Un protocole pour l'analyse de l'hépatite C de réplication

Résumé

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Résumé

L'hépatite C (VHC) affecte 3% de la population du monde et provoque des maladies graves du foie comme l'hépatite chronique, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Le VHC est un virus à ARN enveloppé de la famille des Flaviviridae. Le traitement actuel n'est pas pleinement efficace et provoque des effets secondaires indésirables. Il n'ya pas de vaccin disponible VHC. Ainsi, la poursuite des efforts est nécessaire pour développer un vaccin et une meilleure thérapie. Un système de culture cellulaire du VHC est essentielle pour l'étude des diverses étapes de la croissance de VHC, y compris l'entrée virale, la réplication du génome, à l'emballage, et la sortie. Dans la procédure actuelle présentée, nous avons utilisé un virus de type sauvage intragenotype 2a chimérique, FNX-VHC, et un virus recombinant FNX-Rluc portant un gène rapporteur de la luciférase Renilla pour étudier la réplication du virus. Une lignée cellulaire d'hépatome humain (Huh-7 repose) a été utilisé pour la transfection in vitro de transcrits ARN génomiques du VHC. Surnageants de culture sans cellules, des lysats de protéines et total ARN ont été récoltés à divers moments post-transfection pour évaluer la croissance du VHC. Génome HCV état de réplication a été évaluée par RT-PCR quantitative et la visualisation de la présence de HCV ARN double brin. L'expression de la protéine du VHC a été vérifiée par blot et immunofluorescence dosages Western en utilisant des anticorps spécifiques des protéines du VHC NS3 et NS5A. les cellules transfectées de l'ARN du VHC libérés des particules infectieuses dans le surnageant de culture et le titre viral a été mesuré. dosages de la luciférase ont été utilisées pour évaluer le niveau de réplication et l'infectiosité de reporter le VHC. En conclusion, nous présentons diverses analyses virologiques pour caractériser les différentes étapes du cycle de réplication du VHC.

Introduction

L'hépatite C (VHC) provoque une cirrhose et un cancer du foie. Elle touche 170 millions de personnes dans le monde avec 350 000 personnes meurent chaque année ^1-3. Le VHC est un virus à ARN à brin positif ayant une taille de génome de 9,6 kb. Le génome du VHC est traduit en une seule polyprotéine de ~ 3000 résidus d'acides aminés qui est clivée de manière protéolytique par diverses proteases cellulaires et virales en 10 polypeptides. Le VHC est le virus prototype du genre Hepacivirus et appartient à la famille des Flaviviridae ^4. Lors de l'exposition, le VHC établit une infection chronique chez 80% des individus. L'infection est souvent asymptomatique et en temps opportun diagnostic peut permettre une intervention thérapeutique pour prévenir la détérioration du foie. Le traitement actuel est sous-optimale et aucun vaccin n'est disponible ^5,6.

L'étiologie de l'hépatite C a été décrite pour la première en 1989 ^7. Etudier la réplication du VHC est important pour l'hépatite C vaccin et la recherche de traitement, mais il avait étélongue entravée par l'absence d'un système de culture virale efficace. Un clone moléculaire du VHC a été montré pour être infectieux chez les chimpanzés sur inoculation intrahépatique ^8. Par la suite, des réplicons du VHC sub-génomiques ont été décrites, qui ont permis de disséquer l'étape de réplication du génome viral dans un système de ^9,10 de la culture cellulaire. Découverte d'un VHC de génotype 2a isoler JFH-1 (hépatite fulminante-1 japonais), capable d'infecter la culture cellulaire a ouvert de nouvelles voies pour la recherche de la réplication du VHC ^11-13. Souche de génotype 2a JFH-1 des systèmes de culture à base infectieuses basé virus chimériques inter-et intra-génotypiques et VHC de génotype 1 sont disponibles ainsi ^14-18.

Nous avons utilisé avec succès JFH-1 et le VHC souche intragenotype 2a virus chimère pour obtenir la haute résolution profilage fonctionnelle carte de domaines protéiques et éléments agissant en cis d'ARN ^19,20. Selon cette étude, nous décrivons ici un système de culture efficace couramment utilisé qui permetl'étude de différentes étapes du cycle de replication du VHC et de l'interaction hôte-pathogène. Nous présentons des tests virologiques pour évaluer la réplication du génome viral et de l'infectiosité de novo intragenotype 2a du VHC et un VHC de journaliste en Renilla.

Protocole

Un schéma général du protocole est illustré sur la figure 1.

