Bienvenidos a nuestras guías de vídeo sobre la oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. Mi nombre es Rok Ister, y este experimento tuvo lugar en el Laboratorio de Neurociencia Regenerativa de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zagreb. El método transitorio de la arteria cerebral media, o tMCAO para abreviar, es el modelo animal de accidente cerebrovascular isquémico más utilizado.
Se realiza principalmente en roedores, como ratas y ratones. Dos métodos quirúrgicos principales, la arteria carótida común y el método de la arteria carótida externa, difieren principalmente por el sitio de la arteriotomía para la inserción del filamento. En este vídeo, presentaremos nuestras modificaciones y algunos puntos clave para garantizar una reperfusión completa mediante el método de la arteria carótida externa.
A partir de las herramientas recomendadas, necesitará dos piezas de pinzas Dumont tipo 5, pinzas Dumont tipo 7 y pinzas de cierre automático Dumont tipo N0, un retractor mini-colibri y tijeras rectas de microresorte para la arteriotomía. Para la hemostasia, utilizaremos dos piezas de micropinzas vasculares juntas, con un aplicador respectivo. Las tijeras quirúrgicas, el portaagujas y las pinzas quirúrgicas se utilizarán para abrir y cerrar la herida quirúrgica.
En cuanto a los materiales, utilizaremos una sutura de monofilamento 5/0 para la herida quirúrgica y una sutura de seda trenzada 6/0 para las ligaduras de arterias, cinta quirúrgica para la fijación del animal, gel de ungüento para los ojos de los animales y gel de lidocaína para la anestesia local adicional. Por último, para drenar el exceso de sangre, utilizaremos trozos puntiagudos de una toalla de papel. Un microscopio estereoscópico es crucial para un procedimiento microquirúrgico como este.
Los roedores anestesiados son propensos a la hipotermia, por lo que utilizaremos un monitor de temperatura. En el aspecto operativo del animal, necesitará una superficie caliente y fácil de limpiar, junto con un tubo de suministro de gas anestésico y una forma de controlar de forma fiable la temperatura del animal durante el procedimiento. En la mesa de la izquierda, hay algunas herramientas y materiales más que utilizaremos.
La medición de la duración de ciertas partes del procedimiento es muy importante por razones de reproducibilidad, así como el análisis de datos más adelante. Betadine desinfectante para la piel y jeringas cargadas para un uso rápido y fácil. Cortapelos de animales para el afeitado del pelaje del animal.
Una báscula, importante para la correcta dosificación de la anestesia. Y, por último, un sistema de anestesia de gases animales capaz de administrar una mezcla de gases nitrógeno y oxígeno en una proporción de 2:1, junto con una caja de extracción para la inducción de la anestesia. Todo el manejo y los procedimientos de los animales presentados en este video fueron aprobados por el Comité de Licencias de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zagreb, y realizados por personal capacitado y autorizado. Protocolo.
Preparación del animal y del sitio quirúrgico. Coloque al animal en la mesa de operaciones calentada y lleve su nariz dentro de la máscara de anestesia. Aplique ungüentos oculares en los ojos de los animales para protegerlos de la hidratación y el uso de gas flúor.
Coloque al animal boca arriba y extienda su cuello colocando una pequeña almohada, hecha de cinta quirúrgica, debajo del cuello del animal. Asegure las extremidades del animal en su lugar con cinta quirúrgica. Tenga cuidado de no extender demasiado las extremidades delanteras, para no causar inadvertidamente una dislocación de la articulación del hombro.
Lubrique la sonda rectal con jalea blanca de petróleo e insértela en el recto para una medición continua de la temperatura corporal. Aplique una inyección preoperatoria de solución salina y buprenorfina, por vía intraperitoneal, para mantener al animal bien hidratado y sin dolor durante el procedimiento. Dé forma al pelaje del animal en la región del cuello con el cortaanimales inalámbrico.
Recoja todo el pelaje afeitado con pedazos de cinta quirúrgica. Para que el área esté completamente libre de pelo, también dé forma a la región con la navaja. Coloque un paño quirúrgico limpio sobre la mesa de operaciones.
Aplica una gota de Betadine sobre la piel afeitada del animal. Use un hisopo de algodón para frotar el desinfectante en la piel de manera circular desde adentro hacia afuera. Después, haz lo mismo con un bastoncillo de algodón empapado en etanol.
Repita este paso tres veces con un par de hisopos de algodón estériles para cada repetición. Aplique un poco de gel de lidocaína en la región desinfectada del sitio de la futura incisión para la analgesia local de la herida. Cirugía de inducción de isquemia.
Al realizar una incisión inicial en la piel desinfectada con un bisturí, mantenga el número de golpes de incisión en la piel al mínimo para facilitar la cicatrización de la herida quirúrgica. Con pinzas de tipo 7 y 5, corte la fascia superficial y separe las glándulas salivales del tejido subyacente. Coloque el retractor de alambre en su posición inicial mientras se asegura de que las glándulas salivales no se interpongan en los pasos posteriores.
Retire la fascia profunda del cuello con pinzas tipo 7 y separe los músculos esternocleidomastoideos de la región carotídea para reposicionar el retractor. Vuelva a colocar el retractor para llegar por debajo de los músculos esternocleidomastoideos para permitir el acceso a la región carotídea. Resecar el músculo omohioideo para permitir una visión clara y un enfoque más fácil de la región carotídea.
