Injection d’échafaudages de biomatériaux d’hydrogel au cerveau après un AVC

Summary

L’AVC est un problème mondial avec des options de traitement minimales et aucune thérapie clinique actuelle pour régénérer le tissu cérébral perdu. Nous décrivons ici des méthodes pour créer un AVC photothrombotique précis dans le cortex moteur des rongeurs et l’injection ultérieure de biomatériaux d’hydrogel pour étudier leurs effets sur la régénération tissulaire après un AVC.

Abstract

L’AVC est la principale cause d’invalidité et la cinquième cause de décès aux États-Unis. Environ 87% de tous les accidents vasculaires cérébraux sont des accidents vasculaires cérébraux ischémiques et sont définis comme le blocage soudain d’un vaisseau fournissant du sang au cerveau. Dans les minutes qui suivent le blocage, les cellules commencent à mourir et entraînent des lésions tissulaires irréparables. Les traitements thérapeutiques actuels se concentrent sur l’élimination des caillots ou la lyse pour permettre la reperfusion et prévenir des lésions cérébrales plus graves. Bien que la plasticité cérébrale transitoire puisse sauver une partie des tissus endommagés au fil du temps, des fractions importantes de patients se retrouvent avec des déficits neurologiques qui ne disparaîtront jamais. Il y a un manque d’options thérapeutiques pour traiter les déficits neurologiques causés par un ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles stratégies pour traiter cette population croissante de patients. Les biomatériaux injectables sont actuellement conçus pour améliorer la plasticité cérébrale et améliorer la réparation endogène grâce à l’administration d’agents actifs ou de cellules souches. Une méthode pour tester ces approches consiste à utiliser un modèle d’AVC de rongeur, à injecter le biomatériau dans le noyau de l’AVC et à évaluer la réparation. Connaître l’emplacement précis du noyau de l’AVC est impératif pour le traitement précis après l’AVC, par conséquent, un modèle d’AVC qui aboutit à un emplacement prévisible de l’AVC est préférable pour éviter le besoin d’imagerie avant l’injection. Le protocole suivant couvrira comment induire un accident vasculaire cérébral photothrombotique, comment injecter un hydrogel de manière contrôlée et précise, et comment extraire et cryosectionner le cerveau tout en gardant le biomatériau intact. En outre, nous soulignerons comment ces mêmes matériaux d’hydrogel peuvent être utilisés pour la co-administration de cellules souches. Ce protocole peut être généralisé à l’utilisation d’autres biomatériaux injectables dans le noyau de l’AVC.

Introduction

L’AVC est la principale cause d’invalidité et la cinquième cause de décès aux États-Unis¹. Environ 87% de tous les accidents vasculaires cérébraux sont ischémiques, tandis que la majorité des 13% restants sont hémorragiques². Un AVC ischémique est défini comme le blocage du flux sanguin dans une artère vers le tissu environnant. Cette occlusion entraîne une privation d’oxygène et une nécrose subséquente qui entraîne souvent une invalidité permanente chez les patients survivants. Bien qu’il y ait eu une diminution du taux de mortalité des accidents vasculaires cérébraux^3,sa prévalence devrait augmenter pour atteindre 3,4 millions de personnes d’ici 2030⁴. Cette augmentation du nombre de survivants handicapés et le fardeau économique qui en résulte ont conduit à une poussée pour la recherche sur les accidents vasculaires cérébraux qui se concentre sur les mécanismes de réparation neuronale. Après un AVC, il y a une période inflammatoire qui conduit à la formation d’une cicatrice qui empêche la région nécrotique de se développer. La région entourant le noyau nécrotique est appelée « péri-infarctus » et il existe des preuves solides que la plasticité dans cette région, qui comprend une augmentation de l’angiogenèse, de la neurogenèse et de la germination axonale, est directement liée à la récupération observée chez les modèles animaux et les humains⁵. Comme il n’existe pas de modèles in vitro capables de reproduire correctement les interactions complexes qui suivent un AVC, les modèles animaux sont essentiels pour la recherche sur l’AVC.

