Este protocolo describe métodos de vanguardia para generar datos de imágenes de alta resolución para diagnosticar defectos cardíacos congénitos. Realizamos evaluaciones funcionales con ecocardiografía fetal no invasiva combinada con necropsia seguida de histopatología de microscopía confocal episcopal para generar pilas de imágenes 2D en serie y reconstrucciones 3D para el diagnóstico integral de la cardiopatía coronaria. Este método puede dilucidar los cambios anatómicos detallados no solo en las cardiopatías congénitas, sino que también se puede usar para investigar defectos congénitos estructurales en otros órganos, incluidos defectos faciales craneales, anomalías de extremidades y esqueletos, así como defectos del cerebro y otros órganos viscerales.
Demostrando estos procedimientos estarán Meghan Holbrook, Carla Guzmán, Peizhao Zhang y Benjamin Glennon, todos investigadores de nuestro laboratorio. Después de preparar al ratón para el procedimiento, caliente el gel de ultrasonido a una temperatura corporal y aplíquelo generosamente sobre el área de imágenes. Luego coloque el transductor en el abdomen orientado en un plano horizontal e identifique la vejiga en la pantalla.
Una vez que se identifica la vejiga, escanee cranealmente desde la vejiga, busque el feto y determine la edad gestacional midiendo la longitud de la corona a la grupa. A continuación, use el doppler color para analizar el flujo sanguíneo del corazón. Para permitir la penetración fijadora en los órganos internos, haga incisiones en el tórax lateral y el abdomen con fórceps o tijeras de disección y permita que la muestra se fije durante al menos 24 horas en una habitación fría.
Luego configure el software para guardar las imágenes con un nombre, incluida la identificación de la muestra, el aumento del microscopio y el contenido de la imagen. Fije la muestra a través de sus muñecas y tobillos. Antes de cortar la piel a lo largo del eje mediano hacia la cola, levante la piel en el medio del cuello con fórceps y corte la piel hacia ambas axilas con las tijeras.
Luego corte la piel desde el ombligo hasta las piernas. Después de incrustar las muestras, ajuste la posición de proyección láser al centro de la muestra en la pantalla y ajuste la perilla del zoom a 20x. Para optimizar la resolución, ajuste la ganancia a 1, 250V.
Maximice el área azul con la perilla de enfoque y luego restablezca la ganancia a aproximadamente 750 V para obtener imágenes. A continuación, cambie el método de corte a automático. Ajuste el grosor a alrededor de 50 micrómetros y ejecute las diapositivas.
Deje de cortar cuando los pulmones y las vías respiratorias estén a la vista. Elija un grosor de corte entre ocho y 10 micrómetros y detenga la vista en vivo abierta. Abra Microtome Communicator para iniciar la creación de imágenes.
Asegúrese de que la carpeta de almacenamiento temporal esté vacía antes de recopilar imágenes. Detenga la recopilación de imágenes cuando no haya ninguna estructura rígida visible. Genere los archivos almacenados temporalmente en una serie de imágenes TIFF.
Para la reconstrucción de imágenes 3D, arrastre y suelte los archivos de imagen en el software de procesamiento de imágenes. Una vez que aparezca la ventana emergente, seleccione los enlaces o los archivos que desea copiar en la base de datos. Una vez abierto el archivo, haga clic en el menú de herramientas de reconstrucción 3D 2D de la barra de herramientas y seleccione MPR 3D.
Para la resolución de píxel X y la resolución de píxel Y, ingrese la resolución de imagen dando el zoom utilizado durante las imágenes de ECM. Para el intervalo de corte, introduzca el grosor de corte utilizado para cortar durante la toma de imágenes de ECM. A continuación, utilice la herramienta WWWL para ajustar el ancho y el nivel de la ventana.
Haga clic y arrastre la herramienta en la imagen hacia arriba para disminuir el brillo de la imagen y hacia abajo para aumentarlo. Haga clic y arrastre la herramienta en la imagen hacia la derecha para disminuir el contraste de la imagen y la palabra izquierda para aumentarlo. Arrastre las imágenes a las posiciones deseadas con la herramienta de panorámica.
Utilice la herramienta de zoom para ampliar o reducir la imagen y la herramienta de rotación para girar la imagen como desee. Ahora, haga clic y arrastre el eje de color del primer panel. Observe cómo la rotación de este eje cambia la orientación de los otros dos paneles.
Gire los tres ejes de los paneles hasta que los tres paneles representen vistas coronales, sagitales y transversales de la muestra. Una vez que los tres paneles estén colocados, orientados e iluminados adecuadamente, haga clic en el panel que representa la vista coronal. Luego haga clic en Exportación de películas en el lado derecho de la barra de menú.
Haga clic en lote y arrastre los controles deslizantes de y destino para abarcar toda la región de interés. Para el intervalo, seleccione la opción igual que el grosor y guarde el video indicando la orientación de las vistas. El eco muestra un tabique ventricular intacto sin derivación intraventricular y grandes arterias normales relacionadas en el control normal, lo que fue confirmado por ECM.
La vista frontal demuestra la comunicación entre LA, AR, LV y RV tanto en eco como en ECM, lo que sugiere comunicación interventricular. El flujo de color demuestra el flujo a través de VI y RV que indica comunicación interventricular. El eco y la ECM demostraron una doble salida del ventrículo derecho con una comunicación interventricular entre el VI y el VD con grandes arterias lado a lado.
El diagnóstico ecográfico del tronco arterioso persistente demuestra la comunicación entre el VI y el VD con un único tracto de salida que anula ambos ventrículos, también confirmado por la ECM en la etapa E14.5. Las secciones recogidas de la histología de la ECM se pueden procesar posteriormente para la inmunotinción, la tinción con hematoxilina y eosina e incluso la extracción de ácidos nucleicos para genotipado y perfil transcripcional o extracción de proteínas para análisis proteómico. Las imágenes de la reconstrucción tridimensional se pueden procesar aún más para evaluaciones de perímetros cuantitativos como el área o el volumen.
El fenotipado preciso para identificar defectos en la anatomía cardiovascular es esencial para establecer modelos de ratón genéticamente modificados y mutantes de cardiopatía congénita para dilucidar los mecanismos patológicos de la cardiopatía congénita. Esto puede conducir a oportunidades potenciales que desarrollen terapias e intervenciones para mejorar el resultado clínico en pacientes con cardiopatía congénita.
