Esta investigación fue financiada por los Proyectos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32172476, 32102275), el Programa de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) y los Fondos Centrales que Orientan el Desarrollo Local de la Ciencia y la Tecnología (XZ202301YD0042C).

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos, software y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Recolección y mantenimiento del cultivo de insectos
<ol><li>Adherir un grupo de ~5.000 huevos de Corcyra cephalonica (Stainton) en una tarjeta de 9 cm por 16 cm utilizando una solución 1:5 (v/v) de goma arábiga en polvo y agua25,26. NOTA: Evite colocar demasiados huevos del huésped en la tarjeta, ya que el hacinamiento hace que no sea práctico para los procedimientos posteriores de transferencia y disección.</li>
	<li>Para evitar la eclosión de los huevos del huésped, someta las tarjetas de huevos del huésped a 30 minutos de irradiación ultravioleta (UV) (Figura 1-i). Posteriormente, corte el papel con huevos inactivados en tarjetas de huevo de 1 cm de grosor y 8 cm de diámetro, conteniendo cada una aproximadamente 300-500 huevos (Figura 1-ii)25,26,27.</li>
	<li>Introducir una cohorte de 80-120 avispas T. denrolimi en un tubo de vidrio de 2 cm de diámetro y 8 cm de longitud. Sella el tubo con algodón. NOTA: Mantener las avispas a una temperatura de 25 ± 1 °C, con un ciclo de luz/oscuridad de 16 h de luz y 8 h de oscuridad y mantener una humedad relativa de aproximadamente el 75%.</li>
	<li>Presente una tarjeta de huevo del huésped a las avispas para que las parasiten (Figura 1-ii). Deje que las avispas depositen sus huevos en los huevos del huésped durante 6 h, después de lo cual retire rápidamente las avispas. NOTA: Evite prolongar excesivamente el período de parasitación, ya que esto puede conducir a un hacinamiento de la descendencia de T. denrolimi dentro de un huevo huésped, lo que resulta en un aumento de la mortalidad de la avispa de la descendencia28,29.</li>
</ol>2. Síntesis de dsRNA
<ol><li>Diseñar conjuntos de cebadores que contengan un promotor T7 para la síntesis de ARN bicatenario (dsRNA). Elija un segmento de 300-400 pb del gen objetivo (Ferhch) para la síntesis de dsRNA.</li>
	<li>Adquirir conjuntos de cebadores sintetizados comercialmente para la producción de dsRNA para el gen objetivo y dsGFP para su uso como control negativo.</li>
	<li>Extraer el contenido de ARN de 100 avispas T. denrolimi utilizando el kit de referencia siguiendo el protocolo del fabricante9. Comprobar la calidad del contenido de ARN; si el valor de OD260/OD280 oscila entre 1,8 y 2,09.</li>
	<li>Purifique el contenido de ARN con 2 μL de tampón 5x (1 U/50 μL), 1 μL de ADNasa (1 U/50 μL) y 6,5 μL de ARN (~100 ng/μL), 0,5 μL deH2O a 42 °C durante 2 min.</li>
	<li>Realice la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para generar una plantilla de ADNc con 10 μL de ARN purificado (~100 ng/μL), 4 μL de tampón 5x (1 U/50 μL), 1 μL de mezcla de enzimas I (1 U/50 μL) y 4 μL deH2O. Realice la RT-PCR con los siguientes ajustes: 37 °C durante 15 min, 85 °C durante 5 s. Almacenar el producto de ADNc a -4 °C hasta su uso.</li>
	<li>Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de dsRNA de acuerdo con la mezcla maestra de referencia (10 μL de Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL de cebador directo [0,4 μM], 0,8 μL de cebador inverso [0,4 μM], 0,8 μL de molde de ADN [40 ng/μL] y 7,6 μL deH2O). Realice la PCR con los siguientes ajustes: 94 °C durante 2 min; 35 ciclos con 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s; 72 °C durante 2 min.</li>
	<li>Evaluar la calidad de los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2,0% 5,9 y confirmar la secuencia diana mediante secuenciación Sanger.</li>
	<li>Purifique el producto de PCR con el kit de extracción de gel según las pautas del fabricante 9,23.</li>
	<li>Utilice un sistema de ARNi para sintetizar dsRNA para el gen diana con 10 μL de tampón 2x (0,02 U/μL), 8 μL de molde de ADN (75 ng/μL) y 2 μL de mezcla de enzimas (1 U/50 μL) con los siguientes ajustes: 37 °C durante 30 min, 70 °C durante 10 min, y 25 °C durante 20 min. Eluir el dsRNA sintetizado con 30 μL de agua libre de nucleasas.</li>
	<li>Evaluar la calidad del producto dsRNA visualizándolo en un gel de agarosa al 1,0% 5,9. Diluir el dsRNA a 7.000 ng/μL. Comprobar la calidad del producto dsRNA; si el valor de OD260/OD280 oscila entre 1,8 y 2,09. Almacenar el producto dsRNA a -20 °C hasta su uso.</li>
</ol>3. Trasplante de pupas de T. denrolimi 
<ol><li>Cultive los huevos del huésped parasitado durante aproximadamente 8 días a 25 ± 1 ° C, manteniendo un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad y una humedad relativa de ~ 75%. Los huevos del huésped parasitado se ennegrecerán después de 5 días30 (Figura 1-iv, v).</li>
