El ensayo cometa es ampliamente utilizado para evaluar la genotoxicidad. Nuestro protocolo ofrece una serie de ventajas metodológicas sobre el ensayo estándar de cometas. Nuestra tecnología se centra en sostener las diapositivas estándar de cometas verticalmente y procesarlas en lotes de 25 en un bastidor especialmente diseñado.
Esto incluye electroforesis, por lo que el tanque es más pequeño, usa menos amortiguador y tiene enfriamiento integrado. Al mantenerse en un estante, los delicados geles de las guías están más protegidos y pasan de una solución a otra en 25 segundos. Usando nuestro protocolo de cometas de sangre, los investigadores pueden usar un pinchazo de sangre para estudiar el daño del ADN en humanos, otras especies y una amplia variedad de exposiciones ambientales potencialmente genotóxicas.
Cualquiera de los diferentes formatos para el ensayo de cometas que utilizan portaobjetos de microscopio como soporte sólido para los geles de cometa son susceptibles a nuestro enfoque. La parte crucial de esta técnica es cargar muestras después de mezclarlas con agarosa LMP. Las muestras deben cargarse rápidamente sin hacer burbujas y cubrirse con un cubreobjetos de inmediato antes de solidificarse.
Para comenzar, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0.6% en PBS y colóquela en un baño de agua a 37 grados centígrados. Etiquete el extremo esmerilado de las diapositivas prerecubiertas con el nombre, la fecha y la información del tratamiento con un marcador o lápiz permanente. Coloque una placa de enfriamiento en un banco plano e inserte dos paquetes de enfriamiento congelados en el cajón deslizante debajo de la superficie metálica.
Luego, coloque las diapositivas en la placa de enfriamiento para enfriar previamente durante uno o dos minutos. Centrifugar y retirar el sobrenadante de los tubos de muestra y colocarlos inmediatamente de nuevo en hielo. Resuspender el pellet celular con 200 microlitros de agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% y mezclar por pipeteo.
A continuación, agregue 80 microlitros de células que contienen agarosa en un portaobjetos refrigerado y coloque rápidamente un cubreobjetos sobre el gel. Deje que el gel se asiente en la placa de enfriamiento durante uno o dos minutos. Mientras tanto, prepare 500 mililitros de solución de trabajo de tampón de lisis y viértala en el plato de lisis.
Después de que los geles se hayan fraguado, retire los deslizamientos de la cubierta rápidamente sosteniendo suavemente el portaobjetos entre el pulgar y el índice y deslizando el deslizamiento de la cubierta fuera del gel. Luego, coloque las diapositivas dentro de un portador de diapositivas con todas las marcas de puntos negros en las diapositivas orientadas en la misma dirección. Coloque el portaportaobjetos dentro del plato de lisis.
Cierre la tapa del plato de lisis y póngalo para la incubación. Retire con cuidado el portaportaobjetos de la placa de lisis sin alterar los geles. Coloque suavemente el portaportaobjetos en un plato de lavado precargado con agua doble destilada helada.
Asegúrese de que las diapositivas estén completamente sumergidas y deje la configuración durante 30 minutos. Coloque un paquete de enfriamiento congelado debajo del tanque de electroforesis para mantener una temperatura de amortiguación óptima. Luego, agregue una solución de trabajo de electroforesis helada al tanque y transfiera el portador de la corredera a él.
Oriente los portaobjetos de tal manera que los geles que contienen células apunten hacia el cátodo. Incubar los portaobjetos en el tanque de electroforesis durante 20 minutos para permitir que el ADN se desenrolle. Luego, encienda la fuente de alimentación para realizar la electroforesis durante 20 minutos a 1.19 voltios por centímetro.
Una vez completada la electroforesis, apague la fuente de alimentación y retire el portaobjetos del tanque de electroforesis. Deje que el portaportadiapositivas drene sobre papel de seda durante 30 segundos. A continuación, coloque el portaportaobjetos en un plato que contenga tampón de neutralización y déjelo durante 20 minutos.
Después de esto, colóquelo en un plato de lavado que contenga agua doble destilada helada y déjelo durante 20 minutos. Después del lavado, retire el portaportaobjetos del agua y deje que los portaobjetos se sequen en una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora. Para rehidratar los portaobjetos, transfiera el portaportaobjetos a un plato de lavado que contenga agua doble destilada helada y déjelo durante 30 minutos.
Luego, coloque el portaportaobjetos en un plato de tinción que contenga 2.5 microgramos por mililitro de solución de yoduro de propidio. Cierre la tapa del plato de tinción e incube durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de la incubación, transfiera el portaportaobjetos a un plato separado y lávelo con agua doble destilada helada durante 20 minutos.
Retire el portaportaobjetos del plato y séquelo completamente en la oscuridad, ya sea en una incubadora de 37 grados centígrados o a temperatura ambiente. Después de que las diapositivas se sequen completamente, guárdelas en una caja de diapositivas en la oscuridad hasta que estén listas para el análisis de imágenes. Los queratinocitos humanos fueron irradiados con diferentes dosis de UVA y UVB o tratados con peróxido de hidrógeno 50-micromolar para inducir daño en el ADN.
El voltaje óptimo fue de 1,19 voltios centímetro, ya que induce la respuesta más sensible y el mayor porcentaje de ADN de cola. La sangre entera humana fue irradiada con diferentes dosis de UVA y tratada con diferentes concentraciones de Fpg. El ensayo de cometa alcalino de alto rendimiento reveló que los niveles óptimos de daño en el ADN se indujeron con cuatro unidades por mililitros de Fpg.
La línea celular de cáncer de ovario SK-OV-3 se trató con una combinación de cisplatino y peróxido de hidrógeno. Las células no expuestas no mostraron daño. La exposición al peróxido de hidrógeno solo generó un momento medio significativo de la cola de olivo en comparación con las células en las que se indujeron los enlaces cruzados intrahebra del ADN.
Después del tratamiento con cisplatino 100 micromolar, los enlaces cruzados intrafilamentos de ADN aumentaron con un pico a las 12 horas, después de lo cual los niveles disminuyeron a cero después de 30 horas. Es esencial colocar la bolsa de hielo en el tanque de electroforesis e incubar portaobjetos durante 20 minutos para desenrollar el ADN antes de la electroforesis. Este paso ayudará al ADN dañado a viajar por corriente. Ejecutar el ensayo con portaobjetos colocados verticalmente nos permitió automatizar el ensayo del cometa.
Además, nuestra técnica ha simplificado el ensayo de cometas para la investigación.