Il existe plusieurs modèles in vivo qui peuvent être utilisés pour produire un AVC ischémique. L’un des modèles les plus couramment utilisés chez la souris est l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, ou MCAo, par occlusion distale ou proximale (via un filament intra-artériel). Le modèle proximal, également connu sous le nom de filament MCAo (fMCAo), entraîne généralement de grands accidents vasculaires cérébraux ischémiques qui englobent de 5% à 50% de l’hémisphère cérébral, en fonction du nombre de facteurs^6. Dans ces modèles, une suture ou un filament est avancé de l’artère carotide interne à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) et maintenu en place pendant une période de temps spécifique. Cette méthode d’occlusion, qui peut être rendue temporaire ou permanente, produit un infarctus centré dans le striatum et peut ou non impliquer une sus-couche du cortex^6. La taille de la course résultante est très variable et des techniques d’imagerie, telles que le doppler laser, sont nécessaires pour confirmer l’efficacité de la procédure chez chaque souris. L’occlusion de filament intra-artérielle ou intra-luminale qui dure plus de 30 minutes produit des traits à l’extrémité la plus large de la plage de taille. Certains chercheurs se sont concentrés sur des temps d’occlusion de filament plus courts, ce qui nécessite une mise au point expérimentale substantielle et une validation en laboratoire⁷. Les modèles de filament MCAo chez la souris suivent des stades similaires de mort cellulaire, de progression ischémique et de formation d’une région de péri-infarctus comme on le voit dans les cas d’accident vasculaire cérébral humain; cependant, les accidents vasculaires cérébraux plus importants ressemblent davantage à l’état pathologique des infarctus cérébraux malins, qui sont moins fréquents, moins traitables accidents vasculaires cérébraux humains⁶. Pendant ce temps, l’occlusion distale de MCA nécessite une chirurgie et une craniectomie plus impliquées. Dans ce modèle, la partie distale du MCA qui longe la surface du cerveau est directement obstruée par une attache de suture ou une cautérisation. Dans certaines variantes de la technique, les artères carotides sont obstruées unilatéralement ou transitoirement-bilatéralement. Un avantage du MCAo distal est qu’il produit une course corticale de taille moins variable que le modèle de filament. Cependant, le modèle distal produit un rendement comportemental plus faible en raison de la transsection de l’artère carotide externe (ECA), ce qui est également une préoccupation avec fMCAo⁶.

Un modèle d’AVC alternatif connu pour être moins invasif est le modèle photothrombotique (PT). Le modèle PT donne un emplacement bien défini de l’ischémie et est associé à un taux de survie élevé⁸. La technique repose sur un colorant photosensible injecté par voie intrapéritonéale qui permet la photo-oxydation intravasculaire simplement en irradiant le tissu désiré avec une lumière ou un laser^9. Lors de l’excitation, des radicaux d’oxygène se forment qui causent des dommages endothéliaux, ce qui active l’agrégation plaquettaire et la formation de caillots dans la zone irradiée^8,9. Le contrôle étroit de la taille et de l’emplacement de la course, ainsi que la reproductibilité élevée du modèle PT, le rendent idéal pour l’étude des biomatériaux. Bien que la précision soit rendue possible à l’aide d’un laser et de coordonnées stéréotaxiques, certains inconvénients peuvent rendre ce modèle moins idéal pour peu d’études. Contrairement au modèle fMCAo, le modèle PT stroke ne peut pas être réaffûté. Par conséquent, les matériaux pour étudier les agents neuroprotecteurs spécifiques aux dommages après la reperfusion ou les mécanismes suivant la reperfusion ne seraient pas utiles ici⁸. De plus, en raison de l’insulte microvasculaire du modèle PT, une pénombre ischémique relativement petite est observée. Au lieu de cela, un œdème vasogénique local se produit, ce qui n’est pas caractéristique de l’accident vasculaire cérébral humain, ce qui rend ce modèle indésirable pour les études précliniques sur les médicaments axées sur la zone du péri-infarctus^6,8.