	<li>Transfiera la tarjeta del huevo huésped a un microscopio de disección. Emplee un par de agujas de tungsteno (Figura 1-vi) para eliminar meticulosamente el corion de los huevos del huésped (Figura 1-vii) y recuperar la pupa del interior (Figura 1-viii)5,17,18. NOTA: La punta de la aguja de disección debe ser inferior a 0,05 mm.</li>
	<li>Prepare una placa limpia para el sustrato. Vierta 10-15 ml de una solución de agar de 15 g/L, dejando que se enfríe naturalmente (Figura 2-i). NOTA: Mezcle la solución de agar con 0,5 g de estreptomicina para inhibir el crecimiento de contaminantes in vitro.</li>
	<li>Emplee un buril desinfectado para grabar varias ranuras que midan 0,2-0,3 mm de profundidad y 0,4-0,8 mm de ancho (Figura 2-ii).</li>
	<li>Use un cepillo pequeño (Figura 2-iii) para trasplantar una pupa del huevo huésped diseccionado a una de las ranuras del sustrato de agar (Figura 2-iv).</li>
	<li>Repita los pasos 3.4 y 3.5, trasplantando 100-300 pupas individualmente en los surcos uno por uno (Figura 2-v).</li>
</ol>4. Microinyección de dsRNA en la pupa de T. denrolimi
<ol><li>Use un extractor de agujas de vidrio para extraer un capilar de vidrio (Figura 3-i, ii). Ajuste el calor a 280, la velocidad a 170, el retardo a 250 y el tirón a 30 en un extractor de agujas (Figura 3-iii). Prepare varias agujas de vidrio capilar para la microinyección (Figura 3-iv, v).</li>
	<li>Biselar la punta de la aguja de vidrio con una placa abrasiva (Figura 3-vi). NOTA: Asegúrese de que la punta de la aguja de inyección permanezca afilada; de lo contrario, puede provocar la mortalidad de la pupa o impedir el flujo de reactivos a través de la aguja (Figura 3-vii).</li>
	<li>Cargue aproximadamente 2 μL de la solución inyectable de dsRNA con 7.000 ng/μL en la aguja de inyección preparada utilizando una bomba de microinyección (Figura 3-vii).</li>
	<li>Transfiera el sustrato de agar que contiene cientos de pupas a la plataforma de un microscopio compuesto (Figura 3-viii).</li>
	<li>Inserte con cuidado la aguja de inyección en el abdomen de una pupa de T. denrolimi en un ángulo de ~30° con respecto al abdomen debajo de la lente (Figura 3-ix).</li>
	<li>Inyecte gradualmente ~ 5 nL de la solución inyectable (paso 4.3) en la pupa de T. denrolimi lo más suavemente posible. NOTA: La pupa de T. denrolimi puede hincharse ligeramente a medida que se inyecta la solución de dsRNA. La inyección de una cantidad excesiva de solución en la pupa o el uso de agujas con aberturas demasiado grandes puede provocar la muerte prematura de la pupa. Cambie las agujas cuando se obstruyan después de inyectar varias o decenas de pupas.</li>
	<li>Repita los pasos 4.5 y 4.6, inyectando dsRNA en 600 pupas una por una. NOTA: Para un análisis confiable de RT-qPCR, el contenido de ARN debe aislarse de al menos 100 pupas. Inyectar al menos 600 pupas para tres réplicas en el tratamiento con dsRNA y tres réplicas en el control negativo de dsGFP 9.</li>
</ol>5. Incubación de pupas de T. denrolimi
<ol><li>Transfiera el sustrato que contiene las pupas inyectadas a una incubadora a 25 ± 1 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 16 h/8 h y ~75% HR.</li>
	<li>Incubar aproximadamente 700 pupas de T. denrolimi por tratamiento durante 24 h o 48 h. Extraer el contenido de ARN de un grupo de 100 pupas por réplica9. NOTA: Retire las pupas encogidas (pupas muertas) de las muestras; de lo contrario, puede dar lugar a errores en la detección de la expresión génica.</li>
	<li>Incubar ~50 pupas de T. denrolimi por tratamiento hasta que emerjan las avispas (Figura 3-x). Registre la tasa de emergencia y la tasa de deformidad.</li>
</ol>6. Detección de la expresión génica diana
<ol><li>Diseñar el conjunto de cebadores para el gen diana y los genes de referencia para RT-qPCR utilizando una herramienta de diseño. NOTA: Asegúrese de que las secuencias de los cebadores RT-qPCR no se superpongan con la región objetivo del dsRNA.</li>
	<li>Emplear el gen forkhead box O (FoxO) como gen de referencia en el análisis de RT-qPCR; los cebadores de FoxO han sido reportados previamente9.</li>
	<li>Obtener juegos de cebadores sintetizados comercialmente. Realice RT-qPCR con 10 μL de Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL de cebador directo (0,4 μM), 0,8 μL de cebador inverso (0,4 μM), 0,8 μL de molde (10 ng/μL) y 7,6 μL deH2O. Realice RT-qPCR con los siguientes ajustes: 95 °C durante 30 s; 35 ciclos con 95 °C durante 5 s, 57 °C durante 30 s, 72 °C durante 30; 95 °C durante 10 s; 60 °C durante 5 s y 95 °C durante 5 s.</li>
	<li>Calcular el valor de expresión del gen diana mediante el método 2-ΔΔCt 9,25.</li>
	<li>Emplear la prueba de Kruskal-Wallis para analizar la expresión del gen diana bajo la influencia de diferentes tratamientos (dsFerhch, dsGFP, no inyección). NOTA: Evite el uso de pruebas paramétricas (p. ej., prueba t) para comparaciones post-hoc, ya que la heterocedasticidad y la no normalidad de los datos pueden llevar a conclusiones erróneas25.</li>
</ol>