Une. Cells

1. Préparer un milieu de croissance complet qui contient 10 à 15% de sérum bovin fœtal (FBS), 10 mM acides aminés non essentiels, Hepes 10 mM, de la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 mg / ml), et 2 mM de L-glutamine.
2. Maintenir les cellules Huh-7.5.1 ¹³ dans du milieu complet de croissance contenant les suppléments ci-dessus pour l'analyse in vitro de l'hépatite C du cycle de réplication virale.
3. Culture souches virales en Huh-7.5.1 cellules avec le milieu de croissance complété spécifiée à 37 ° C avec 5% de CO _2.

2. Virus et constructions plasmidiques

1. Générer l'ADN complémentaire (ADNc) de l'ARN du VHC forme et le cloner dans un vecteur plasmidique pour la facilité de la manipulation génétique. Remarque: La découverte de l'hépatite fulminante japonais 1, JFH-1 (génotype 2a du VHC), isolat a été critique pour la recherche sur le VHC et estprincipalement utilisé pour étudier le cycle de ^{11 à 13} de la replication du VHC. Virus chimériques inter et intragénotypiques sur la base de JFH-1 du VHC sont couramment utilisés dans la recherche ^{de 14 à 18.} Construction de synthèse intragenotype 2a virus chimérique, FNX-VHC, et une souche rapporteur chimérique monocistronique a été décrit précédemment ¹⁹ et détails de construction sont au-delà du champ d'application de ce protocole.
2. Utilisez le virus pFNX-VHC intragenotype 2a, car il contient un 5'NTR, les régions et p7 structurelles, et une partie des régions non structurales NS2 (nucléotides 1 à 2878) de la souche parentale J6CF (NCBI accession no. AF177036), comme ainsi que les éléments non structuraux du JFH-1 souche virale (NCBI de no. AB047639). Remarque: FNX-HCV a été synthétisé sur la base de la séquence de HCV 2a Jc1 intragenotype chimérique signalé précédemment ^15.
3. Générer un reporter chimérique construction virale monocistronique, la pFNX-Rluc, sur la base de la souche HCV-pFNX (ci-dessus à l'étape 2.2) par insertion d'un Rgène de la luciférase enilla entre l'extrémité 5 'NTR et le gène de la partie centrale (entre les nt 388 et 389). Ensuite, branchez le gène de la luciférase et le gène de base de cette construction en utilisant un virus de la maladie 2A de la fièvre aphteuse (F2A) de la séquence peptidique, qui fonctionnerait comme un signal de clivage.
4. Ingénieur de l'ARN polymérase nul (Pol-) construction virale en utilisant soit le pFNX-VHC ou le pFNX-Rluc fond virale. Remplacer les polymérase NS5B résidus catalytiques, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), de l'un de ces squelettes virales avec des résidus d'acides aminés AAG.

3. L'ARN du VHC in vitro de transcription

1. Utiliser un virus chimérique intragenotype 2a FNX-VHC et FNX-VHC Pol null (Pol-) pour le VHC évaluation de la replication virale (Figure 2A).
2. Linéariser les plasmides viraux avec l'enzyme de restriction XbaI, puis traiter avec la nucléase de haricot mungo à générer des extrémités franches. Purifier les plasmides digérés par chromatographie échangeuse d'anions. Vérifier l'intégrité of le plasmide linéarisé en soumettant l'ADN à une électrophorèse sur gel d'agarose (figure 2B).
3. Transcrire les plasmides viraux linéarisées en utilisant la polymérase ARN-T7.
4. Purifier l'ARN traité à la DNase nouvellement synthétisé en utilisant un kit de purification d'ARN.
5. Vérifiez la production d'ARN par électrophorèse sur gel d'agarose (figure 2C).
6. Quantifier l'ARN par spectrophotométrie.
7. Stocker l'ARN généré en -80 ° C à 10 pg aliquotes de travail. Remarque: Pour réduire au minimum la variation de la qualité de l'ARN à l'intérieur de chaque plan d'expérience en transcrivant tout l'ARN de chaque échantillon et témoin viral dans le même temps.

