenes en el TEM, preferiblemente cubriéndolas para evitar la contaminación en el aire.
Después de limpiar las rejillas TEM como se demostró anteriormente, prepare la suspensión de óxido de grafeno justo antes de usar y el vórtice a fondo. Luego agregue de 10 a 12 microlitros de suspensión de óxido de grafeno en los cuatro pozos de intercambio sin tampón. a lo largo del bloque de flotación.
Agregue de 10 a 12 microlitros de agua destilada doble o agua ultra pura en los cuatro pozos de intercambio de amortiguación restantes del bloque. Deje caer cuatro rejillas suavemente sobre la suspensión de óxido de grafeno de cada pozo e incube durante un minuto para asegurarse de que el lado cubierto de carbono sagrado esté en contacto con la solución. Después de un minuto, recupere cada rejilla con cuidado deslizando las pinzas en la ranura de las pinzas de cada pozo de intercambio que no sea búfer.
Empuje suave y brevemente el lado cubierto de cobre sin carbono de cada rejilla con el agua destilada doble en el pozo adyacente hasta que la gota de agua sea visible en la rejilla. Luego sostenga cuidadosamente la gota de agua de la rejilla boca abajo contra un trozo de papel de filtro. Cubra las rejillas y déjelas en las pinzas para que se sequen al aire.
Coloque cuatro rejillas de lavado sobre una lámina de cobre depositada en un portaobjetos de vidrio y cubra cada rejilla con una gota de isopropanol para permitir un contacto íntimo entre el grafeno monocapa y la rejilla. Después de la evaporación completa del isopropanol, flote la lámina de grafeno de cobre con rejillas sobre la solución de cloruro férrico en la placa de Petri de vidrio. Luego cubra el plato para evitar la contaminación en el aire y déjelo grabar a temperatura ambiente durante la noche.
Use un bucle con el diámetro mayor que el tamaño de la rejilla TEM para pescar las rejillas que flotan en la monocapa de grafeno y transfiéralas cuidadosamente a una placa de Petri de vidrio que contenga agua destilada doble para lavar. Lave las rejillas dos veces en agua y transfiera las rejillas a una placa de Petri que contenga un tampón de muestra hasta la preparación de la muestra y la congelación por inmersión. Agregue de 10 a 12 microlitros de la muestra en un pozo del bloque de flotación.
Cuando la muestra esté lista en el bloque, recoja la rejilla recubierta de grafeno de la solución tampón con un par de pinzas limpias y colóquela sobre la superficie del pozo que contiene la muestra. Después de un período de incubación apropiado, recoja la rejilla con un par de pinzas de congelación limpias y proceda con la secadura y la vitrificación. Las rejillas teñidas negativamente preparadas con el bloque de flotación de soporte generalmente están cubiertas con carbono amorfo en toda la superficie de la rejilla.
Si bien la rotura de la película de carbono ocurre en algunos casos, una gran cantidad de cuadrados de rejilla son prístinos y, por lo tanto, aplicables para fines de tinción negativa. Del mismo modo, se logra rutinariamente una buena cobertura de la película en toda la red utilizando el protocolo de óxido de grafeno. Las rejillas de óxido de grafeno se pueden preparar rápidamente a partir de materias primas y son altamente protectoras de la muestra.
Mantener el grafeno húmedo y la aplicación de la muestra in situ justo antes de la congelación es suficiente para generar capas de hielo adecuadas para crio-EM. Este protocolo no requiere equipo para hacer que el grafeno sea hidrófilo y proporciona una ventaja para la recuperación de muestras. El bloque de flotación de soporte tiene dos puertos de aguja en el sitio de cada pozo que permiten la extensión del tampón en C2, lo cual es muy útil para muestras derivadas de gradientes de glicerol.
El bloque de flotación ha permitido la exploración de métodos de purificación de afinidad en la red mediante la utilización de un flujo de amortiguación controlable de pequeños volúmenes, así como películas de soporte funcionalizadas.
