Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

Résumé

Nous décrivons une méthode robuste pour immunoprécipitation de la chromatine en utilisant des cellules T primaires. La méthode est fondée sur des approches standard, mais utilise un ensemble spécifique de conditions et de réactifs qui améliorent l'efficacité pour une quantité limitée de cellules. Surtout, une description détaillée de la phase d'analyse des données est présentée.

Résumé

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode largement utilisée pour déterminer les interactions entre différentes protéines avec de l'ADN en chromatine des cellules vivantes. Exemples spécifiques d'une séquence d'ADN de liaison facteurs de transcription, histones et leurs différents états de modification, les enzymes telles que les ARN polymérases et des facteurs auxiliaires, et des composants de réparation de l'ADN. En dépit de son omniprésence, il ya un manque de jusqu'à à ce jour-, les méthodes détaillées à la fois pour la préparation du banc de matériau et pour une analyse précise permettant des mesures quantitatives de l'interaction. En raison de ce manque d'information, et aussi parce que, comme tout immunoprécipitation, les conditions doivent être ré-optimisés pour les nouvelles séries de conditions expérimentales, le dosage de la puce est sensible à des résultats inexacts ou mal quantitative.

Notre protocole est finalement dérivé du travail séminal sur le facteur de transcription: interactions ADN ^1,2, mais intègre un certain nombre d'améliorations sensivité et la reproductibilité pour à obtenir difficiles types de cellules. Le protocole a été utilisé avec succès ^3,4, à la fois en utilisant qPCR de quantifier l'enrichissement de l'ADN, ou en utilisant une variante semi-quantitative du protocole ci-dessous.

Cette analyse quantitative du matériel amplifié par PCR est effectuée calcul, et représente un facteur limitant dans l'essai. Contrôles importants et d'autres facteurs incluent l'utilisation d'un anticorps isotype, ainsi que l'évaluation d'une zone de contrôle de l'ADN génomique, comme une région intergénique prévu de ne pas être lié par la protéine à l'étude (ou prévu de ne pas montrer les changements dans les conditions expérimentales). En outre, une courbe standard de matériel d'entrée pour chaque échantillon puce est utilisée pour calculer les niveaux absolus de l'enrichissement dans le matériau expérimental. Utilisation des courbes standard permet de tenir compte des différences entre les jeux d'amorces, peu importe avec quel soin ils sont conçus, et aussi l'efficacité différerrences sur toute la gamme de concentrations de modèle pour un ensemble d'amorces. Notre protocole est différent des autres qui sont disponibles en ^5-8 que nous couvrons largement la phase d'analyse ultérieure.

Protocole

1. Isolement de souris CD4 naïfs T spléniques Cells

1. Sacrifiez la souris de façon humaine compatible avec Institutional Animal Care et utilisation Comité protocoles (IACUC). Disséquer la rate et le placer dans un plat de Pétri contenant 10 ml de DMEM avec 10% de FBS.
2. Ecrasez la rate à l'aide givrés extrémités de deux lames de verre pour libérer les splénocytes. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.
3. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 xg (~ 1200 rpm pour une centrifugeuse clinique avec le diamètre de rotor) pendant 5 min à 4 ° C.
4. Remettre les cellules en 2 tampon ACK ml lyse des globules rouges, 1 min à température ambiante (RT). Arrêter la réaction en ajoutant 8 ml de DMEM avec FBS.
5. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
6. Reprendre les cellules dans 5 ml de DMEM contenant FBS et passer à travers un filtre à tamis 70 pm (BD Falcon, Cat # 352350). Compter les cellules et de procéderà l'isolement de cellules CD4 T naïfs cellules en utilisant un kit d'isolation des CD4 (Miltenyi, Cat # 130-095-248) en utilisant les instructions du fabricant. Recueillir cellules T CD4 naïfs par centrifugation à 200 g pendant 5 min à 4 ° C. Reprendre les cellules dans 10 ml de DMEM avec FBS.