Pellizque la fascia carotídea en el lado lateral de la tríada carotídea y tire suavemente de ella lateralmente para identificar visualmente la arteria, el nervio, la vena y todas las ramas de los vasos sanguíneos circundantes. Separe completamente la parte inferior del CCA del tejido subyacente y la fascia con pinzas curvas de tipo 7, asegurándose de que esté lista para pinzar en pasos futuros. Con el CCA cuidadosamente preparado junto con sus dos ramas respectivas, levante el ECA con pinzas curvas de tipo 7 y sujételo con pinzas de cierre automático tipo N0 Con el ECA sujetado, y sujeto firmemente con pinzas de tipo N0, introduzca dos hilos de seda trenzados detrás del ECA.
Ata el hilo craneal por completo, ya que es permanente, y corta el exceso de hilo con unas tijeras. Ata el hilo caudal en un nudo de seguridad suelto. Con el uso de microclips vasculares, cierre con pinza el CCA y el ICA para evitar cualquier sangrado después de la arteriotomía.
Con unas tijeras de microresorte, haga una pequeña arteriotomía justo debajo del sitio de pinzamiento de ECA. Con un ángulo que coincida con el del ECA, inserte el filamento en el sitio de la arteriotomía en dirección proximal al CCA, pasando a través del nudo de seguridad suelto en el lado ramificado del ECA y pegándose en la luz del CCA con el filamento. Abra con cuidado el microclip ICA y retírelo.
Con el filamento parcialmente insertado en el ECA y asegurado, realice una arteriotomía completa, soltando así el muñón del ECA con el filamento MCAO en su interior. En este punto, suelte las pinzas de cierre automático tipo N0 y retírelas. Con un juego de pinzas tipo 5, pellizque firmemente el muñón ECA y levántelo ligeramente.
Mientras sujeta el filamento parcialmente insertado con otra pinza, baje y tire suavemente del muñón ECA para orientar el extremo interior del filamento hacia el ICA. Nunca pellizques la parte de silicona del filamento. Avanza lentamente el filamento MCAO a través del Círculo de Willis hasta que sientas un aumento repentino de la resistencia.
En este punto, es importante observar la longitud restante del filamento. En un ratón adulto, el filamento debe avanzar sin esfuerzo al menos siete milímetros desde el punto de ramificación ICA. Apriete el nudo de seguridad para asegurarse de que el filamento no se desplace durante el período de isquemia.
Retire la pinza CCA y tome nota de la hora, esto marca el inicio de la aparición de la isquemia. Retire el retractor de alambre y acerque los bordes de la herida quirúrgica entre sí. Deje que el sitio quirúrgico se asiente durante un par de segundos para que el tejido vuelva a su posición anatómica.
Cierre la herida quirúrgica con cierres de herida con cinta adhesiva para facilitar una reapertura más rápida de la herida después del período de isquemia. Periodo de isquemia. Validar el éxito de la cirugía mediante resonancia magnética o algún otro método cuantitativo de medición de la perfusión.
Cirugía de retirada de filamentos. Retire los cierres de heridas con cinta y vuelva a abrir la herida quirúrgica con el retractor de alambre. Con pinzas de tipo N0, pellizque y tire del borde del muñón ECA ventralmente para poner la tensión en el muñón ECA.
Vuelva a sujetar el CCA con una pinza macrovascular. Retire lentamente el filamento MCAO hasta el punto en que la parte de silicona del filamento comience a sobresalir del muñón ECA. Apriete ligeramente el nudo de seguridad para prepararse para la retirada completa del filamento.
Cuando esté cerca del extremo de silicona del filamento, apriete el nudo de seguridad de tal manera que empuje el filamento MCAO y cierre el muñón ECA en una sola maniobra. Aprieta el nudo completamente después de que el filamento se deslice. Abra y retire las pinzas de apriete junto con el clip CCA.
Sutura la herida quirúrgica, empezando por la periferia, cerrando así completamente la herida sin que se vea ningún tejido subyacente. El número de suturas necesarias depende del tamaño de la herida quirúrgica. Limpie y desinfecte el sitio quirúrgico con toallitas con alcohol isopropílico.
Resultados representativos. Después de un procedimiento exitoso, los resultados de las resonancias magnéticas deben ser similares a esto. En el intraoperatorio, durante el período de isquemia, debería poder observar una región clara con isquemia en las imágenes ponderadas de perfusión.
La lesión con coeficiente de difusión aparente debe cubrir aproximadamente la misma área. En el postoperatorio, después de la retirada del filamento, lo ideal es observar el núcleo de la lesión hiperperfundido en las imágenes ponderadas por perfusión. Con la excepción del núcleo isquémico, debería ver una recuperación y un ligero rebasamiento en los valores de ADC en la lesión.
Al segundo día después del procedimiento, la lesión debe reperfundirse por completo. Los valores de ADC deben descender de nuevo en el núcleo de la lesión isquémica debido al edema cerebral, que también debe ser visible en la imagen T2. En el caso de una hemorragia inducida por filamentos, no se observa mejoría en los mapas de perfusión o ADC en el postoperatorio.
Además, se puede observar un signo claro de hemorragia en las imágenes T2, tanto en el intraoperatorio como en el postoperatorio. Conclusión. Gracias a los recientes estudios anatómicos de la vasculatura cerebral del ratón, somos capaces de ajustar y modificar nuestro modelo MCAO en base a los nuevos conocimientos. Las arterias comunicantes posteriores, pintadas de verde, son bilateralmente permeables solo en el 10% de las cepas de ratón más utilizadas.
Por esa razón, se puede confiar en ellos para proporcionar flujo sanguíneo a las ramas proximales desde MCA. Por lo tanto, el CCA debe mantenerse permeable durante el período de isquemia, y la parte de silicio del filamento no debe exceder los tres milímetros de longitud. Esperamos haber sido informativos y concisos en este video.
Gracias por mirar.