L’objectif global des stratégies de biomatériaux dans l’AVC est soit de fournir des agents bioactifs, soit d’agir comme une matrice extracellulaire de substitution pour la croissance des tissus cérébraux. Une stratégie que nous explorerons à l’aide de nos méthodes consiste à administrer de l’hydrogel directement dans le noyau de l’AVC, par opposition au tissu péri-infarctus où de nombreuses thérapies cellulaires actuelles sont administrées¹⁰. La raison d’être de cette approche est que l’administration dans le tissu nécrotique trouvé dans le noyau évitera de perturber le tissu sain ou en convalescence environnant. Nous supposons que la diffusion de tous les agents actifs inclus dans le biomatériau pourra atteindre le péri-infarctus à partir du noyau, d’autant plus que nous constatons que la livraison de biomatériaux hydrogel réduit l’épaisseur de la cicatrice^{gliale 11}. Ceci est important car il a été démontré que la région du péri-infarctus présente une neuroplasticité après un AVC, ce qui en fait une cible attrayante. En outre, l’administration d’une matrice de substitution au noyau de l’AVC peut être chargée de facteurs angiogéniques¹² ou neurogènes¹³ pour guider la formation de nouveaux tissus, ainsi que de cellules pour l’accouchement¹⁴. L’administration cellulaire est grandement améliorée par l’utilisation d’une matrice car elle protège les cellules des forces d’injection sévères et de l’environnement local présents pendant l’accouchement, ainsi que favorise la différenciation et la greffe¹⁵.

Ces biomatériaux thérapeutiques injectables ont une pertinence clinique dans les applications d’AVC, car il n’existe actuellement aucune thérapie médicale qui stimule la récupération neuronale après un AVC. Les circuits neuronaux sous-jacents impliqués dans la récupération se trouvent dans le tissu cérébral adjacent au noyau de l’AVC¹⁶, tandis que le noyau de l’AVC lui-même est dépourvu de tissu neural viable. Nous prévoyons que l’administration d’un biomatériau dans le noyau de l’AVC nécrotique a le potentiel de stimuler le tissu adjacent vers des processus de régénération par un certain nombre de mécanismes mentionnés précédemment, y compris la libération de dépôt de facteurs de croissance¹³, la stimulation de la croissance tissulaire et la promotion de la récupération du développement du tissu cérébral^11,12, l’altération des réponses immunitaires¹⁷, et l’administration de thérapies dérivées de cellules souches^{14, 18}. Cependant, pour étudier efficacement la possibilité de ces applications, une méthode cohérente et reproductible pour induire un AVC et injecter des biomatériaux est nécessaire. Le modèle de course PT utilise des techniques qui offrent un contrôle précis sur l’orientation et l’emplacement de la course. Un laser fixé au dispositif stéréotaxique guide les orientations et des pompes fixées aux dispositifs stéréotaxiques contrôlent le taux d’injection du matériau sans avoir besoin de formes supplémentaires d’imagerie. Par conséquent, nous avons choisi de décrire les méthodes permettant d’effectuer un AVC PT dans les cortex moteurs de souris et d’injecter des biomatériaux dans le noyau de l’AVC. Ici, nous utilisons des hydrogels de particules recuites microporeuses (MAP) comme biomatériau pour injection sans cellules ni facteurs de croissance ajoutés. De plus, nous expliquons comment récupérer avec succès le cerveau avec des biomatériaux intacts et nous discutons des tests d’immunochimie utilisés pour analyser le résultat de l’AVC avec et sans injection de biomatériaux.

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Protocol

Les expériences ont été menées conformément à l’IUCAC de l’Université Duke et de l’Université de Californie à Los Angeles. Des souris mâles C57Bl/6J âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées dans cette étude. Les animaux ont été logés sous température contrôlée (22 ± 2 °C), avec une période de cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès ad libitum à de la nourriture et de l’eau en granulés. Les protocoles d’analgésie et de sédation sont décrits comme approuvés par l’IUCAC, mais peuvent différer des protocoles utilisés dans d’autres laboratoires.