2. Préparation de la chromatine

1. Ajouter 37% de formaldéhyde à une concentration finale de 1% à la suspension de cellules dans du DMEM et secouez-la délicatement à la température ambiante (par exemple en utilisant un Nutator) pendant 15 min pour réticuler l'ADN: les complexes protéiques.
2. Arrêter réticulation par addition de 1 M de glycine à une concentration finale de 125 mM. Continuez à balancer pendant 5 min à température ambiante.
3. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
4. Laver les cellules en remettant en suspension dans 5 ml de contenant des inhibiteurs de la protéase du PBS glacé. Laver en PBS inhibiteurs de protéase contenant glacées 3 fois au total et recueillir les cellules par centrifugation à 4 ° C.
5. Resuspendre les cellules dans 1 mlun tampon de lyse cellulaire glacée contenant des inhibiteurs de protéase. Incuber sur de la glace pendant 15 min. L'efficacité de la lyse cellulaire peut être déterminée par la remise en suspension une petite aliquote de cellules dans une solution de bleu trypan à 0,4% (Sigma, Cat # T8154) et en observant avec un microscope.
6. Recueillir les noyaux par centrifugation à 200 xg (typiquement ~ 1200 rpm) pendant 5 min à 4 ° C. Jetez soigneusement le surnageant.
7. Reprendre les noyaux dans 500 pi de tampon de lyse nucléaire contenant des inhibiteurs de protéase. Incuber sur de la glace pendant 15 min.
8. Soniquer les cellules en utilisant un Sonicator Misonix 3000, la sonde taille 1,6 mm: niveau de sortie 4, 15 sec rafale, 4 fois sur la glace. Chaque échantillon doit être refroidi sur la glace pendant 1-2 min avant de sonication à nouveau pour éviter la surchauffe des échantillons. La surchauffe peut provoquer le renversement de liens croisés.
9. Centrifugeuse la chromatine sonifié à 16.000 xg (~ 13,200 rpm dans une micro) pendant 5 min à 4 ° C.
10. Prendre une aliquote de 20 ul de supern clairatant, ajouter colorant de charge de l'ADN et vérifier l'ADN traité par ultrasons par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2% (taille idéale de l'ADN traité par ultrasons pour la plupart des applications est de 200-500 pb).
11. Déterminer la concentration de l'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre UV. Chromatine cisaillé peut être utilisé immédiatement pour mettre en place réaction d'immunoprécipitation de la chromatine ou conservé à -80 ° C. Typiquement, nous obtenons 7,5-10 ug d'ADN 2-3 x 10 ⁶ CD4 lymphocytes T purifiés par souris.

