Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d'Innate Immune Health chez le poisson zèbre

Résumé

La réponse immunitaire innée protège contre l'infection par des organismes pathogènes. Un élément essentiel de la réponse immunitaire innée, l'explosion respiratoire des phagocytes, génère des espèces réactives de l'oxygène qui tuent les micro-organismes envahisseurs. Nous décrivons un essai de stimulation du métabolisme oxydatif qui quantifie les espèces réactives de l'oxygène produites lors de la réponse immunitaire innée est chimiquement induite.

Résumé

La stimulation du métabolisme oxydatif des phagocytes fait partie de la réponse immunitaire innée à l'infection par des agents pathogènes et implique la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). ROS sont toxiques et fonctionne pour tuer les microorganismes phagocytées. Dans quantification in vivo de phagocyte dérivés ROS fournit des informations sur la capacité de l'organisme à une réponse immunitaire innée robuste. Ici, nous décrivons un protocole pour quantifier et comparer ROS dans embryons de poissons zèbres entiers lors de l'induction chimique de l'explosion respiratoire phagocytaire. Ce procédé fait usage d'un composé non fluorescent qui devient fluorescent lors de l'oxydation par les ROS. Embryons de poisson zèbre individuels sont déposés à la pipette dans les puits d'une microplaque et on les incube dans ce substrat fluorogène avec ou sans un inducteur chimique de la stimulation du métabolisme oxydatif. La fluorescence dans chaque puits est quantifiée à des points temporels souhaités en utilisant un lecteur de microplaque. Des lectures de fluorescence sont ajustés pour éliminer la fluorescence de fond et compared l'aide d'un test t non apparié. Cette méthode permet de comparer le potentiel de stimulation du métabolisme oxydatif des embryons de poisson zèbre à différents stades de développement et en réponse à des manipulations expérimentales telles que la protéine effet de choc, la surexpression, ou un traitement avec des agents pharmacologiques. Ce procédé peut également être utilisé pour surveiller la réponse de la stimulation du métabolisme oxydatif dans les reins disséqué entières ou des préparations de cellules de reins de poisson zèbre adulte et une autre espèce de poisson. Nous croyons que la relative simplicité et l'adaptabilité de ce protocole complètent les protocoles existants et seront d'intérêt pour les chercheurs qui cherchent à mieux comprendre la réponse immunitaire innée.

Introduction

Le système immunitaire comprend deux branches: l'immunité innée et adaptative. L'immunité innée est évolutif plus ancienne que l'immunité adaptative. Invertébrés sont actuellement pensé pour avoir seulement l'immunité innée, alors que les vertébrés possèdent deux branches innées et adaptatives. Alors que l'immunité adaptative confère une immunité spécifique et de longue durée à certains agents pathogènes, l'immunité innée est une réponse immédiate aux bactéries envahissantes, les virus et les champignons. Un aspect crucial de la réponse immunitaire innée implique la libération de cytokines et de chimiokines, ce qui entraîne l'inflammation et le recrutement des phagocytes (par exemple, les macrophages, les neutrophiles) d'engloutir et de détruire les envahisseurs étrangers.

Réponses immunitaires innées qui réussissent comprennent: (1) la reconnaissance des micro-organismes envahisseurs; (2) l'induction des cascades de signalisation appropriées (par exemple de libération de cytokines et de chimiokines), (3) le développement approprié / un nombre suffisant de cellules phagocytaires; (4) Migration des phagocytes vers les sites d'infection; (5) l'engloutissement des agents pathogènes, et (6) la destruction des micro-organismes englouti. Une carence dans l'une quelconque de ces étapes pourrait conduire à l'hôte d'être submergé par, et de succomber à, l'infection. Une réponse immunitaire innée robuste est essentiel à la santé des organismes, car elle est la première ligne de défense contre les agents pathogènes dans les plantes et les animaux. Chez les vertébrés, il potentialise également la réponse immunitaire adaptative ^1. Par conséquent, il est essentiel que nous sommes en mesure d'évaluer tous les aspects de la réponse immunitaire innée afin de mieux comprendre et d'optimiser sa fonction.