Les animaux peuvent être euthanasiés prématurément s’ils éprouvent une agitation excessive, une vocalisation (indiquant une douleur incontrôlable), un auto-traumatisme, une diminution ou une altération de la mobilité, des signes physiques d’infection cutanée, une perte d’appétit et / ou une perte de poids supérieure à 10% à 15% à la suite de la chirurgie de survie. Il n’y a pas d’effets indésirables anticipés de l’injection du gel, car il est composé d’un polymère naturel dans le cerveau. Les animaux doivent être surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et les jours fériés, et recoupés tous les deux jours. Des études de notre laboratoire et d’autres n’ont trouvé aucun déficit dans le toilettage, la perte de poids corporel ou les signes / symptômes de sevrage ou de stress chronique chez la souris après ces petits accidents vasculaires cérébraux corticaux ou sous-corticaux. Si les animaux présentent des signes d’infection locale de la plaie à la tête, ils doivent être euthanasiés. Les animaux doivent également être surveillés pour détecter un mauvais toilettage, l’état des plaies et des signes de combats entre animaux (blessures au dos). S’il y a des signes de combat ou de déhiscence de la plaie, les animaux doivent d’abord être traités après avoir contacté les vétérinaires. Cela implique souvent un antibiotique dans l’eau et / ou une application locale d’antibiotiques topiques. Si ces mesures ne parviennent pas à produire la guérison, les animaux devraient être euthanasiés.

1. Préparation du matériel et des instruments

1. Préparez un colorant photothrombotique avant la chirurgie. Peser 15 mg de Rose Bengal dans un tube de microcentrifugation de 2 mL.
   ATTENTION: Rose Bengal peut causer de graves dommages / irritations oculaires.
   1. Dissoudre le Rose Bengal dans 1,5 mL de PBS stérile filtré 1x pour obtenir une concentration de travail de 10 mg/mL.
   2. Vortex le tube jusqu’à ce qu’aucun touffe ne soit visible, indiquant que le colorant s’est complètement dissous, puis recouvrir de papier d’aluminium jusqu’à une utilisation ultérieure.
      REMARQUE: La quantité de colorant nécessaire dépendra du nombre de souris. Le colorant est injecté par voie intrapéritonéale IP à une concentration de 10 μL/g, par exemple 200 μL pour une souris de 20 g.
2. Allumez le coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris pendant l’anesthésie (37 °C).
3. Préparez des ciseaux autoclavés, des pinces, du coton, une pommade pour les yeux vétérinaires, de la colle chirurgicale ou du matériel de suture, un marqueur chirurgical bleu ou noir et des lingettes stériles à l’alcool et à l’iode bêta. Préparez la perceuse osseuse avec des têtes de foret stérilisées.
4. Activez la stérilisation des billes à 160 °C pour permettre la stérilisation des instruments entre les souris opérées. Réserver un tube conique de 50 mL de solution saline stérile ou 1x solution de PBS pour une utilisation ultérieure dans le maintien d’une zone d’opération hydratée.
5. Fixez le laser à l’appareil stéréotaxique. En portant des lunettes de sécurité laser, mesurez la puissance du laser (mW).
   ATTENTION: Utilisez des lunettes de sécurité laser chaque fois que le laser est allumé dans la procédure.
   1. Réglez le courant sur la console laser, en suivant les instructions de fabrication du laser, jusqu’à ce que la puissance de sortie laser indique 10 mW, puis réglez le courant comme préréglage sur la console de l’écran d’accueil. Ensuite, ajustez à nouveau le courant pour établir un autre préréglage où la puissance de sortie laser lit 40 mW. Maintenant, éteignez le laser jusqu’à une utilisation ultérieure.
      REMARQUE: Les 10 mW seront utilisés pour orienter le laser avant utilisation.
6. Préparez une cage propre pour les souris après la chirurgie. Ensuite, placez la souris dans la chambre d’induction avec une concentration d’isoflurane de 4% pour l’anesthésier jusqu’à ce que le mouvement spontané s’arrête et que sa respiration atteigne un rythme lent et régulier.
7. Une fois endormi, pesez la souris pour déterminer la quantité de colorant Rose Bengal à injecter. Ensuite, transférez et fixez la souris sur le dispositif stéréotaxique avec une concentration d’isoflurane de maintenance de 1,5%.
   REMARQUE: L’augmentation des concentrations d’isoflurane peut dilater les vaisseaux et empêcher une occlusion suffisante ou des coups de taille constante entre les souris.
8. Appliquez une pommade pour les yeux vétérinaire sur les deux yeux.
   REMARQUE: Surveillez la respiration et la température tout au long de la procédure et pincez les orteils de temps en temps pour vous assurer que la souris ne peut rien sentir.