Avance de las técnicas de ARNi en Trichogramma dendrolimi para el análisis de la función génica

<ol>
	<li>Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+control+with+Trichogramma+in+China:+History,+present+status+and+perspectives.">Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives.</a> Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+clutch+size+for+quality+control+of+bisexual+and+Wolbachia-infected+thelytokous+lines+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae)+mass+reared+on+eggs+of+a+substitutive+host,+Antheraea+pernyi+Gu&#233;rin-M&#233;neville+(Lepidoptera:+Saturniidae).">Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Gu&#233;rin-M&#233;neville (Lepidoptera: Saturniidae).</a> Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).</li><li>Li, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+the+biological+control+of+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+by+egg+parasitoids.">Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids.</a> J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+superparasitism+on+quality+and+characteristics+of+thelytokous+Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae)+during+mass+rearing.">Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing.</a> Sci Rep. 9 (1), 18114 (2019).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrance+during+Wolbachia-mediated+parthenogenesis+of+Trichogramma+wasps+is+reduced+by+continuous+oviposition,+associated+with+exhaustion+of+Wolbachia+titers+in+ovary+and+offspring+eggs.">Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs.</a> Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).</li><li>Huang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+and+large-scale+releases+of+Trichogramma+promote+pesticide+decrease+in+maize+in+northeastern+China.">Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China.</a> Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Trichogramma+japonicum+as+a+vector+of+Beauveria+bassiana+for+parasitizing+eggs+of+rice+striped+stem+borer,+Chilo+suppressalis.">Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis.</a> Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).</li><li>Ning, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+expression+pattern+of+the+sex+determination+genes+and+their+sex-specific+variants+in+the+egg+parasitoid+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae).">The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> Front Physiol. 14, 1243753 (2023).</li><li>Huo, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+evaluation+of+RT-qPCR+reference+genes+for+expression+analysis+in+the+tiny+egg+parasitoid+wasp,+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae).">Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883 (2022).</li><li>Leung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+biological+control:+the+need+for+integrating+genetics+and+genomics.">Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens.">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+an+essential+gene+involved+in+infestation+and+digestion+in+grain+aphid+through+plant-mediated+RNA+interference+generates+aphid-resistant+wheat+plants.">Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants.</a> Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation.">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> J Vis Exp. 130, e56990 (2017).</li><li>Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pupal+and+Adult+Injections+for+RNAi+and+CRISPR+Gene+Editing+in+Nasonia+vitripennis.">Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis.</a> J Vis Exp. 166, e61892 (2020).</li><li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis.">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li><li>Zhu, K. Y., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+Applications,+and+Challenges+of+Insect+RNA+Interference.">Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference.</a> Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).</li><li>Colinet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+RNAi+in+a+Drosophila+endoparasitoid+wasp+and+demonstration+of+its+efficiency+in+impairing+venom+protein+production.">Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production.</a> J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digestive+tract+expressing+&#945;-amylase+influences+the+adult+lifespan+of+Pteromalus+puparum+revealed+through+RNAi+and+rescue+analyses.">A digestive tract expressing &#945;-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses.</a> Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+is+outcompeted+by+its+uninfected+counterpart+in+superparasitism+but+does+not+have+developmental+delay.">Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay.</a> Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+concentration+of+Wolbachia+during+the+early+embryogenesis+of+the+host+dynamically+shapes+the+tissue+tropism+of+Wolbachia+in+host+Trichogramma+wasps.">Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps.</a> Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428 (2023).</li><li>Lee, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Trichogramma+evanescens+Westw.+and+its+influence+on+the+embryonic+development+of+its+host,+Attacus+cynthia+ricini+Boisd.">The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd.</a> Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).</li><li>Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+silencing+of+genes+in+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+affects+survival,+growth+and+female+fecundity.">RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity.</a> Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).</li><li>Wu, S., Yin, S., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+iron+trafficking+in+Drosophila+melanogaster.">Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster.</a> Curr Res Insect Sci. 50, 100888 (2022).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-Driven+Memory+Loss+in+a+Parasitic+Wasp+Increases+Superparasitism+to+Enhance+Horizontal+Transmission.">Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission.</a> mBio. 13 (6), e0236222 (2022).</li><li>Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradual,+temperature-induced+change+of+secondary+sexual+characteristics+in+Trichogramma+pretiosum+infected+with+parthenogenesis-inducing+Wolbachia.">Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia.</a> PeerJ. 7, e7567 (2019).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+Wolbachia+titers+cause+gradual+change+in+masculinization+of+intersex+individuals+of+thelytokous+Trichogramma+dendrolimi.">Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi.</a> Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parasitism:+A+promising+approach+to+simultaneously+produce+Trichogramma+chilonis+and+T.+dendrolimi+on+eggs+of+Antheraea+pernyi.">Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi.</a> Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Thelytokous+parthenogenesis-inducing+Wolbachia+on+the+fitness+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae)+in+superparasitised+and+single-parasitised+hosts.">Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts.</a> Front Ecol Evol. 9, 730664 (2021).</li><li>Flanders, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notes+on+the+life+history+and+anatomy+of+Trichogramma.">Notes on the life history and anatomy of Trichogramma.</a> Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Las avispas Trichogramma son reconocidas como agentes de control biológico eficaces, dirigidos específicamente a una variedad de plagas de lepidópteros en la agricultura y la silvicultura1. Estas diminutas avispas pasan por sus etapas inmaduras dentro del huevo huésped, una característica que presenta desafíos en la realización de experimentos de ARNi 5,18. Este estudio ofrece una guía visual completa para la realización ...