De nombreux organismes modèles sont utilisés pour étudier l'immunité innée, allant de Arabadopsis à C. elegans à la drosophile à des souris à des cellules humaines en culture. Un avantage d'utiliser le poisson zèbre (Danio rerio) du système modèle pour étudier l'immunité innée, c'est que le poisson zèbre est un vertébré, avec im innée et acquisecommunauté, mais le développement de l'immunité innée et adaptative sont temporairement séparés. Poisson zèbre se fonder uniquement sur ​​l'immunité innée pour la protection contre l'infection jusqu'à ce que l'immunité adaptative devient entièrement fonctionnel, qui se produit autour de 4-6 semaines après la fécondation ^2. En plus des outils pour la manipulation génétique, la clarté optique et développement externe rapide, l'immunité innée comme le principal mode de défense dans embryons de poissons zèbres fournit un modèle simplifié dans lequel pour étudier la complexité de la réponse immunitaire innée in vivo.

Plusieurs protocoles ont été élaborés pour évaluer différentes facettes de la réponse immunitaire innée chez les embryons de poisson zèbre. Les puces à ADN ont validé RNAseq et que les profils de cytokines induites par la réponse immunitaire innée poisson zèbre sont similaires à celui des humains et ont également suggéré l'implication de gènes inattendus dans l'immunité innée ^3,4. La transparence de l'embryon de poisson zèbre et fluorescent, transgenic souches d'agents pathogènes et de poisson zèbre pour permettre la visualisation des interactions hôte-pathogène dynamiques in vivo en temps réel. Embryons de poisson zèbre transgénique exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur spécifique de la myéloperoxydase des neutrophiles ou la ^{5,6-spécifique} des macrophages MPEG1 promoteur ⁷ ont permis de visualiser et de quantifier la migration des phagocytes à des sites d'infections localisées ⁸ ainsi que de visualiser la phagocytose et la destruction de marqué par fluorescence pathogènes ^8,9. Embryons de poisson zèbre sont également prêtent à la génération de tests à haut débit et les écrans chimiques. En conséquence, les méthodes d'analyse du transcriptome lors de l'infection ¹⁰ et migration des phagocytes à des sites de lésion induite chimiquement ¹¹ à haut débit ont récemment été mis au point.

Des techniques énumérées ci-dessus, aucun d'évaluer quantitativement l'étape finale de destruction d'agents pathogènes par les phagocytes. Cette dernière étapeimplique une salve respiratoire (c.-à-production de ROS et d'autres composés toxiques), qui tuent les agents pathogènes englouti. L'enzyme oxydase NADPH est une source majeure de ROS dans les cellules phagocytaires. L'assemblage des sous-unités des résultats d'enzyme NADPH oxydase dans le transfert d'électrons de l'oxygène, générer des anions superoxydes. Par des réactions enzymatiques suivantes, superoxyde peut ensuite être converti en peroxyde d'hydrogène et l'acide hypochloreux (Figure 1A). Il s'agit de la stimulation du métabolisme oxydatif des phagocytes qui tue les pathogènes, et donc, la quantification du potentiel de stimulation du métabolisme oxydatif des embryons de poisson zèbre est indicative de la santé globale immunitaire innée. Nous avons développé un test basé sur la fluorescence pour quantifier la salve respiratoire par groupes de ¹² embryons de poisson zèbre individuels. Ce test utilise la forme non fluorescente, la réduction d'un colorant disponible dans le commerce, la cellule-perméable. Ce colorant, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluoresceine diacétate (H2DCFDA), est converti en la fluorescencecomposé de cent, 2 ', 7'-fluorescéine (DCF), lors de l'oxydation. Les diverses ROS générés par l'éclatement respiratoire des phagocytes peuvent oxyder H2DCFDA et générer une fluorescence ^24. L'apparition de fluorescence peut être utilisée pour quantifier et comparer la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif entre les groupes de poisson-zèbre. L'agoniste de l'acétate myristate de phorbol protéine kinase C (PMA) est utilisé pour induire chimiquement la NADPH oxydase pour produire des ROS et d'augmenter ainsi des lectures de fluorescence (Figure 1B). Ici, nous fournissons un protocole détaillé d'une version modifiée et optimisée de ce dosage embryon de poisson zèbre stimulation du métabolisme oxydatif. Ce dosage peut être utilisé pour comparer la stimulation du métabolisme oxydatif entre les groupes d'embryons de poisson zèbre individuels au cours du temps et / ou en réponse à des manipulations expérimentales (par exemple morpholino knockdown médié par la protéine). L'utilisation de cette méthode, en conjonction avec d'autres tests de l'immunité innée de poisson zèbre, fournira une image plus complète du complexe et critiqueréponse immunitaire innée.