2. Avc photothrombotique modèle⁹

1. Rasez la fourrure de la tête de la souris et préparez la zone de manière aseptique à l’aide d’une lingette alcoolisée suivie d’une lingette à l’iode bêta. Répétez trois fois.
   REMARQUE: Si nécessaire, utilisez une lingette alcoolisée supplémentaire à la fin pour nettoyer tout l’iode bêta car il provoque une irritation de la peau qui conduit les souris à démanger leur crâne après la chirurgie.
2. À l’aide de petits ciseaux d’opération, faites une incision latérale entre les oreilles et les yeux, d’environ 1 à 2 cm. Pour ce faire, tirez la peau vers le haut avec une pince pour créer une tente, coupez une fois vers le bas, puis insérez les ciseaux dans l’ouverture et créez une incision continue de la ligne médiane.
3. Séparez la peau et appuyez légèrement sur les os pariétaux avec la pince pour localiser le bregma. Marquez le bregma avec un point à l’aide du marqueur chirurgical.
   REMARQUE: Le mouvement du fragment d’os met en évidence la bordure frontale des os pariétaux. Le bregma est le point central auquel les fragments osseux frontal et pariétal se rencontrent(Figure 1A).
4. En portant des lunettes de sécurité laser, déplacez le laser sur le crâne de la souris, en fixant le dispositif stéréotaxique à un angle de 90 °. Sélectionnez le préréglage de 10 mW et allumez le laser.
   1. Ajustez les axes x et y du laser jusqu’à ce qu’il soit directement au-dessus du bregma. Réinitialisez les x et y sur la console d’affichage numérique, puis déplacez le laser de 1,8 mm à gauche de la bregma. Maintenant, amenez le laser aussi près que possible du crâne sans le laisser toucher le crâne.
   2. Déplacez le laser à 2,2 mm à gauche du bregma pour vous assurer qu’il peut se déplacer sans aucune obstruction. Éteignez le laser.
5. Injecter la quantité appropriée de colorant Rose Bengal par voie intrapéritonéale (IP) à l’aide d’une aiguille jetable de 29 G. Démarrez immédiatement une minuterie pendant 7 minutes pour permettre au colorant de circuler de manière systémique. Sélectionnez le préréglage pour 40 mW sans allumer le laser.
   REMARQUE: Une fois à l’aise avec la procédure, le colorant peut être injecté avant la préparation aseptique de la souris et terminé avant la fin des 7 minutes pour gagner du temps.
6. Allumez le laser (40 mW) lorsque la minuterie de 7 minutes se déclenche, tout en portant des lunettes de sécurité laser, et réglez une minuterie de 10 minutes.
   1. Après 10 minutes, déplacez le laser à 2,2 mm à gauche du bregma sans l’éteindre et réglez une autre minuterie de 10 minutes.
   2. Une fois que la deuxième minuterie de 10 minutes s’est déclenchée, replacez le laser à 10 mW et déplacez le laser à 2,0 mm à gauche du bregma. Marquez cet endroit avec le marqueur chirurgical. Éteignez ensuite le laser.
   3. Soulevez le laser et déverrouillez-le de l’angle de 90 ° afin qu’il puisse être éloigné de la souris. À ce stade, appliquez la solution saline stérile ou pbS avec du coton si la zone chirurgicale est sèche.
7. Percez en petites rafales à la marque de 2,0 mm perpendiculaire à la surface du crâne.
   REMARQUE: Veillez à forer lentement pour éviter de percer trop profondément et de frapper le cerveau. Il y aura une légère baisse / changement de résistance une fois que la perceuse aura traversé le crâne, et le forage peut provoquer des saignements.
   1. Utilisez du coton pour absorber tout excès de sang. Il est typique de voir du sang provenant d’artères entaillées dans le crâne après le forage – un excès de sang signifie que le foret frappe le cerveau. Si cela se produit, enregistrez l’identificateur de la souris et passez à autre chose.
8. Placez une petite lingette à côté de la souris. À l’aide de la pince, rapprochez la peau pour vous préparer au collage.
   REMARQUE: La suture peut être effectuée ici à la place. La suture ne nécessite généralement que 3 sutures.
   1. À l’aide de la pince, saisissez les deux côtés de la peau et tirez-les ensemble et vers le haut. Tamponnez toutes les grosses gouttes de colle chirurgicale à l’extrémité de la pointe sur la lingette avant de l’appliquer sur la souris.
   2. Appliquez la colle chirurgicale avec parcimonie et maintenez la peau ensemble avec une pince pendant 10 s. Continuez jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’ouvertures visibles.
      REMARQUE: La colle sort rapidement - ne pressez pas la bouteille. Évitez de coller la peau au crâne ou d’avoir de la colle dans l’œil.
9. Après le collage ou la suture, placez la souris dans la nouvelle cage pour récupérer de l’anesthésie. Il faut 5 à 10 minutes pour que l’animal se rétablisse et il est utile de reposer la moitié de la cage sur un coussin chauffant.