Trichogramma spp. es un grupo de parasitoides de huevos que han sido ampliamente utilizados como agentes de control biológico altamente eficientes contra un amplio espectro de plagas de lepidópteros en ecosistemas agrícolas y forestales en todo el mundo 1,2,3,4. La aplicación de Trichogramma criado en masa proporciona un enfoque respetuoso con el medio ambiente para el manejo sostenible de plagas 5,6,7. La comprensión de la biología molecular de las avispas Trichogramma proporciona información valiosa para mejorar la eficiencia de la cría masiva y el rendimiento en el campo de estos agentes de control biológico 8,9 mediante la investigación de la metodología de regulación génica y edición del genoma10.
Desde el descubrimiento de la interferencia genética específica mediada por ARN bicatenario (dsRNA) en Caenorhabditis elegans en 1998, el método de ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en un conjunto de herramientas genéticas vitales para explorar los mecanismos reguladores de los organismos mediante la supresión de la expresión de genes diana11. Los experimentos con ARNi se han convertido en una metodología estándar ampliamente aplicada para estudiar la función génica en numerosas especies de insectos12,13. Sin embargo, la manipulación del ARNi presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides, particularmente entre las pertenecientes a la familia endoparásita Chalcidoidea 14,15,16. El método ARNi ha sido documentado en al menos 13 especies de parasitoides 14,15,16,17,18,19. Entre estos, el enfoque de ARNi se ha llevado a cabo de manera integral en avispas Nasonia y es aplicable a lo largo de las etapas de desarrollo, incluidos embriones, larvas, pupas y adultos 14,15,16. Cabe destacar que las avispas Nasonia son ectoparasitoides, y sus crías se desarrollan en el espacio intersticial entre la pupa huésped y el pupario, lo que permite su cultivo in vitro y las hace tolerar ciertos tratamientos, como la microinyección. A diferencia de las avispas Nasonia, los individuos de Trichogramma experimentan todo su desarrollo embrionario, larval y pupal dentro del huevo huésped. La capa en estadios embrionario y larvario (que puede impedir la permeabilidad del dsRNA), la vulnerabilidad al daño y la dificultad para sobrevivir in vitro presentan obstáculos formidables 20,21,22. Además, el diminuto tamaño de los individuos de Trichogramma, aproximadamente ~0,5 mm de longitud adulta o pupa, los hace extremadamente intrincados para manipular 20,21,22.
En el presente estudio, describimos un procedimiento integral para realizar experimentos de ARN de interferencia (ARNi) en Trichogramma denrolimi Matsumura. Este procedimiento engloba los siguientes procedimientos: (1) el diseño y síntesis de ARN bicatenario (dsRNA), (2) microinyección de pupas de T. denrolimi, (3) el trasplante e incubación in vitro de estas pupas, y (4) la detección de knockdown de genes diana mediante análisis RT-qPCR. El gen diana seleccionado para el experimento de ARNi es la homología de cadena pesada de ferritina (Ferhch). El FerHCH, una proteína de unión al hierro, contiene un centro de ferroxidasa dotado de capacidades antioxidantes, lo que facilita la oxidación de Fe2+ a Fe3+. Desempeña un papel indispensable en el crecimiento y desarrollo de diversos organismos al mantener el equilibrio redox y la homeostasis del hierro. La depleción de FerHCH puede dar lugar a la acumulación excesiva de hierro, lo que conduce a daños irreversibles en los tejidos y, a menudo, culmina en alteraciones fenotípicas significativas, incluidos defectos de crecimiento, deformidades y mortalidad23,24. Este estudio ofrece una guía paso a paso para realizar ARNi en T. denrolimi, que será invaluable para investigar las funciones génicas dentro del contexto más amplio de las avispas Trichogramma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x ES Taq MasterMix (Dye)</td>
			<td>Cowin Biotech, China</td>
			<td>CW0690H</td>
			<td>To amplify the dsRNA sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td>B540627-0500</td>
			<td>To dilute dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar strip</td>
			<td>Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To make culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td>A610028</td>
			<td>To make culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioer Constant temperature metal bath&#160;</td>
			<td>BIOER, China</td>
			<td>MB-102</td>