3. Immunoprécipitation de la chromatine (toutes les mesures doivent être effectuées à 0-4 ° C)

1. Diluer la chromatine sonifié à une concentration d'ADN de pg / ml 5-10 (volume total = 1 ml) dans un tampon de dilution ChIP avec les inhibiteurs de protéase.
2. Économisez 100 pi (10%) comme entrée. Stocker sur la glace.
3. Aliquote de 450 ul chacune en deux microtubes 1,7 ml étiquetés comme isotype contrôle (souris ou de lapin IgG) et de l'anticorps d'intérêt. Si plusieurs anticorps du même isotype sont utilisés, un seul contr isotypeol sera suffisant pour effectuer cette analyse. Vous aurez besoin de plusieurs contrôles isotypiques si les anticorps d'une source animale différente ou isotype sont utilisés.
4. Ajouter 2-5 ug d'anticorps spécifiques, en fonction de la spécificité de l'anticorps utilisé, ou le contrôle isotypique vers les tubes respectifs.
5. Basculer les tubes à l'aide d'un Nutator une nuit à 4 ° C pour permettre la formation de complexes anticorps-chromatine.
6. Ajouter 25 ul de billes magnétiques de la protéine G (1:1 suspension de billes en suspension) au mélange ci-dessus et laisser bercer pendant au moins 2 heures à 4 ° C. Perles de notre fournisseur peuvent être utilisées directement.
7. Placer les microtubes sur un support magnétique et permettent aux perles de recueillir sur le côté aimanté.
8. Retirez délicatement la solution par aspiration sans déranger les perles.
9. Ajouter 1 ml de solution faible de lavage de sel et laisser bercer doucement pendant 5 min sur un Nutator. Collecter les perles en utilisant un support magnétique et retirer la solution de lavage. Répéter une fois.
10. Ajouter 1 ml de solution de lavage haute teneur en sel et laisser bercer pendant 5 min sur un Nutator. Collecter les perles en utilisant le support magnétique et retirer la solution de lavage. Répéter une fois.
11. Ajouter 1 ml de solution de lavage de chlorure de lithium et laisser bercer pendant 5 min sur un Nutator. Collecter les perles en utilisant le support magnétique et retirer la solution de lavage. Répéter une fois. L'utilisation de LiCl améliore l'élimination efficace des interactions de la chromatine non spécifiques avec les billes.
12. Ajouter 1 ml de solution TE et laisser bercer pendant 5 min sur un Nutator. Collecter les perles en utilisant le support magnétique et retirer la solution de lavage.
13. On élue l'ADN à partir des billes en ajoutant 250 pi de tampon d'élution. Roche pendant 15 min à température ambiante. Introduire à la pipette hors de l'éluat et sauver ce matériel dans un nouveau microtube 1,7 ml. Répéter une fois de plus et de combiner les deux élutions. Jeter les perles.
14. Pour inverser les liaisons transversales ajouter 5 M de NaCl à une concentration finale de 0,3 M et 1 pl de RNase A (20 m g / ml) à l'ADN élue. Ajouter 400 pi de tampon d'élution pour les entrées sauvegardées à l'étape 3.2, pour rendre le volume 500 pi. Pour ajouter des entrées NaCl à 0,3 M, 1 pl de RNase A, 10 pl d'EDTA 0,5 M, 20 pi de Tris-HCl 1 M pH 6,5 et 1 pl de la protéinase K (20 mg / ml).
15. Incuber les tubes pendant une nuit à 65 ° C dans un bloc de chauffage à sec. Pour éviter l'évaporation des échantillons, sceau ou placez un poids sur les tubes pour les empêcher de s'ouvrir. Four à hybridation peut également être utilisé.
16. Laisser les tubes refroidir à température ambiante. Ajouter 1 ml d'éthanol à 100% et incuber 2 h-nuit à -80 ° C pour précipiter l'ADN.
17. Centrifuger les tubes à 16.000 g pendant 15 min pour obtenir un culot d'ADN. Laver le culot d'ADN fois avec 70% d'éthanol et sécher à l'air le culot. Reprendre le culot d'ADN dans 100 ul d'eau distillée stérilisée à l'autoclave.
18. Purifier l'ADN en utilisant des colonnes de centrifugation Qiaquick et sont élues dans le volume total de 50 ul de tampon d'élution. Cet ADN est prêt à être utilisé pour la PCR.

"> 4. Préparation de la réaction PCR (toutes les mesures doivent être effectuées sur glace)