3. Opération d’AVC simulée

1. Effectuer toutes les procédures identiques à l’opération décrite ci-dessus à la section 2, sauf injecter 1x PBS ou solution saline au lieu du colorant Rose Bengal.

4. Injection d’hydrogel ou d’autres biomatériaux

1. Effectuer l’injection de biomatériaux à un moment défini par l’utilisateur. Dans cette expérience, des injections ont été effectuées entre 5 et 7 jours après l’AVC. 2 à 6 μL d’hydrogel sont injectés (définis par l’utilisateur).
   1. Allumez le coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris pendant l’anesthésie (37 °C).
   2. Préparez des ciseaux autoclavés, des pinces, du coton, une pommade pour les yeux vétérinaires, de la colle chirurgicale ou du matériel de suture, ainsi que de l’alcool stérile et des lingettes à l’iode bêta. Préparez la perceuse osseuse avec des têtes de foret stériles et les seringues Hamilton en verre de 25 μL avec des aiguilles métalliques de 30 G.
   3. Activez la stérilisation des billes à 160 °C pour permettre la stérilisation des instruments entre souris.
   4. Fixez les pompes d’injection au dispositif stéréotaxique. Réglez le débit à 1 μL/min et réglez le volume sur 4 μL.
   5. Préparez une cage propre pour les souris après la chirurgie.
2. Placez la souris dans la chambre d’induction avec une concentration d’isoflurane de 4% pour l’anesthésier jusqu’à ce que le mouvement spontané s’arrête et que sa respiration atteigne un rythme lent et régulier.
   1. Une fois endormi, transférez et fixez la souris sur le dispositif stéréotaxique avec une concentration d’isoflurane d’entretien de 1,5%.
   2. Appliquez la pommade pour les yeux du vétérinaire sur les deux yeux.
   3. Rasez toute fourrure qui pourrait avoir repoussé la tête de la souris et préparez la zone de manière aseptique à l’aide d’une lingette alcoolisée suivie d’une lingette à l’iode bêta. Répétez trois fois.
      REMARQUE: Si nécessaire, utilisez une lingette alcoolisée supplémentaire à la fin pour nettoyer tout l’iode bêta car il provoque une irritation de la peau et conduit les souris à démanger leur crâne après la chirurgie.
3. À l’aide des petits ciseaux et/ou des pinces, rouvrez la peau au-dessus du cerveau. Utilisez du coton avec une solution saline stérile ou du PBS pour nettoyer les débris du crâne. Un cercle blanc-jaune (le trait, figure 1B)et le trou de bavure de la perceuse seront visibles. Si le tissu mort n’est pas visible, il est probable qu’aucun accident vasculaire cérébral ne se soit produit. Si le trou de bavure n’est pas centré au-dessus de la course, reforez pour le centrer.
4. Orientez la pompe d’injection sur la souris et verrouillez-la à 90°. Nettoyez la seringue avec une solution saline stérile ou une solution de PBS avant de recharger le matériau.
   1. Une fois nettoyé, démontez la seringue en verre pour qu’il n’y ait pas d’aiguille. Rechargez la seringue à l’aide d’une pipette à déplacement positif de 25 μL avec les 10 μL d’hydrogel (ou d’autres biomatériaux ici avec ou sans cellules).
   2. À l’aide du piston de la seringue, poussez le gel jusqu’à l’avant de la seringue. Ensuite, remontez la seringue et continuez à pousser jusqu’à ce que le gel dégage visiblement de l’aiguille.
