Extracción del cofactor _F420 para el análisis de la longitud de la cola de poliglutamato a partir de cultivos puros metanogénicos y muestras ambientales

El cofactor F420 juega un papel importante en el metabolismo primario y secundario de muchos procariotas. La medición de esta molécula en muestras ambientales permite una comprensión más profunda de su prevalencia y función. Esta técnica permite el análisis del cofactor en materiales de muestra difíciles como lodos y suelos.

Por lo tanto, la lisis del material y la prepurificación antes del análisis son los pasos centrales. El protocolo incluye diferentes pasos durante la preparación de la muestra. Estos pasos deben planificarse y prepararse muy bien antes de comenzar con el procesamiento de la muestra.

Por ejemplo, la preparación de tampones frescos es importante. Para comenzar la lisis de la muestra, coloque cinco gramos de la muestra en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego agregue cinco mililitros de tampón de lisis 2X a las muestras y lleve el volumen a 10 mililitros con agua destilada para alcanzar una concentración final de 0.5 gramos por mililitro.

Vórtice las muestras diluidas durante 20 segundos seguido de autoclave durante 30 minutos a 121 grados centígrados. Para muestras secas como el suelo forestal, lleve a un volumen final de 20 mililitros con agua destilada después del autoclave, y vórtice la muestra diluida nuevamente durante 20 segundos como se ha demostrado. Una vez que las muestras se enfríen, centrífuga la muestra lisando durante cinco minutos a 11, 000 x g, y recoja el sobrenadante.

Prepare una extracción en fase sólida de cinco mililitros o una columna SPE llena de 100 miligramos de sorbente polimérico de modo mixto de aniones débiles que acondiciona el intercambiador de aniones con tres mililitros de metanol. Luego, equilibre el intercambiador de aniones con tres mililitros de agua destilada. Cargue hasta nueve mililitros del sobrenadante del lisado centrifugado en la columna SPE.

Lave secuencialmente las impurezas de la columna con cinco mililitros de acetato de amoníaco 25 milimolar y cinco mililitros de metanol. Después del lavado, eluya el cofactor F420 con un mililitro de tampón de elución. Preestablecimos el horno a 40 grados centígrados y ajustamos el detector de fluorescencia a una longitud de onda de extinción de 420 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 470 nanómetros.

A continuación, filtre la muestra eluida del SPE en viales de HPLC utilizando un filtro de PTFE con un tamaño de poro de 0,22 micras. Inyecte 50 microlitros de la muestra filtrada en el sistema HPLC y separe el cofactor F420 a través del modo de gradiente utilizando una combinación de fases móviles como se describe en el manuscrito. Analizar la composición y concentración del cofactor F420.

El crecimiento de cultivos puros de metanógenos se verificó mediante microscopía. En la microscopía de contraste de fase, son visibles los aglomerados de metanógenos, que emiten una luz azulada cuando el cofactor F420 se excita con luz ultravioleta. Se analizó el área pico del cofactor F420 recuperado después de SPE con diferentes volúmenes de los cultivos de Methanoculleus thermophilus.

La estrategia de desintegración en autoclave logró el área de pico más alta, concluyendo la máxima eficiencia de extracción utilizando un tratamiento de presión-temperatura. El análisis de la distribución de la longitud de la cola reveló las diferencias en la concentración global del cofactor F420 y la distribución de la longitud de la cola F420 de los cultivos metanogénicos puros en muestras ambientales. Al aplicar este procedimiento, tenga en cuenta que debe recopilar completamente el volumen total del búfer de elución o registrar el volumen exacto de flujo continuo.

Esta técnica allana el camino para la exploración del cofactor F420 en muestras más complejas como suelos y lodos y permite una visión más profunda del impacto ecológico de esta molécula.