La generación cibernética sigue siendo el protocolo de vanguardia para comprender el papel patógeno de cualquier nueva mutación del ADN mitocondrial y correlacionar el porcentaje de atriplasmia con la gravedad de la enfermedad. Esta técnica permite realizar investigación bioquímica en un sistema nuclear homogéneo, en el que la aportación del fondo nuclear del paciente está ausente. Esta técnica permite validar la patogenicidad de una mutación del ADN mitocondrial.
y permite estudiar su impacto a nivel bioquímico Lavar los platos de 35 milímetros que contienen los fibroblastos dos veces utilizando dos mililitros de 1X PBS sin calcio y magnesio. Limpie la superficie exterior de los platos con etanol al 70% y espere hasta que el alcohol se evapore. Retire las tapas de los platos y los tapones de rosca de las botellas.
Coloque cada plato sin la tapa boca abajo en la parte inferior de cada botella centrífuga de 250 mililitros. Agregue lentamente 32 mililitros de un medio de nucleación a cada botella permitiendo que el medio entre en el plato y entre en contacto con las células. Retire las burbujas de los platos con una pipeta de pasto de vidrio largo, curvando la punta en una llama de bunsen.
Cierre cada botella con el tapón de rosca y transfiéralas a la centrífuga. Centrifugar durante 20 minutos a 37 grados centígrados y 8.000 x G.Aspirar el medio de las botellas y desecharlo. Retire los platos invirtiendo las botellas en una gasa estéril previamente rociada con etanol al 70%.
Limpie la superficie exterior de los platos y sus tapas con etanol al 70%, y cierre los platos después de que el etanol se evapore. Antes de continuar, verifique la formación de citoplastos utilizando un microscopio invertido para células vivas. Busque fibroblastos extremadamente alargados debido a la extrusión de sus núcleos inducida por la citocalasina.
A cada plato de 35 milímetros agregue 1, 000, 143 celdas de fila cero. Re-suspendido en dos mililitros de medio de cultivo suplementado con 5% FBS. Deje los platos durante tres horas en una incubadora de dióxido de carbono humidificado para asentar las 143 celdas cero de la fila en los fantasmas.
Después de tres horas de incubación, aspire y deseche el medio. Lave las células de adherencia dos veces con dos mililitros de DMEM medio de glucosa alta sin suero o MEM, luego aspire y deseche el medio. Agregue 500 microlitros de solución de polietilenglicol a las células e incube durante exactamente un minuto.
Aspire y deseche la solución de polietilenglicol. Lave las células tres veces con dos mililitros de DMEM alto glucosa sin suero o con MEM. Agregue dos mililitros de medio de fusión e incube durante la noche en la incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
Tripsinizar las células en las placas de cultivo restantes Contarlas y sembrarlas en una o más placas de Petri Agregue de 50 a 100 células por plato en el cultivo suplementado hasta que aparezcan clones. Luego déjalos crecer durante varios días. Usando un microscopio estereoscópico, recoja los clones de la placa de Petri con cilindros de clonación o una punta de pipeta.
Trate de evitar agrupar diferentes clones y transfiéralos a una placa de 96 pocillos, cada uno de los cuales contiene 200 microlitros de medio de cultivo suplementado. Los cibridos se generaron a partir de fibroblastos derivados de un paciente portador del heteroplásmico M2343A2G Una de las mutaciones más comunes del ADN mitocondrial asociadas con miopatía mitocondrial, acidosis láctica encefalopatía y episodios similares a los accidentes cerebrovasculares. El análisis de un número variable de repeticiones en tándem mostró que el ADN cibernético es idéntico a las células de la fila cero, lo que confirma el reemplazo del ADN cibernético del paciente con el genoma 143 B.
El polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, o análisis de secuenciación, se puede utilizar para evaluar la presencia de la mutación del ADN mitocondrial y el porcentaje de heteroplasmia. Al intentar este protocolo, es importante verificar el activo genético correcto del nucleón y el ADN mitocondrial, así como la cantidad de ADN mitocondrial en los cibridos repoblados.