1. Ramassez tous les échantillons d'ADN à partir d'échantillons d'entrée à puce et correspondant. En outre, de collecter tous les réactifs et les amorces pour la région ciblée par PCR et une région de contrôle. Utilisez un "hotstart" Taq ADN polymérase. Nous allons utiliser un dosage à base de vert SYBR de quantifier l'amplification d'ADN dans cette procédure, mais les kits mastermix qPCR peut être utilisé si nécessaire.
2. Faire une dilution en série de l'ADN d'entrée pour générer une courbe d'étalonnage pour l'analyse qPCR: par exemple 10%, 1%, 0,1% et 0,01% dans du tampon d'élution (à partir des colonnes de centrifugation QIAquick dans l'étape 3.18). La gamme de concentration et de l'accroissement de ce jeu de modèle de courbe standard peuvent varier selon les niveaux prévus de l'enrichissement à puce, etc Distribuer 10 ul d'échantillons d'ADN d'entrée dans les puits respectifs d'une plaque de 96 puits (Genemate, chat # T-3182-1 ), en double exemplaire.
3. Verser 10 ml d'ADN de puce du contrôle isotypique ainsi que anticorps spécifiques dans respectivepuits, en trois exemplaires.
4. Faites un "mélange maître" contenant soit des amorces cibles ou des amorces de contrôle (concentration finale 0,1 uM de chaque amorce) et distribuer 10 ul dans les puits respectifs. Par exemple, dans le modèle ci-dessous dispenser mélange maître contenant des amorces ciblées dans des puits marqué vert et distribuer mélange maître avec amorces de contrôle dans les puits marqués en rouge.
5. Recouvrir la plaque de PCR avec un film d'étanchéité en matière plastique optique et centrifuger à 500 xg dans une centrifugeuse clinique (~ 1200 rpm) pendant 1 min à température ambiante pour recueillir tout au fond du puits.
6. Déclencher la réaction PCR. Nous allons utiliser le LightCycler 480 II (Roche) fonctionnant LightCycler 480SW logiciel 1.5 pour exécuter la qPCR dans cet exemple.

La pré-incubation: 1 cycle: 95 ° C / 5 min.

Amplification: 40-45 cycles: 94 ° C / 5 sec, 60 ° C / 5 sec, 72 ° C/10 sec (température de recuit doit être 2-3 ° C inférieure à la temperatur de fusione des amorces).

courbe de fusion: 1 cycle.

Refroidissement: 1 cycle.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

10% d'entrée

10% d'entrée

Isotype

Spécifique

B

1% d'entrée

1% d'entrée

Isotype

Spécifique

C

0,1% d'entrée

0,1% d'entrée

Isotype

Spécifique

D

Entrée 0,01%

Entrée 0,01%

E

10% d'entrée

10% d'entrée

Isotype

Spécifique

F

1% d'entrée

1% d'entrée

Isotype

Spécifique

G

0,1% d'entrée

0,1% d'entrée

Isotype

Spécifique

H

Entrée 0,01%

Entrée 0,01%

Vert: Utilisez amorces des régions ciblées.

Rouge: Utilisez région amorces de contrôle.