			<td>To synthesis dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary&#160;</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>To pull capillary glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench&#160;</td>
			<td>Airtech, China</td>
			<td>SW-CJ-1FD</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled water</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td>A500197-0500</td>
			<td>To dilute cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Testing chamber&#160;</td>
			<td>Panasonic, Japan</td>
			<td>MLR-352H-PC</td>
			<td>To culture T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>5418R</td>
			<td>To store RNA content</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>To inject T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Refrigerated Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution (75%, RNase-free)</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>M052131-500ml</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Omega, USA</td>
			<td>D25000-02</td>
			<td>To extract cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GUM Arabic</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CG5991-500g</td>
			<td>To make egg card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alchohol</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>80109218</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>SUTTER, USA</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To pull capillary glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader&#160;</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>20 &#181;L</td>
			<td>To load dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-sample tissue grinder&#160;</td>
			<td>LICHEN, China</td>
			<td>LC-TG-24</td>
			<td>To grind T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Grinder&#160;</td>
			<td>SUTTER, USA</td>
			<td>BV-10-E</td>
			<td>To grind capillary glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td></td>
			<td>To dilute RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS Microscope</td>
			<td>OLYMPUS, Japan</td>
			<td>XZX16</td>
			<td>To observe T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine&#160;</td>
			<td>Bio-rad, USA</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>For DNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic</td>
			<td>Bio-rad, USA</td>
			<td>PowerPacTM Basic</td>
			<td>To detect the quality of dsRNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of dsGFP (Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG] 
			ACAAACCAAGGCAAGTAATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of dsGFP (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG] 
			CAGAGGCATCTTCAACG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for qPCR (Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG]AG 
			TAGCCATCATCTTTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for RNAi(Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG] 
			ACACTGTCAATCGTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of FoxO for qPCR (Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTACGCCGATCTCATAACGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of FoxO for qPCR (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGCTGTCGCCCTTGTCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa, Japan</td>
			<td>RR047A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Real-time PCR&#160;</td>
			<td>Bio-rad, USA</td>
			<td>CFX 96 Touch</td>
			<td>To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RiBoMAX Express RNAi System</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>P1700</td>
			<td>To synthesis dsRNA &#160;in vitro&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex TaqTM <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66250/66250eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (Til RnaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa, Japan</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>To perform RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethane</td>
			<td>KESHI, China</td>
			<td>GB/T682-2002</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion, USA</td>
			<td>15596018</td>
			<td>To extract total RNA content from samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Freezer&#160;</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>Forma 911</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna interference in the egg parasitoid, trichogramma dendrolimi matsumura

