Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de cadena nacientes dirigidas a las vías de plegado y ensamblaje. Aquí, describimos el perfil selectivo de ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccaromyces cerevisiae. El perfil selectivo de ribosomas es el único método hasta la fecha que captura y caracteriza las interacciones co-traduccionales in vivo de manera directa.
El perfil selectivo de ribosomas permite el perfil global de cualquier factor e interacción con la traducción de ribosomas en resolución cercana al codón. Comience recolectando las células de levadura construidas que contienen las proteínas marcadas deseadas. Realice la lisis celular utilizando la molienda criogénica en un molino mezclador dos veces durante dos minutos a 30 hercios.
Centrifugar durante dos minutos a 30.000 veces G a cuatro grados centígrados para limpiar el lisado y recoger el sobrenadante. Transfiera 200 microlitros del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga para el análisis total de ARN y 700 microlitros a un tubo de microcentrífuga para inmunopurificación. Digiera la muestra de ARN total previamente separada utilizando 10 unidades de RNasa I durante 25 minutos a cuatro grados Celsius en una rejilla de mezcla giratoria a 30 rotaciones por minuto.
Prepare la mezcla maestra de cojín de sacarosa como se describe en el manuscrito de texto. Luego, cargue la muestra en 400 microlitros del cojín de sacarosa y la centrífuga durante 90 minutos a 245, 000 veces G y a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante rápidamente con una bomba de vacío y superponga pellets con 150 microlitros de tampón de lisis.
Asegure la muestra con una envoltura de parafina y vuelva a suspender los gránulos agitando durante una hora a cuatro grados centígrados a 300 rotaciones por minuto. Lave de 100 a 400 microlitros de la matriz de unión de afinidad por muestra tres veces con un mililitro de tampón de lisis resuspiendo la matriz de afinidad en el tampón de lisis. Luego, gire a 30 rotaciones por minuto con una rejilla de mezcla giratoria a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.
Precipitado por centrifugación. Deseche el líquido superior y repita este proceso tres veces. Agregue la matriz de unión a la afinidad a la muestra de inmunopurificación previamente separada y digiera con RNasa I.Gire durante 25 minutos a 30 rotaciones por minuto y cuatro grados Celsius con un bastidor de mezcla giratorio para unir la proteína a la matriz de afinidad.
Prepare la mezcla maestra del tampón de lavado como se describe en el manuscrito de texto. Lave la matriz de unión de afinidad con un mililitro de tampón de lavado durante aproximadamente un minuto, girando en la rejilla de mezcla. A continuación, precipitar por centrifugación a 3000 veces G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados y desechar el líquido superior.
Repetir tres veces. Lave dos veces más en un mililitro de tampón de lavado, cada vez durante cinco minutos, girando en la rejilla de mezcla. Precipitar de nuevo por centrifugación.
Utilice 50 microlitros de perlas para la elución de proteínas con la misma cantidad de tampón de muestra 2X. Centrifugar para peletizar las perlas y desechar el líquido superior. Elute con 700 microlitros de Tris 10 milimolares.
Luego, congelar en nitrógeno líquido. Retire la muestra del nitrógeno líquido y guárdela a menos 80 grados centígrados para ser utilizada para la posterior extracción de ARN. Evaluar el éxito del paso de purificación de afinidad mediante tinción de Western blot o Coomassie con alícuotas de cada paso utilizando IP simulada en una cepa no etiquetada de tipo salvaje como control para la unión no específica a la matriz de afinidad.
Los resultados de Western blot después de la purificación por afinidad demostraron el éxito de la expresión de proteínas marcadas. El aislamiento de las huellas protegidas por ribosomas se validó utilizando los resultados del bioanalizador. Al generar una biblioteca de ADNc para la secuenciación profunda y el análisis de big data, el subciclo conduce a un bajo rendimiento.
Sin embargo, con los dNTP todavía presentes, la reacción procede, generando artefactos de PCR más largos con secuencias quiméricas debido a que los productos de PCR se ceban a sí mismos. La biblioteca generada fue validada aún más por electroforesis de ADN de alta sensibilidad para la distribución y cuantificación exacta del tamaño. La biblioteca de secuencias se recortó para adaptadores y códigos de barras y las lecturas resultantes se dividieron en diferentes grupos de secuencias de codificación, intrones y secuencias intergénicas.
Los perfiles de ribosomas que analizan las interacciones co-traduccionales de Vma2p con chaperonas asociadas a ribosomas Ssb1p, Pfk2p y Fas1p se muestran aquí con el esquema experimental de cada purificación de afinidad. Hubo ocupación de ribosomas a lo largo del marco de lectura abierto de los traducomas totales en comparación con los interactomas Ssb1, Pfk2p y Fas1p. El enriquecimiento medio de Ssb1p, Pfk2p y Fas1p en cada posición del ribosoma a lo largo del marco de lectura abierto se muestra aquí.
Este método permite la identificación y caracterización de las diversas interacciones co-traduccionales, asegurando un proteoma funcional, así como el estudio de diversas enfermedades. Hasta la fecha, el perfil selectivo de ribosomas es el único método que puede capturar y caracterizar estas interacciones de manera directa in vivo.
