La nueva vacuna de nanoemulsión tiene grandes ventajas en la terapia táctica de la enfermedad. Estos efectos establecidos se minimizan mediante propiedades tales como el chopismo tumoral único, la identificación de tácticas específicas y la baja toxicidad sistémica. Anticipamos que el protocolo proporcionará pistas técnicas y teóricas para el desarrollo futuro de nuevas vacunas mucosas de péptidos de tipo ectipo de células T.
Comience mezclando un miligramo de monofosrol lípido A con 100 microlitros de DMSO. Vortex durante cinco minutos y dejar que se disuelva durante cuatro horas a temperatura ambiente. Agregue cuantitativamente TWEEN 80 e I-OVA.
Mezclar los componentes y añadir el escualeno. A continuación, agregue 100 microlitros de solución MPLA a la mezcla preparada. Para preparar la vacuna de nanoemulsión, agregue la solución mezclada a las gotas de agua a aproximadamente el 70% del volumen total y revuelva suavemente para obtener una mezcla transparente y que fluya fácilmente.
Para los ensayos in vitro, comience con la reactivación de las células epiteliales BEAS2B. Encienda el baño de agua y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Descongele los viales de células congeladas rápidamente en un baño de agua, templado a 37 grados centígrados.
Después de la descongelación, pipetear rápidamente las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros y agregar dos mililitros del medio de crecimiento completo. Centrifugar el tubo a 129 G durante cinco minutos. Retire el supinato y resuspenda las células en dos mililitros del medio de crecimiento completo.
Después de centrifugar las células una vez más, retire el supinante y agregue seis mililitros de medio de crecimiento completo para resuspender las células. Luego transfiera las células a un matraz de cultivo T25 e incube a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Una vez que la densidad celular alcance el 80% al 90%, deseche el medio de cultivo y lave las células dos veces con dos mililitros de PBS.
Añadir un mililitro de 0,25%tripsin para digerir las células durante uno o dos minutos. Cuando se observe el redondeo de las células, agregue inmediatamente cuatro mililitros del medio de crecimiento completo para neutralizar la tripsina. Mezclar y aspirar las muestras en un tubo centrífugo estéril de 15 mililitros.
Centrifugar las muestras a 129 G durante cinco minutos. Retirar el supinato y resuspender las células en un mililitro de RPMI 1640 medio completo. Use 20 microlitros de la suspensión celular para el conteo de células y diluya las células a una vez de 10 a la quinta celda por mililitro.
Luego platear las células BEAS2B a una densidad de una vez 10 a la cuarta células por pocillo en placas de 96 pocillos en 100 microlitros de medio completo RPMI 1640, y pre incubar las placas durante 24 horas como se demostró anteriormente. Al final de la incubación, deseche el supinato y agregue 100 microlitros de RPMI 1640 a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Agregue 100 microlitros de nanoemulsión I-OVA, I-OVA mezclado con BNE e I-OVA prediluido con un medio de crecimiento completo a varias concentraciones finales con BNE como control e incube durante 24 horas a 37 grados centígrados.
Una vez que se complete la incubación, retire el medio y transfiera la placa a un lugar oscuro. Agregue 90 microlitros de medio de crecimiento completo y 10 microlitros de solución CCK8 a cada pocillo de la placa. Incubar la placa durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Mida la absorbancia de cada pocillo a 450 nanómetros utilizando un lector de placas marcado con enzimas. Use puntas de pipeta de 10 microlitros para realizar la inmunización nasal de los ratones con I-OVA, I-OVA más BNE e I-OVA NE durante tres días. Utilice BNE y PBA como control experimental.
Después, cortar muestras de aproximadamente tres milímetros de espesor de tejidos nasales con tijeras y colocarlas en paraformaldehído al 4%. Retire los tejidos pulmonares y fije los tejidos nasales y pulmonares enteros en paraformaldehído al 4% durante 24 horas. TEM y AFM se utilizan para la evaluación de las características básicas del potencial zeta superficial y el tamaño de partícula de la nanovacuna.
Se muestran los tamaños de partícula, los índices de polidispersidad, los potenciales zeta y la movilidad de electroforesis de I-OVA NE en los análisis de estabilidad de la musina. La viabilidad relativa de las células BEAS2B es superior al 80% en cultivos expuestos a diferentes concentraciones peptídicas de I-OVA, BNE+I-OVA e I-OVA NE durante 24 horas. El grupo I-OVA EN no tuvo toxicidad mucosa obvia, daño tisular, sangrado o infiltración celular inflamatoria.
Las células epiteliales BEAS2B capturaron más I-OVA NE etiquetadas con FITC que las de su solución de agua. El efecto de liberación sostenida de I-OVA NE in vitro se analizó utilizando el sistema IV-IS. La vacuna I-OVA NE tuvo un efecto de liberación sostenida en comparación con la solución acuosa de I-OVA.
En el grupo I-OVA NE, el porcentaje de tiempo de supervivencia es mayor en comparación con otros grupos, y el volumen tumoral fue significativamente menor, lo que sugiere que tiene un mejor efecto de protección preventiva que los otros grupos. En el modelo terapéutico, el tiempo medio de supervivencia fue significativamente diferente entre los diferentes grupos. El volumen tumoral del grupo I-OVA NE fue significativamente menor que el del grupo I-OVA.
Remover la mezcla uniformemente es importante en este procedimiento. De lo contrario, reducirá la eficiencia de las nanovacunas.
