Enregistrement Gamma Band Oscillations dans pédonculopontin Nucleus Neurones

Résumé

Le noyau pédonculopontin (PPN) est situé dans le tronc cérébral et ses neurones sont au maximum activé lors d'éveil et de mouvements oculaires rapides (REM) cerveau de sommeil états. Cet ouvrage décrit l'approche expérimentale pour enregistrer in vitro bande gamma oscillation de la membrane subliminale dans les neurones PPN.

Résumé

Efférents synaptiques de la PPN sont connus pour moduler l'activité neuronale de plusieurs régions thalamiques intralaminaires (par exemple, le centrolateral / parafasciculaire; Cl / Pf noyau). L'activation soit du PPN ou noyaux Cl / Pf in vivo a été décrite pour induire l'éveil de l'animal et une augmentation de l'activité de la bande gamma dans l'électroencéphalogramme corticale (EEG). Les mécanismes cellulaires pour la production d'oscillations de la bande gamma à système d'activation réticulaire (RAS) neurones sont les mêmes que ceux trouvés pour générer gamma oscillations de la bande dans d'autres cerveaux noyaux. Pendant l'enregistrement courant clamp de neurones PPN (provenant parasagittales tranches de 9-25 jours d'âge des rats), l'utilisation de dépolarisation étapes carrés activée rapidement les canaux potassiques voltage-dépendants qui ont empêché les neurones PPN d'être dépolarisée au-delà de -25 mV.

Injecter 1 - 2 sec dépolarisants à long rampes actuelles progressivement dépolarisée PPN membranaires res potentielsting valeurs vers 0 mV. Cependant, l'injection de dépolarisation des impulsions carrées générées oscillations gamma-bande du potentiel de membrane qui ont montré à être plus petite en amplitude par rapport aux oscillations produites par des rampes. Toutes les expériences ont été réalisées en présence des canaux sodiques voltage-dépendants et rapide des récepteurs synaptiques bloquants. Il a été démontré que l'activation des canaux calciques voltage-dépendants à seuil élevé sous-tendent l'activité de la gamma-bande oscillatoire dans les neurones PPN. Interventions méthodologiques et pharmacologiques spécifiques sont décrites ici, en fournissant les outils nécessaires pour induire et maintenir PPN subliminale bande gamma oscillation in vitro.

Introduction

PPN noyau est anatomiquement inclus dans le tegmentum mésencéphalique caudale. Le PPN est une composante clé de la RAS ^1. Le PPN participe au maintien des états activés de comportement (c. -à- veille, le sommeil paradoxal) ^2. La stimulation électrique du PPN in vivo induite par oscillation rapide (20 - 40 Hz) dans l'EEG cortical ^3, tandis que les lésions bilatérales PPN chez le rat réduit ou éliminé le sommeil paradoxal ^4. Alors que la majorité des neurones PPN feu potentiels d'action à la fréquence bêta / gamma-bande (20 - 80 Hz), certains neurones ont présenté des taux de décharge spontanée faible (<10 Hz) ^5. En outre, le PPN semble être impliqué dans d' autres aspects du comportement tels que la motivation et l' attention ^6. Haute fréquence directe (40 - 60 Hz) ⁷ stimulation électrique du PPN noyau chez les animaux décérébrés peut favoriser la locomotion. Ces dernières années, la stimulation cérébrale profonde (DBS) de PPN a été utilisé pour traiter les patients souffrant from troubles impliquant des déficits de la marche tels que la maladie (PD) ⁸ Parkinson.

Les rapports précédents ont montré que presque tous les neurones PPN peuvent tirer des potentiels d'action au gamma fréquence de la bande lorsque dépolarisée en utilisant des impulsions de courant ⁹ carrés. En raison de l'activation drastique des canaux potassiques voltage-dépendants lors des impulsions carrées dépolarisations jusqu'à ou sous -25 mV. En conséquence, aucune oscillation gamma solides ont été observées après le blocage de la génération de potentiels d'action en utilisant ¹⁰ la tétrodotoxine. Dans un effort pour contourner un tel problème, 1 - 2 sec dépolarisants à long rampes actuelles ont été utilisés. Dépolarisées rampes progressivement le potentiel de membrane de repos des valeurs allant jusqu'à 0 mV, tandis que inactivant partiellement les canaux potassiques voltage-dépendants. Effacer les oscillations de la membrane de la bande gamma étaient évidents dans la fenêtre de la dépendance de la tension des canaux calciques seuil haut (entre -25 mV et -0 mV) ^10. En conclusion, la bande gamma activity a été observée dans les neurones PPN ^9, et les deux P / Q- et les canaux calciques voltage-dépendants de type N doivent être activés afin de générer des oscillations de la bande gamma dans le PPN ^10.