4. L'ARN du VHC transfection et prélèvement d'échantillons

1. Récolter les cellules Huh-7.5.1 en utilisant la trypsine.
2. Pour rincer les cellules, centrifugeuse et remettre la suspension à deux reprises avec les médias froid sérique bas. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de sérum faible à 1 x 10 ⁷ cellules par ml.
3. Mélanger un total de 10 & #956; g d'ARN viral transcrit avec 400 ul de cellules remises en suspension (4 x 10 ⁶ cellules) dans une cuvette d'électroporation de 0,4 cm de large. Transfecter les cellules par électroporation à 270 V, 100 Ω, et 950 pF.
4. Remettre en suspension les cellules par électroporation dans 10 ml de milieux de culture avec 15% de FBS. Remarque: Augmentation de la capacité de survie des cellules par électroporation est observée lorsque les cellules Huh-7.5.1 ont été cultivées dans 15% de sérum bovin fœtal.
5. Plaquer les cellules dans les deux flacons T-25 (1,2 x 10 ~ ⁶ cellules par flacon) et des plaques de 48 puits (1 x 10 ⁴ cellules par puits) pour chacun des points de temps suivants: 4, 48 et 96 h.
6. Remplacez le support à 4-8 heures après la transfection avec les médias frais de croissance supplémenté avec 10% de FBS pour enlever les débris de cellules mortes des flacons et des plaques de culture.
7. Les surnageants de culture de cellules de récolte à la 48, 96 points de temps d'heure et éliminer les débris cellulaires à partir d'échantillons recueillis par centrifugation des cellules à 1500 rpm pendant 10 min à 4 º C.
8. Conserver les surnageants acellulaires à -80 º C. Lyser les cellules pour la protéine et l'analyse d'ARN par transfert de Western et inverse-PCR quantitative transcription au niveau des points de temps indiqués.

5. Transcription inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) pour l'évaluation des copies VHC génomique

1. Effectuer un deux-étape de RT-qPCR pour déterminer la génomique nombre de copies d'ARN du VHC.
2. Transcrire inverse 1 pg d'ARN cellulaire total en utilisant la transcriptase inverse et une amorce spécifique du VHC brin sens qui se lie à 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') ou une amorce spécifique de gène de ménage peptidylprolyl isomérase G (R ppig : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Inverser aussi transcrire FNX-ARN du VHC (généré à l'étape 3) de copies du génome connus ⁽¹⁰ janvier-10 septembre étalon) de VHC brin sens primaire.
3. Effectuer qPCR en utilisant 50 ng de l'ADNc transcrit résultant en utilisant des amorces spécifiques du VHC (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') et liaison à l'ADN colorant vert contenant qPCR superbe mélange. Effectuer qPCR pour le ménage gène ppig ainsi (amorces ppig F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; ppig R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Remarque: Pour le calcul du niveau de l'ARN du VHC intracellulaire précise à travers des échantillons, utiliser gène de ménage cellulaire, ppig , le niveau d'expression (le cycle Ct) pour la normalisation. Utilisez le nombre de copies du génome FNX-VHC comme la norme pour la détermination du nombre de copies.
4. Utiliser les conditions suivantes lors de l'exécution qPCR pour déterminer le nombre de copies d'ARN du VHC: 95 º C pendant 15 secondes et 60   º C pendant 30 secondes (40 cycles) en utilisant le système de PCR en temps réel.
5. Voir les figures 3A et 3B pour des résultats de réplication du génome.

6. Western Blot L'analyse pour la détection du VHC Protein Expression (figure 3C)

1. Utilisez lysats cellulaires frARN viral om transfectées à 96 heures après transfection de protéines analyse western blot.
2. Résoudre le lysat cellulaire en utilisant une SDS-PAGE et transfert de polyfluorure de vinylidène (PVDF).
3. Bloquer la membrane en utilisant une solution de blocage contenant 5% de lait écrémé, 0,2% de Tween 20 dans du tampon phosphate salin (PBS).
4. Incuber la membrane avec l'anticorps monoclonal de souris primaire NS3 (une dilution à 1 000) et de la bêta-actine (une dilution à 5000).
5. Ajouter IgG de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (1 en 5000 dilution) et de détecter par chimiluminescence.

7. Immunofluorescence (IFA)

1. Fixer les cellules infectées par le VHC et transfectées avec du méthanol pendant 30 min à -20 ° C pour immunofluorescence.
2. Laver la cellule avec du PBS à trois reprises et bloquer avec IFA tampon de blocage.
3. Utilisez polyclonaux de lapin anti-NS5A principalement anticorps (aimablement fourni par le Dr Dasgupta, UCLA) ou monoclonal de souris anti-DSRNA J2 anticorps à une dilution de 1:200 (1 pg / ml) et incuber pendant 5 heures à une nuit à 4 º C.
4. Laver les cellules avec du PBS à trois reprises après l'anticorps primaire.
5. Ajouter de chèvre anti-IgG de lapin-488 ou l'anticorps de chèvre anti-IgG de souris-594 anticorps polyclonal secondaire à une dilution de 1:1000 (1 pg / ml) polyclonal secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
6. Laver les cellules avec du PBS trois fois et les noyaux des taches à l'aide de colorant Hoechst et vue en utilisant un microscope fluorescent (figure 3D).