Los parasitoides del huevo, Trichogramma spp, son reconocidos como agentes de control biológico eficientes contra diversas plagas de lepidópteros en la agricultura y los bosques. Las etapas inmaduras de la descendencia de Trichogramma se desarrollan dentro del huevo huésped, exhibiendo una notable diminución (aproximadamente 0,5 mm de longitud adulta). La metodología de ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en una herramienta crucial para dilucidar las funciones de los genes en numerosos organismos. Sin embargo, la manipulación del ARNi en ciertas especies de parasitoides pequeños, como Trichogramma, generalmente ha planteado desafíos significativos. En este estudio, presentamos un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. El procedimiento descrito abarca la adquisición y el aislamiento de muestras individuales de T. dendrolimi a partir de óvulos del huésped, el diseño y la síntesis de ARN bicatenario (dsRNA), el trasplante in vitro y el cultivo de pupas de T. dendrolimi , la microinyección de dsRNA y la posterior evaluación de la eliminación del gen diana mediante el análisis RT-qPCR. Este estudio proporciona un procedimiento completo y visualmente detallado para realizar experimentos de ARNi en T. dendrolimi, lo que permite a los investigadores investigar la regulación génica en esta especie. Además, esta metodología es adaptable para estudios de ARNi o microinyecciones en otras especies de Trichogramma con pequeños ajustes, lo que la convierte en una referencia valiosa para la realización de experimentos de ARNi en otras especies endoparásitas.

Trichogramma spp. are a group of egg parasitoids that have been extensively utilized as highly efficient biological control agents against a wide spectrum of lepidopteran pests in agricultural and forest ecosystems worldwide1,2,3,4. The application of mass-reared Trichogramma provides an environmentally friendly approach for the sustainable management of pests5,6,7. Understanding the molecular biology of Trichogramma wasps provides valuable insights into enhancing the mass-rearing efficiency and field performance of these biological control agents8,9by investigating the methodology of gene regulation and genome editing10.
Since the discovery of double-stranded RNA (dsRNA)-mediated specific genetic interference in Caenorhabditis elegans in 1998, the RNA-interference (RNAi) method has evolved into a vital genetic toolkit for exploring the regulatory mechanisms of organisms by suppressing the expression of target genes11. RNAi experiments have become a standard methodology widely applied to study gene function in numerous insect species12,13. Nevertheless, the manipulation of RNAi presents a formidable challenge in many parasitoid species, particularly among those belonging to the endoparasitic Chalcidoidea family14,15,16. The RNAi method has been documented in at least 13 parasitoid species14,15,16,17,18,19. Among these, the RNAi approach has been comprehensively conducted in Nasonia wasps and is applicable throughout the developmental stages, including embryos, larvae, pupae, and adults14,15,16. It is noteworthy that Nasonia wasps are ectoparasitoids, with their offspring developing in the interstitial space between the host pupa and the puparium, enabling their cultivation in vitro and making them tolerate certain treatments, such as micro-injection. Unlike Nasonia wasps, Trichogramma individuals undergo their entire embryonic, larval, and pupal development inner the host egg. The layer at embryo and larva stages (which may impede dsRNA permeability), vulnerability to damage, and the difficulty in surviving in vitro present formidable obstacles20,21,22. Additionally, the diminutive size of Trichogramma individuals, approximately ~0.5 mm in adult or pupal length, renders them exceedingly intricate to manipulate20,21,22.
In the present study, we outline a comprehensive procedure for conducting RNA interference (RNAi) experiments in Trichogramma denrolimi Matsumura. This procedure encompasses the following procedures: (1) the design and synthesis of double-stranded RNA (dsRNA), (2) microinjection of T. denrolimi pupae, (3) the transplantation and in vitro incubation of these pupae, and (4) the detection of target gene knockdown through RT-qPCR analysis. The target gene selected for the RNAi experiment is the ferritin heavy chain homology (Ferhch). FerHCH, an iron-binding protein, contains a ferroxidase center endowed with antioxidant capabilities, facilitating the oxidation of Fe2+ to Fe3+. It plays an indispensable role in the growth and development of various organisms by maintaining redox equilibrium and iron homeostasis. Depletion of FerHCH can result in the overaccumulation of iron, leading to irreversible tissue damage, and often culminating in significant phenotypic alterations, including growth defects, deformities, and mortality23,24. This study offers a step-by-step guide for conducting RNAi in T. denrolimi, which will be invaluable for investigating the gene functions within the broader context of Trichogramma wasps.