Protocole

Une. Soins poisson zèbre et d'entretien

1. Élevage: poisson zèbre adulte d'apparition de masse comme décrit précédemment ^13. Recueillir des embryons engendrés comme décrit précédemment ^14.
2. La micro-injection (si désiré): micro-injection 1-4 poisson zèbre embryons au stade de cellules avec des oligonucléotides morpholino à knockdown produits géniques ou ARNm pour surexprimer produits géniques comme décrit précédemment ^15.
   1. Maintenir un bassin suffisant de la maquette contrôles injectés (au moins 48 Résidant, maquette injecté poissons témoins et 48 vivant, poissons expérimentalement manipulé sont nécessaires pour remplir un puits de microplaques 96).
3. Maintenir embryons: Cultiver embryons dans des boîtes de Pétri profondes à 28 ° C dans l'eau d'œuf (60 pg / ml Instant Ocean sel de mer dans distillée autoclave-eau) jusqu'à ce que le stade de développement souhaité (une réponse à l'éclatement respiratoire n'est pas détectable en utilisant ce protocole dans les embryons de poisson zèbre moins de 2 jours après la fécondation ^12). Note: Il a été observed que la prévention de la pigmentation dans embryons de poissons zèbres, soit par l'utilisation de 1-phényl 2-thiourée (PTU) ou poisson zèbre mutant golden/slc24a5 ne modifie pas significativement l'induction de la fluorescence par le PMA (données non publiées, embryons testés à 48, 72 et 96 HPF).
   1. Retirer des embryons morts chaque jour avec une pipette de transfert en plastique.
   2. Décanter avec soin l'eau d'œuf vieux et reconstituer avec de l'eau nouvelle quotidienne d'oeufs.
4. Embryons Dechorionate: Le jour de l'expérience, les embryons dechorionate (si les embryons sont encore dans leurs chorions) comme décrit précédemment à l'aide de deux pinces fines ¹⁴ (cet essai d'éclatement respiratoire peut également être effectuée sur les reins disséqués de poisson zèbre adulte ¹² et protocoles détaillés pour les reins dissection de poisson zèbre adulte ont été décrits précédemment ^16,17).