Une série d'études a déterminé l'emplacement des canaux calciques seuil haut dans les neurones PPN. Injecter la combinaison de colorants, l' imagerie de fluorescence ratiométrique a montré des transitoires de calcium par les canaux calciques voltage-dépendants qui sont activés dans différents dendrites lorsque dépolarisée en utilisant des rampes de courant ^11.

Les propriétés intrinsèques des neurones PPN ont été proposées pour permettre l'activation simultanée de ces cellules pendant l'éveil et le sommeil paradoxal, induisant ainsi à haute fréquence oscillatoire activité neuronale entre la RAS et les boucles thalamocorticales. Cette interaction de longue portée est considérée pour soutenir un état ​​du cerveau capable d'évaluer de manière fiable le monde autour de nous sur une base continue ^12. Ici, nous décrivons l'expérienceconditions al nécessaires pour générer et maintenir gamma bande oscillation dans les cellules PPN in vitro. Ce protocole n'a pas été décrit précédemment, et aiderait un certain nombre de groupes pour étudier les propriétés des membranes intrinsèques responsables de l'activité de la bande gamma à d'autres zones du cerveau. En outre, les mesures actuelles pourraient conduire à la conclusion erronée que l'activité de la bande gamma ne peut être générée dans ces cellules.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales (nombre Protocole # 3593) et sont en accord avec les National Institutes of Health des lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation du liquide céphalo-rachidien Standard-artificielle (LCRa)

1. Préparation de Stock Solution A
   1. Ajouter 700 ml d'eau distillée à un propre 1 bêcher avant d'ajouter des produits chimiques.
   2. Tout en agitant en continu d' un volume de 500 ml, ajouter 136,75 g de NaCl, 6,99 g de KCl, 2,89 g de _MgSO4 et 2,83 g de NaH ₂ PO _4.
   3. Ajouter de l' eau distillée de plus pour atteindre un volume final de 1 L. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 117 mM de NaCl, 4,69 mM de KCl, 1,2 mM _MgSO4 et 1,18 mM de NaH ₂ PO _4.
   4. Garder au réfrigérateur à 4 ° C pendant 2 semaines.
2. Préparation de la solution mère B
   1. Ajouter 700 ml d'eau distillée dans un bécher de 1L propre avant d'ajouter des produits chimiques.
   2. Tout en agitant en continu d' un volume de 500 ml, ajouter 41,45 g de D-glucose et 41,84 g de NaHCO _3.
   3. Ajouter de l' eau distillée de plus pour atteindre un volume final de 1 L. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 11,5 mM de D-glucose et 24,9 mM NaHCO _3.
   4. Garder au réfrigérateur à 4 ° C pendant 2 semaines.
   5. Avant chaque mélange d'expérience de 50 ml de bouillon A avec 50 ml de B et porter à 1 L avec de l' eau distillée pour obtenir la solution finale concentration ACSF et de laisser à la température ambiante tout en continu oxygénant avec carbogène (95% O ₂ - 5% de CO ₂ mix) pendant au moins 30 min. La préparation finale de la concentration LCRa seulement au début de chaque expérience et le jeter à la fin de la journée.

2. Préparation du liquide céphalo-rachidien sucrose-artificielle(Saccharose- aCSF)

1. Préparation de la solution mère C
   1. Ajouter 700 ml d'eau distillée à un propre 1 bêcher avant d'ajouter des produits chimiques.
   2. Tout en agitant en continu 500 ml d'eau distillée, ajouter 240 g de saccharose, 6,55 g de NaHCO _3, 0,671 g de KCl, 4,88 g de _MgCl2, 0,22 g de CaCl ₂ et 0,21 g d'acide ascorbique.
   3. Rajouter de l' eau distillée pour parvenir à un volume final de 1 L. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 701.1 mM de saccharose, 78 mM de NaHCO _3, 9 mM de KCl, 24 mM MgCl _2, CaCl 1,5 mM d' acide ascorbique ₂ et 1,2 mM .
   4. Gardez solution mère C à 4 ° C pendant une semaine.
   5. Avant chaque mélange d'expérience 300 ml de 50 ml de bouillon C avec 600 ml d' eau distillée pour obtenir la solution de saccharose-LCRa à la concentration finale et de laisser à la température ambiante tout en continu oxygénant avec carbogène (95% O ₂ - 5% de CO ₂ mix) pendant au moins 30 min.