Autor destacado: Investigación de la partenogénesis de Thelytokous inducida por Wolbachia y el desarrollo de herramientas genéticas a través de la interferencia de ARN

Interferencia de ARN en el parasitoide del huevo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Trichogramma wasps are a group of egg parasitoids used to control lepidopteran pests in agriculture. The intracellular bacteria Wolbachia induces thelytokous parthenogenesis in some Trichogramma wasps. We are trying to answer the mechanism of Wolbachia and sex-determination systems in Trichogramma wasps.We have developed the RNA interference method in Trichogramma wasps. This method is a vital genetic toolkit for investigating the gene functions of Trichogramma. The immature stages of Trichogramma offspring develop within the host egg.The body size of Trichogramma is extremely small and is approximately 0.5 millimeter in adult length. The manipulation of genetic tools such as RNA interference and genome editing presents a formidable challenge for these tiny parasitoid wasps. For decades, gene functions within the entire Trichogramma genus have been rarely explored.The present methodology provides a robust model for investigating gene regulation during developmental and physiological activities in Trichogramma wasps.

La tasa de emergencia de pupas de T. denrolimi inyectadas con dsFerhch fue significativamente menor que la de las inyectadas con dsGFP o las que no lo recibieron (Tabla 1). Entre las avispas emergidas, el 51,85% de las avispas T. denrolimi sometidas a dsFerhch desarrollaron pequeñas alas deformadas. Las avispas deformadas no se observaron en las avispas inyectadas con dsGFP o sin ninguna inyección (Tabla 1). Además, los abdómenes ...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura at JoVE.com

La manipulación del ARN de interferencia (ARNi) presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides con tamaño diminuto, como las avispas Trichogramma . Este estudio delineó un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. La presente metodología proporciona un modelo robusto para investigar la regulación génica en avispas Trichogramma .

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and ...

Las avispas Trichogramma son un grupo de parasitoides de huevos utilizados para controlar plagas de lepidópteros en la agricultura. La bacteria intracelular Wolbachia induce la partenogénesis de thelytokous en algunas avispas Trichogramma. Estamos tratando de responder al mecanismo de Wolbachia y a los sistemas de determinación del sexo en avispas Trichogramma.Hemos desarrollado el método de interferencia de ARN en avispas Trichogramma. Este método es un conjunto de herramientas genéticas vitales para investigar las funciones genéticas de Trichogramma. Las etapas inmaduras de la descendencia de Trichogramma se desarrollan dentro del huevo huésped.El tamaño del cuerpo de Trichogramma es extremadamente pequeño y mide aproximadamente 0,5 milímetros de longitud adulta. La manipulación de herramientas genéticas como la interferencia de ARN y la edición del genoma presenta un desafío formidable para estas diminutas avispas parasitoides. Durante décadas, las funciones de los genes dentro de todo el género Trichogramma han sido raramente exploradas.La presente metodología proporciona un modelo robusto para investigar la regulación génica durante el desarrollo y las actividades fisiológicas en avispas Trichogramma.

rna-interference-egg-parasitoid-trichogramma-dendrolimi

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

1.0K vistas.  Shenyang Agricultural University. Las avispas Trichogramma son un grupo de parasitoides de huevos utilizados para controlar plagas de lepidópteros en la agricultura. La bacteria intracelular Wolbachia induce la partenogénesis de thelytokous en algunas avispas Trichogramma. Estamos tratando de responder al mecanismo de Wolbachia y a los sistemas de determinación del sexo en avispas Trichogramma.Hemos desarrollado el método de interferencia de ARN en avispas Trichogramma. Este método es un conjunto de herramientas g...