5. Placez la seringue sur la pompe. L’arrière de la pompe peut avoir besoin d’être ajusté pour que la seringue s’adapte. Pour ce faire, réglez le débit à 30 μL/min, sélectionnez Retrait ou Injecter en fonction de la direction dans laquelle il doit se déplacer, puis appuyezsur Démarrer . Appuyez sur Stop lorsque l’arrière de la pompe est au bon endroit.
   1. Vissez l’arrière de la pompe pour que la seringue soit sécurisée. Si des ajustements ont déjà été effectués, assurez-vous que le débit est ramené à 1 μL/min et qu’il est réglé pour injecter.
6. Déplacez la pompe dans les directions x et y pour l’orienter au-dessus du trou. Déplacez la pompe vers le bas dans la direction z jusqu’à ce que l’aiguille de la seringue touche le haut du trou.
7. Réinitialisez le z sur la console d’affichage numérique. Ensuite, déplacez la seringue vers le bas dans la direction z 0,750 mm. Si la seringue se plie ou s’il y a une résistance, le crâne a guéri ou n’a pas été complètement percé et doit être re-percé.
8. Appuyez sur Démarrer sur la console de la pompe pour injecter 4 à 6 μL de l’hydrogel à raison de 1 μL/min.
9. Réglez une minuterie de 5 minutes lorsque la pompe cesse d’injecter pour permettre au gel de commencer la réticulation.
10. Après 5 min, remontez lentement la seringue en tournant le z nob. Surveillez si un matériau est accidentellement tiré ou s’il fuit du trou. Déverrouillez la pompe et éloignez-la de la souris lorsque l’aiguille est suffisamment éloignée du crâne.
11. À l’aide de pinces, de colle chirurgicale ou de sutures, fermez la peau au-dessus de la tête. Placez la souris dans la cage propre et observez sa récupération. Cela devrait prendre environ 5 à 10 minutes pour que la souris se remette de l’anesthésie.

5. Perfusion et prélèvement d’échantillons

1. Anesthésiez la souris à l’aide d’isoflurane.
2. Fixez l’animal en position couchée et ouvrez la cavité abdominale avec une coupe médiane. En option, serrez l’aorte abdominale descendante pour utiliser moins de fixateur et de PBS.
3. Ouvrez le diaphragme et remontez les côtés de la cage thoracique pour ouvrir la cavité thoracique. Insérez une canule de perfusion dans le ventricule gauche et coupez une ouverture dans l’oreillette droite. Commencez à perfuser lentement avec 10 à 20 mL de PBS ou jusqu’à ce que le liquide soit semi-clair.
4. Une fois dégagé, passez à 4 % de PFA pour 10 à 20 ml supplémentaires. Détacher les bras leur permet de se contracter au fur et à mesure que le PFA infuse. Une fois qu’ils cessent de bouger, attendez encore 30 secondes.
5. Décapitez l’animal et retirez la peau pour exposer le crâne. À l’aide de pinces minces et émoussées, retirez soigneusement les morceaux du crâne pour exposer le cerveau. Des précautions particulières doivent être prises lors du retrait du crâne au-dessus du site de l’AVC. De petits ciseaux chirurgicaux peuvent être utilisés ici pour aider à couper le crâne. Le plus grand défi est que le gel se colle au crâne et sorte du cerveau lorsque le crâne est retiré.
6. Une fois le cerveau détaché, placez 10 à 15 mL de PFA à 4% pendant la nuit (pas plus de 24 h).
7. Déplacez le cerveau du PFA à 30% de saccharose le lendemain. Le cerveau est prêt pour la cryosection une fois qu’il s’enfonce au fond (environ 2 à 3 jours). Il peut également être laissé pour stockage à ce stade.