3. Slice Préparation

1. Placer un récipient propre avec 100 ml de solution de saccharose LCRa dans de la glace tout en oxygénant carbogène et fixer le pH à 7,4 en utilisant un pH-mètre, tout en ajoutant quelques gouttes d'une solution 0,1 M de NaOH (lorsque le pH <7,4) ou d'une solution 0,1 M de HCl (lorsque pH> 7,4).
2. Remplir une chambre de coupe d'un vibratome avec du saccharose-LCRa et oxygéner. Allumez le système de réfrigération à base de glycérol couplé à la chambre de coupe et attendre 15 min pour lui permettre de refroidir à 0 - 4 ° C.
3. Anesthetize bébés rats (âgés de 9 à 12 de l' adulte de rats Sprague-Dawley chronométré enceintes) avec kétamine (70 mg / kg, ip, en utilisant <50 ul de volume final). Lorsque chiot est calme, double vérifier que la queue pincée réflexe est absent.
4. Décapitez chiots.
   1. Couper la peau de la tête longitudinalement de l'avant vers l'arrière en utilisant une lame de scalpel en acier au carbone, et tirer la peau sur les côtés à l'aide de forceps. Couper l'os recouvrant le cerveau déplaçant la scissors latéralement et retirer totalement afin d'exposer le cerveau.
   2. Ensuite, retirez rapidement le cerveau à l'aide d'une spatule (initialement placé sous le bulbe olfactif afin de pousser doucement le cerveau du plus rostrale vers les zones les plus caudales). Poussez doucement le cerveau en oxygéné liquide céphalo-rachidien de saccharose artificielle glacée (sucrose-LCRa).
5. Faire une coupe sagittale sur l'hémisphère droit (retirer environ un tiers de l'hémisphère), et collez le côté garni du cerveau sur un disque métallique qui sera magnétiquement fixé à la chambre de coupe d'un vibroslicer pour couper sagittal 400 um sections contenant le pédonculopontin noyau (PPN). Gardez les tranches PPN à température ambiante pendant 45 min avant de cellules entières enregistrements de patch-clamp.