Video: Autor destacado: Investigación de la partenogénesis de Thelytokous inducida por Wolbachia y el desarrollo de herramientas genéticas a través de la interferencia de ARN

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and forests. The immature stages of Trichogramma offspring develop within the host egg, exhibiting remarkable diminutiveness (approximately 0.5 mm in adult length). RNA-interference (RNAi) methodology has emerged as a crucial tool for elucidating gene functions in numerous organisms. However, manipulating RNAi in certain small parasitoid species, such as Trichogramma, has generally posed significant challenges. In this study, we present an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The outlined procedure encompasses the acquisition and isolation of individual T. dendrolimi specimens from host eggs, the design and synthesis of double-stranded RNA (dsRNA), the in vitro transplantation and cultivation of T. dendrolimi pupae, the micro-injection of dsRNA, and the subsequent assessment of target gene knockdown through RT-qPCR analysis. This study furnishes a comprehensive, visually detailed procedure for conducting RNAi experiments in T. dendrolimi, thereby enabling researchers to investigate the gene regulation in this species. Furthermore, this methodology is adaptable for RNAi studies or micro-injections in other Trichogramma species with minor adjustments, rendering it a valuable reference for conducting RNAi experiments in other endoparasitic species.

The manipulation of RNA interference (RNAi) presents a formidable challenge in many parasitoid species with diminutive size, such as Trichogramma wasps. This study delineated an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The present methodology provides a robust model for investigating gene regulation in Trichogramma wasps.

Investigación

Biología

Cultivation and Transplantation of Trichogramma dendrolimi Pupae Using Corcyra cephalonica Eggs

To begin, add a solution of gum Arabic powder and water to a nine centimeter by 16 centimeter card. Then place approximately 5, 000 eggs of Corcyra cephalonica onto the card. Subject the host egg cards to 30 minutes of ultraviolet irradiation to prevent the hatching of eggs.Subsequently, cut the paper with inactivated eggs into egg cards, each containing approximately 300 to 500 eggs. Next, introduce a cohort of 80 to 120 Trichogramma dendrolimi wasps into a glass tube. Seal the tube with cotton.For parasitization, allow the wasps to deposit their eggs into the host eggs for six hours. Then promptly remove the wasps. Cultivate the parasitized host eggs for approximately eight days at 25 degrees Celsius.After five days, the parasitized host eggs turned black. Transfer the host egg card to a dissecting microscope. Using a pair of tungsten needles, meticulously remove the chorion from the host eggs and retrieve the pupa from within.Next, prepare a plate with 1.5%agar as substrate. Using a disinfected graver, etch several grooves on the agar. Now using a small brush, transplant a pupa from the dissected host egg into one of the grooves on the agar substrate.

Cultivo y trasplante de pupas de Trichogramma dendrolimi utilizando huevos de Corcyra cephalonica

Microinjecting dsRNA into Trichogramma dendrolimi Pupae and Monitoring Developmental Outcomes

To begin, turn on the glass needle puller, then set the heat to 280, the velocity to 170, the delay to 250, and the pole to 30. Bevel the tip of the capillary glass needle. Then using a micro injection pump, load approximately two microliters of ferritin heavy chain homology double-stranded RNA solution into the injection needle.Transfer the agar plate containing Trichogramma dendrolimi pupae onto the compound microscope stage. Carefully insert the injection needle into the abdomen of a pupa at an approximately 30 degree angle and gradually inject five nanoliters of ferritin heavy chain homology double-stranded RNA solution. Incubate approximately 700 pupae per treatment at 25 degrees Celsius for 24 or 48 hours.Extract RNA content from 100 pupae per replicate. From approximately 50 pupae per treatment, observe the wasps emergence. Finally, record the wasps emergence rate and deformity rate.T.dendrolimi pupae injected with double-stranded ferritin heavy chain homology exhibited a significantly lower emergence rate compared to those injected with double-stranded GFP or without injection. In emerged wasps, 51.85%of T.dendrolimi wasps subjected to double-stranded ferritin heavy chain homology developed deformed small wings. This deformation was absent in wasps injected with double-stranded GFP or those without any injection.Additionally, T.dendrolimi pupae injected with double-stranded ferritin heavy chain homology showed melanism, indicative of abnormal iron metabolism. The melanin was not observed in wasps injected with double-stranded GFP or those without any injection.