2. Préparation de la solution

1. Préparer une solution stock de H2DCFDA: Peser 1 mg de H2DCFDA.
   1. Dissolve 1 mg de H2DCFDA dans 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour faire un / ml solution mère à 1 mg.
   2. Faire 22 aliquotes de cette solution mère dans 1,7 ml microtubes.
   3. Envelopper les aliquotes de solution mère H2DCFDA dans une feuille d'aluminium et laisser dans l'ignorance autant que possible parce H2DCFDA est sensible à la lumière.
   4. Aliquotes magasin H2DCFDA à -20 ° C pour un maximum de 3 mois.
2. ATTENTION - Préparer une solution mère d'acétate de phorbol myristate (PMA): Peser à 1 mg de PMA utilisant l'équipement adéquat de protection individuelle (c.-à-gants, lunettes et masque).
   1. Dissoudre PMA dans 1 ml de DMSO à faire un / ml solution mère à 1 mg.
   2. Faire 11 aliquotes de 1,7 ml dans des microtubes.
   3. aliquotes de magasins de solution stock PMA à -80 ° C pendant 3 mois.
3. Préparer une solution de travail de H2DCFDA: Le jour de l'expérience, faire une solution de travail H2DCFDA en ajoutant une solution H2DCFDA de stock 1 partie 1partie du DMSO (500 ug / ml de concentration finale H2DCFDA). Par exemple, ajouter 20 ul de solution stock H2DCFDA et 20 ul de DMSO à une feuille enroulée 1,7 ml microtube.
4. Préparer une solution de travail de PMA: Le jour de l'expérience, faire une solution de travail en ajoutant une solution PMA PMA de stock 1 partie à 49 parties nucléases eau libre (20 pg / ml de PMA de concentration finale). Par exemple, diluer 10 pi PMA solution stock dans 490 ul nucléase l'eau libre dans un tube de 1,7 ml à centrifuger.
5. Préparer une solution de dosage de H2DCFDA: Le jour de l'expérience, préparer une solution de dosage H2DCFDA avec une concentration finale de 1 pg / ml dans de l'eau H2DCFDA d'oeuf. Les volumes préparé des solutions de dosage peuvent être modifiés comme on le souhaite, mais faire en sorte que les concentrations finales des réactifs sont maintenus. Pour les reins, au lieu de l'eau de l'oeuf, en utilisant le même volume de medium/F-12 modifié de Eagle de Dulbecco (DMEM 50%, 50% de F-12, sans rouge de phénol). Pour faire 5 ml de H2DCFDAsolution de dosage, utiliser une pipette sérologique de 5 ml pour transférer 5 ml d'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) dans un tube de 15 ml à centrifuger conique enveloppée dans du papier et étiqueté «H».
   1. Retirer 10 pi d'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) de 15 ml tube conique étiqueté «H» et le jeter.
   2. Ajouter 10 ul de la solution de travail H2DCFDA dans le tube de 15 ml conique marqué «H» et vortex pour mélanger (ce volume est suffisant pour 48 embryon ou échantillons de reins (la moitié d'un plein bien microplaque 96) et ces puits seront de fournir des mesures du niveau fluorescence de fond).
6. Préparer une solution de dosage de H2DCFDA + PMA: Le jour de l'expérience, préparer une solution H2DCFDA + PMA de dosage avec des concentrations finales de: H2DCFDA - 1 pg / ml de PMA et de - 400 ng / ml. Pour faire 5 ml de solution de dosage H2DCFDA + PMA, utiliser une pipette sérologique de 5 ml pour transférer 5 ml d'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) dans un nouveau tube de 15 ml conique marqué «H + P '.
   1. Retirer 110 _6; l d'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) de 15 ml tube conique étiqueté «H + P 'et le jeter.
   2. Ajouter 10 ul de la solution de travail H2DCFDA, puis ajouter 100 ul de solution de travail PMA dans le tube de 15 ml conique étiqueté «H + P 'et vortex pour mélanger (ce volume est suffisant pour 48 échantillons ou l'autre moitié d'une pleine et microplaques 96 ).
7. Conserver les solutions de dosage sur la glace.

3. Programmation microplaque Reader

1. Préparer l'appareil: alimentation sur le lecteur de microplaques.
   1. Réchauffez la source de lumière.
   2. Mettre en place un programme de lecture de fluorescence: par exemple excitation: 485 nm; émission: 528 nm; Optique Position: top 510 nm; Sensibilité: 65, avec une étape en secouant 5 sec avant la lecture.

4. 96 Eh bien microplaques Set Up (voir la figure 2)

1. Rassembler les fournitures: Obtenir des plats avec des embryons dechorionated, noir 96 puits de microplaques, p200 pipette etconseils, seau à glace avec H2DCFDA et solutions de dosage H2DCFDA + PMA, multicanal p200 pipette, deux réservoirs stériles, une feuille d'aluminium, et des ciseaux.
2. Transfert d'un embryon dans chaque puits d'une microplaque à 96 puits: Utilisez des ciseaux pour couper une pointe de pipette tels que les embryons ou les reins ajustement à travers l'ouverture.
   1. Définir une pipette p200 à 100 pi et de transférer un embryon avec l'eau d'œuf (ou DMEM/F-12) en autant de puits d'une microplaque de 96 puits noire comme vous le souhaitez (il n'est pas nécessaire de changer l'embout de pipette pour chaque différente échantillon de l'embryon dans une condition expérimentale, mais il peut être nécessaire de changer de conseils entre les conditions expérimentales). Soyez sûr d'éviter le transfert chorions résiduelles, que ceux-ci ont tendance à fausser les données recueillies. Pour le transfert de reins, un volume plus grand pipette (fixée à 100 pi) peut être utilisé et embouts de pipette peut être coupé pour obtenir une taille de plus gros calibre, si nécessaire. Il peut être nécessaire d'incorporer des puits sans échantillons d'embryons ou des reins, mais avecles solutions de dosage pour contrôler quelques manipulations expérimentales.
3. Ajouter solutions de dosage: Verser la solution de dosage H2DCFDA dans une aiguille stérile de 25 ml réservoir.
   1. Utilisez un p200 pipette multicanaux et huit conseils pour pipette simultanément 100 pi de solution de dosage H2DCFDA dans une colonne sur le bien microplaque 96 (500 concentration finale ng / ml de H2DCFDA).
   2. Répétez cette (changement de conseils n'est pas nécessaire) pour autant de colonnes que désiré (généralement six colonnes ou 48 puits si le remplissage toute une microplaque à 96 puits). Ajouter cette solution à la moitié des échantillons d'embryons de commande et la moitié des échantillons d'embryons expérimentalement manipulés (par exemple, 96 puits de microplaque mis en place est représenté sur la figure 2, ces puits (couleur orange) fournira des données de fluorescence d'arrière-plan dans les échantillons non induites par le PMA) .
   3. Verser la solution de dosage H2DCFDA + PMA en un nouveau réservoir de 25 ml, stérile.
   4. Utilisez un p200 pipette multicanaux et huit conseils pour SIMULTpipeter aneously 100 ul de solution de dosage H2DCFDA + PMA dans les colonnes restantes (de couleur rouge sur la figure 2) du puits de microplaque 96 (changement de conseil n'est pas nécessaire, des concentrations finales de H2DCFDA-500 ng / ml et PMA-200 ng / ml) .
4. Recouvrir la plaque avec une feuille d'aluminium.
5. Agiter la microplaque pendant environ 20 secondes à 150 tours par minute pour homogénéiser les solutions dans chaque puits.
6. Incuber la microplaque à 28 ° C quand il n'est pas en cours de lecture.