5. Analyse

1. Programme du logiciel de qPCR pour la quantification de la quantité absolue d'ADN. Surtout, l'utilisation d'une courbe standard pour des montants ADN interpoler dans les échantillons spécifiques et isotype inconnus permet l'évaluation et adaptation de la qualité et l'efficacité de tous les jeux d'amorces dans la gamme de concentrations trouvées dans les échantillons. En outre, il fournit également un more méthode fiable pour convertir les valeurs Cq _(t C ou C _p) pour des résultats d'enrichissement de pliage relative finale que les procédés usingΔΔCq et connexes.
2. Aller à l'éditeur d'échantillon et marquer les puits contenant des échantillons d'entrée de différentes dilutions (10%, 1%, 0,1% et 0,01%) avec leurs valeurs de la courbe standard. Étiqueter aussi les puits avec des échantillons de puces inconnus, exactement comme la plaque PCR est aménagé. Dans le logiciel équivalent utilisé dans d'autres machines de qPCR, désigner des sous-ensembles qui correspondent à des réactions de chaque paire d'amorces, la valeur de la courbe étalon et l'échantillon de contrôle expérimental et isotype conséquence.
3. Dans le logiciel LightCycler, accédez à l'éditeur de sous-ensemble et marquer les sous-ensembles, y compris les puits avec des échantillons d'entrée ainsi que les échantillons de copeaux inconnus. Les échantillons inconnus seront quantifiées en utilisant la courbe d'étalonnage générée à partir des concentrations connues d'échantillons d'entrée pour l'analyse. Dans le logiciel équivalent utilisé dans d'autres appareils de qPCR, désigné sous-ensembles corresponding à toutes les réactions pour chacune des paires d'amorces.
4. Après l'amplification par PCR est terminée, effectuer l'analyse avec "Abs Quant/2nd dérivés Max" et sélectionnez le sous-ensemble d'analyse et appuyez sur OK. Dans le logiciel équivalent utilisé dans d'autres appareils de qPCR, convertir la valeur Cq à la quantité d'ADN dans chaque sous-ensemble.
5. Appuyez sur «Calculer» qui va générer la courbe d'étalonnage en utilisant les concentrations connues d'échantillons d'entrée et affichera la quantité absolue d'ADN présent dans les échantillons inconnus.
6. Si la qualité de l'ADN cisaillé est bonne, et si les amorces se lient spécifiquement à la région ciblée, l'efficacité PCR devrait être proche de 2.
7. Effectuer une analyse de la courbe de fusion avec "Tm Calling" pour le même sous-ensemble, si disponible. Un seul pic indique que seul un produit spécifique a été amplifié. L'amplification de l'ADN spécifique peut également être testée par électrophorèse du produit de PCR avec l'échelle d'ADN à travers un gel d'agarose.
8. Exporter des données sous forme d'onglet-fichier texte délimité, qui peut être ouvert dans Microsoft Excel pour une analyse plus approfondie.
9. Utilisation de Microsoft Excel, divisez le montant de l'ADN de l'anticorps spécifique avec le contrôle isotypique pour amorces ciblées. Répétez cette étape pour la région amorces de contrôle. Si plusieurs anticorps du même isotype sont utilisées pour différents immunoprécipitat, normaliser chacune d'entre elles avec les valeurs de la même isotype contrôle. Par ailleurs, si plusieurs couples d'amorces ciblées sont utilisées, les quantités d'ADN à partir d'une amorce contrôle unique jeu de paire doivent être utilisés pour la normalisation de chaque cible (Figures 1 et 2). Les valeurs de sortie représentent l'anticorps immuno fois enrichissement spécifique à chaque emplacement par rapport aux non-spécifique fond anticorps immuno-précipitation.
10. Diviser l'enrichissement fois (à Isotype Control) pour amorces ciblées avec l'enrichissement fois (à Isotype Control) pour la région amorces de contrôle pour obtenir un enrichissement par rapport à unrégion non reliée de commande (figure 1). Surtout, notez qu'en raison de la génération de courbes standard avec l'ADN d'entrée totale pour chaque échantillon, chacune des valeurs d'immunoprécipitation dessus interpolée à partir des courbes standards sont déjà normalisées par rapport à, et exprimé comme la fraction de l'apport total par le logiciel de la machine.
11. Si la rigueur des tampons utilisés pour l'immunoprécipitation ou lavage est trop élevé, il est possible que l'amplification robuste à partir d'échantillons immunoprécipités avec des anticorps spécifiques sera observée, tandis que l'amplification du contrôle isotype immunoprécipitait échantillons ne seront pas respectées. Dans un tel scénario, il est préférable de soustraire le montant de la puce de contrôle isotypique de puce à anticorps spécifique à la fois la région ciblée et la région non liée. Enrichissement relatif peut être calculé en divisant la différence pour la région ciblée par différence pour la région non liée (Figure 3).

Résultats

L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) protocole présenté ici contrôles des différences, le cas échéant, de la quantité d'ADN utilisée dans la PCR par l'utilisation d'une paire d'amorces qui amplifie une région non liée de génome, servant ainsi de «contrôle de chargement". Dans l'exemple illustré à la figure 3, nous avons utilisé la région codante du gène Loi de l 'souris comme une région non liée à notre protéine d'int...

Discussion

Le protocole ci-dessus fournit une méthode robuste de quantifier avec précision l'enrichissement de l'ADN des lymphocytes primaires utilisant le morceau. Une raison majeure de robustesse dans ce protocole est l'inclusion de la diversité biologique répétitions. Le protocole ci-dessus utilise trois répétitions, l'enrichissement, pour lesquels est calculé indépendamment. Les sorties sont ensuite moyennées pour fournir un degré d'enrichissement et écarts-types calculés pour fournir une mesur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Table of Equipment