8. Mesure Virus Titer

1. Plate naïfs cellules Huh-7.5.1 à environ 3 x 10 ³ cellules / puits en utilisant une plaque de 96 puits. Le lendemain, effectuer des dilutions en série de 10 fois de surnageant de culture sans cellules récoltées à partir de cellules transfectées avec de l'ARN du VHC en utilisant des milieux de croissance et inoculer en triple sur les cellules Huh-7.5.1.
2. Fixer les cellules à 72 heures après l'infection en utilisant du méthanol (pendant 30 min à -20 º C) et immunomarquage pour le VHC protéine NS5A comme indiqué dans la section 7.
3. Utilisez la plus forte dilution de compter pour les foyers positif NS5A et calculer le nombre moyen de se concentrer unité de formation (FFU) par millilitre. Voir Figure 4 pour le VHC titre.

9. Renilla Reporter Essai de génome viral de réplication et de l'infectiosité

1. Pour l'évaluation de la réplication du génome viral, l'ARN du VHC-plaque électroporation des cellules Huh-7.5.1, en ​​triple exemplaire dans des plaques de 48 puits (1 x 10 ⁴ cellules / puits).
2. Lyse des cellules avec 75 ul de tampon de lyse passive au 6 h, 48 h et 96 h post-transfection.
3. Basculez les plaques doucement pendant 15 min à température ambiante et conserver à -80 ° C.
4. Pour mesurer l'activité enzymatique de la luciférase de Renilla, décongeler le lysat de protéine luciférase de Renilla et les réactifs de dosage à la température ambiante.
5. Ajouter 20 ul de lysat de protéine par puits d'une 96-wel l plaque de luminescence blanche et placer la plaque dans un luminomètre.
6. Distribuer 100 ul de Renilla réactif de dosage (coelentérazine substrat + tampon) par puits et après un délai pré-lire 2 sec; intégrer la lumière émise pendant 10 secondes.
7. Calculer la moyenne et l'écart type pour chaque échantillon à partir des valeurs de luciférase de triplicats biologiques et soumettre les données à l'analyse statistique (figure 5).
8. Pour évaluer l'infectiosité, inoculer 500 pi de surnageant acellulaire obtenus à partir de cellules transfectées ARN VHC pour les points de temps indiqués (48 h et 96 h), en trois exemplaires sur naïfs cellules Huh-7.5.1 dans des plaques à 48 puits.
9. Remplacer l'inoculum viral avec 500 pi de milieu frais par puits après 6 heures après l'infection.
10. Lyse des cellules à 48 heures après l'infection et sous réserve de Renilla dosage de la luciférase comme décrit dans les étapes 08.02 à 08.07 (figure 5).

itre ". Analyse statistique> 10

1. Les barres d'erreur dans les graphiques indiquent les écarts-types (SD). Les valeurs de p ont été calculées par le test t non apparié.

Résultats

Virus de l'hépatite C est un virus à ARN. Ainsi, à des fins de manipulation génétique, l'ADNc génomique du VHC a été cloné dans un vecteur plasmidique bactérien. Une séquence de promoteur de l'ARN polymerase T7 a été introduit juste avant l'extrémité 5 'du génome de HCV. Un schéma général de l'analyse du HCV flux de travail est présentée en figure 1. Pour générer l'ARN génomique du VHC avec précision l'extrémité 3 ', le génome du VHC conten...

Discussion

Cette illustration décrit un procédé d'analyse du cycle de réplication du virus de l'hépatite C. VHC est un agent pathogène humain et le protocole sur la biosécurité prescrit devra être strictement suivies. Les systèmes de culture de cellules de VHC infectieuses ont été décrites précédemment ^11-13,16,17. Il ya quelques points essentiels nous mettons en œuvre en suivant le protocole illustré. Premièrement, il est d'une grande importance d'avoir une bonne qualité de l'ARN ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Non essential amino acid	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)	Cedars-Sinai Medical Center		The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.
XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145S
Mung Bean Nuclease	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF membrane package	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]	Abcam	ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents	GE Healthcare Life Sciences	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 real-time PCR system	Life Technologies	NA
Renilla Luciferase Assay System kit	Promega	E2810
RNase-Free DNase	Promega	M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)	Promega