5. Fluorescence Quantification

1. Lire la microplaque au temps = 0 h après l'addition de PMA en utilisant les paramètres décrits dans l'étape 3.1.2.
   1. Continuer à prendre des mesures toutes les quelques minutes pour l'intervalle de temps désiré ou incuber la microplaque feuille enroulée à 28 ° C jusqu'à un point de temps plus tard, puis prendre une mesure de point final à une heure (par exemple 4 heures après l'addition de PMA).
2. Utilisez un plastique transfert pipette pour récupérer les embryons à partir des puits.
3. Euthanasier les embryons en fonction de votre soin des animaux et le protocole d'utilisation, par exemple immersion dans tricaine MS222.
4. Disposer de la microplaque et autres matériaux jetables dans le conteneur de déchets biologiques.

6. Analyse des données

1. Décider sur le point d'heure à laquelle vous souhaitez comparer les valeurs de fluorescence (par exemple 4 h après l'addition de PMA, tableau 1).
2. Soustraire la valeur de fluorescence de la moyenne non induite par le groupe de contrôle à partir des valeurs de fluorescence de l'individu induite par le PMA contrôle groupe.
3. Répétez cette opération pour le groupe expérimental avec et sans PMA.
4. Conserver les valeurs de fluorescence normalisés en deux colonnes, le contrôle + groupe PMA et le groupe expérimental + PMA (tableau 2).
5. Calculer les moyens et les écarts types pour les valeurs de fluorescence normalisés de la commande + PMA group et le groupe + de PMA expérimental.
6. Comparez les valeurs de fluorescence normalisés en utilisant un test t apparié pour déterminer la signification statistique (tableau 2).
7. Graphique des moyens de contrôle + groupe PMA et le groupe expérimental PMA + avec des barres d'erreur reflétant les écarts-types appropriées.
8. Noter le niveau d'importance sur le graphique et dans la légende de la figure (Figure 2).

Résultats

Ici, nous fournissons des données comparant la réponse à l'éclatement respiratoire dans embryons de poissons zèbres (de type sauvage, AB fond) à 48 et 72 heures après la fécondation (HPF). Les 48 embryons de HPF agi comme notre groupe de contrôle et les 72 HPF embryons que notre groupe expérimental. La taille de l'échantillon utilisé était de 24 embryons induite Nations unies et les 24 embryons PMA-induites par stade de développement. Lectures de fluorescence brutes (en unités relatives de fluores...

Discussion

La fonction principale des phagocytes est de détecter, engloutir, et détruire les agents pathogènes. La capacité des phagocytes pour produire une explosion respiratoire adéquate est essentielle pour cette fonction. Ainsi, la quantification de la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif est une méthode pour permettre la comparaison de la santé générale immunitaire innée et la fonction entre des groupes d'individus et / ou en réponse à des manipulations expérimentales. Ici, nous décrivons un prot...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478