4. Oscillations Recordings Gamma-bande en PPN tranches

1. Préparation de Potassium-gluconate Solution intracellulaires (High-K ⁺ Solution)
   1. Placer dansglace un bécher propre avec 10 ml d'eau distillée. Tout en agitant continuellement ajouter: K ⁺ -gluconate, 90,68 mg phosphocréatine di Tris sel, 47,66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40,58 mg Mg ²⁺ -ATP, et 4 mg Na ⁺ ₂ -GTP.
   2. Ajuster le pH à 7,3 avec du KOH (100 mM dans l'eau distillée). Ajouter de l'eau distillée pour atteindre un volume final de 20 ml. Si nécessaire, ajuster l'osmolarité avec du saccharose (100 mM dans de l'eau distillée) pour être 280-290 mOsm. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de K ⁺ 124 mM -gluconate, 10 mM de Tris phosphocréatine di sel, HEPES 10 mM, EGTA 0,2 mM, 4 mM de Mg ²⁺ ATP et 0,3 mM de Na ⁺ ₂ -GTP.
   3. solutions aliquote intracellulaires dans 1 ml de tubes et de congélation à -20 ° C. Utilisez une aliquote par jour et conserver à 4 ° C au cours des expériences.
2. Whole-cell patch clamp Recordings
   1. Placer les tranches dans une chambre d'immersion et les (1,5 ml / min) avec perfuser oxygénées(95% de O ₂ - 5% de CO ₂₎ LCRa contenant les antagonistes des récepteurs suivants: un antagoniste du récepteur de l' acide sélectif de NMDA 2-amino-5-phosphonovalérique (APV, 40 uM), compétitif AMPA / kainate antagoniste du récepteur du glutamate 6-cyano-7- nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 10 uM), un antagoniste des récepteurs de la glycine strychnine (STR, 10 uM), le GABA spécifique _Un gabazine antagoniste des récepteurs (GBZ, 10 uM) et bloquant les canaux de sodium tétrodotoxine (TTX, 3 pM)
      NOTE: Dans les résultats et les chiffres, ces antagonistes sont collectivement appelés bloquants ou SBs comme synaptiques.
   2. Remplissez les pipettes de patch d'enregistrement (Résistance 2-7 MQ, fabriqué à partir de réguliers disponibles dans le commerce épais capillaires, de verre mur de borosilicate de 1,0 mm de diamètre extérieur et de 0,6 mm de diamètre intérieur) avec une solution intracellulaire haute-K ⁺ à l' aide disponibles dans le commerce charges patch-pipettes avec filtre de solution. Insérez la pipette dans le support de son amplificateur. Appliquer une petite positive pression en utilisant une seringue de 1 ml reliée au support de la pipette à l'aide d'un tube de silicium relié à une vanne à trois voies. Se connecter à l'arrière du porte-pipette à un amplificateur de patch-clamp.
   3. Déplacer la pipette d'enregistrement en utilisant un micromanipulateur mécanique près du noyau PPN en utilisant un objectif 4X combinée à proche infrarouge contraste optique d'interférence différentielle.
      NOTE: PPN noyau peut être observé dans les tranches dorsale du pédoncule cérébelleux supérieur (SCP; observable comme un gros paquet d'axones). Les pipettes d'enregistrement étaient situés dans la pars compacta PPN, qui est située immédiatement dorsale à l'extrémité postérieure du pédicule.
   4. Amener la pipette d'enregistrement en contact avec un neurone PPN alors visualisé à l'aide d'un objectif 40X à immersion de l'eau, et appliquer rapidement aspiration négative pour former un joint étanche avec la cellule.
   5. Utiliser un logiciel d'étanchéité voltage-clamp pour surveiller la résistance de la pipette lors de l'aspiration négative en utilisant le protocole du fabricant.
      1. Lorsque s négatifsuction augmente lentement et les valeurs de résistance de lecture par le moniteur de patch-clamp à la pointe de la pipette atteindre 80 - 100 MOhm, changer rapidement le potentiel de maintien de -50 mV et relâcher la pression négative. Commencer à appliquer de façon continue aspiration négative jusqu'à ce que la rupture électrique membrane et l'accès du neurone est obtenu dans la configuration de cellule entière.
      2. Si les valeurs de résistance d'accès mesurées par le logiciel d'étanchéité voltage-clamp sont 10 MOhm ou plus, puis continuer à appliquer une aspiration négative en plus petites quantités.
   6. Compenser la capacité ( par exemple, les transitoires lents et rapides observés après la rupture de la membrane de la cellule) et la résistance série en mode voltage-clamp. Mettez le mode d' enregistrement à pince de courant, et rapidement compenser les valeurs de pont (par exemple, déplacer le bouton de l' amplificateur ou cliquez sur le menu de compensation automatique en utilisant la souris le ordinateur).
      1. Surveiller en permanence potentiel de repos de la membrane du neurone PPN étant u enregistréchanter le protocole du fabricant. Si au repos membrane changement potentiel vers dépolarisants ou hyperpolarisants valeurs, utiliser de petites quantités de courant continu (jusqu'à 100 pA) pour maintenir la valeur finale mV optimale -50.
         NOTE: Gardez les neurones PPN seulement avec un potentiel stable membranaire de repos (RMP) de -48 mV ou plus hyperpolarisé (ie, RMP <-48 mV).

Résultats

Dans un premier temps, les oscillations gamma ont été évoquées en utilisant des impulsions de courant carrés. L' enregistrement en cours de serrage des neurones PPN en présence de bloqueurs synaptiques et TTX a été surveillée en continu pour garantir que le potentiel de membrane au repos est maintenu stable à ~ -50 mV (figure 1A). Deux deuxièmes longues impulsions de courant carrées ont été injectées par voie intracellulaire par l'amplificateur de ...

Discussion

Neurones PPN ont des propriétés intrinsèques qui leur permettent de tirer des potentiels d'action à des fréquences de la bande bêta / gamma pendant les enregistrements in vivo à partir d' animaux qui sont éveillés ou pendant le sommeil paradoxal, mais pas pendant le sommeil lent ^2,3,5,13-17. D'autres auteurs ont montré que les transections du tronc cérébral à plusieurs niveaux antérieurs à PPN réduit les fréquences gamma pendant les enregistrements EEG. Cependant, lorsque...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, molecular weight = 342.30
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, molecular weight = 84.01
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, molecular weight = 74.55
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, molecular weight =  203.30
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, molecular weight = 180.16
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, molecular weight =176.12
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025	NaCl, molecular weight =  58.44
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, molecular weight =  234.25
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight =  453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18
Tetrodotoxin citrate	Alomone Labs	T-550	C11H17N3O8, molecular weight = 319.27
DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, molecular weight = 197.13
CNQX disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, molecular weight = 334.41
Mecamylamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75
Gabazine (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23
Ketamine hydrochloride	Mylan	67457-001-00
Microscope	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
Heater	Warner Instruments	TC-324B
Pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Refrigeration system	Vibratome Instruments	900R
Equipment
microscope	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
heater	Warner Instruments	TC-324B
pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
pipette puller	Sutter Instruments	P-97
camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C