6. Cryosection et coloration

1. Retirez le cerveau du saccharose et placez-le sur une lame de verre. Coupez une petite partie de l’arrière du cerveau avec une lame de rasoir pour créer une partie plate à monter sur un mandrin.
   1. Placez une cuillerée de composé de température de coupe optimale (OCT) sur le mandrin, puis placez le cerveau, côté plat vers le bas, sur le mandrin dans l’OCT. Placez cet échantillon sur de la glace carbonique jusqu’à ce qu’il soit congelé ou dans le cryostat sur le bloc de congélation.
      REMARQUE: OCT peut être ajouté pour englober pleinement le cerveau afin d’aider à empêcher le matériau de se séparer du cerveau pendant la section.
2. Coupez les cerveaux en série sur un cryostat à -20 °C à des sections de 30 μm d’épaisseur sur 10 lames recouvertes de gélatine. Faites attention lors du sectionnement en veillant à ne pas perdre l’hydrogel. Si cette partie est difficile, placez un peu d’OCT sur le dessus du cerveau sur le gel (Figure 3). Conserver à -80 °C jusqu’à nouvel usage.
3. Sortez les glissières de -80 °C et placez-les sur un plateau de coloration pour les laisser sécher. Les diapositives qui n’ont pas été gelées mais simplement sectionnées peuvent également être tachées immédiatement.
4. À l’aide d’un stylo hydrophobe, dessinez un cercle autour des tranches de cerveau sur la diapositive. Une fois sec, réhydratez les tranches de cerveau avec 1x PBS filtré et placez-les sur un agitateur à température ambiante pendant 15 min. Cela prend environ 1 mL de tampon par diapositive avec 9 à 12 sections du cerveau.
5. Lavez les lames avec 1x PBS filtré pendant 5 min à température ambiante, répétez trois fois.
6. Bloquez les lames pendant 30 min à une heure avec 10% de sérum d’âne dans 0,01% de PBS-Triton X à température ambiante sur la danseuse du ventre. Cela prend environ 200 μL par lame.
7. Incuber l’anticorps primaire dans du sérum d’âne à 10 % avec 0,01 % de PBS-Triton X pendant la nuit à 4 °C sur un agitateur. Testez d’abord les anticorps primaires pour déterminer les concentrations correctes. Ici, GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500)(Figure 4)ont été utilisés.
8. Lavez les lames avec 1x PBS filtré le lendemain pendant 5 min à température ambiante, répétez trois fois.
9. Incuber avec un anticorps secondaire dans du sérum d’âne à 10% dans 0,01% de PBS-Triton X et DAPI pendant 2 h sur le shaker de laboratoire à température ambiante. 1:1 000 a été utilisé pour tous les secondaires et DAPI.
10. Lavez les lames pendant 5 min avec 1x PBS filtré.
11. Laissez les sections sécher à température ambiante dans l’obscurité. Cela peut prendre de 20 min à 4 h; placer les lames dans un dessiccateur peut accélérer le processus.
12. Déshydrater glisse à des concentrations croissantes d’alcool (1 min par solution) de 50%, 70%, 95%, 100% et 100%.
13. Dégraisser dans le premier bain de xylène pendant 1 min, puis le deuxième bain de xylène pendant 5 min.
14. Retirez rapidement les glissières une par une et ajoutez un milieu de montage pendant que les sections du cerveau sont mouillées avec du xylène. Ajoutez rapidement un couvercle en verre sur le dessus. Utilisez un bordereau de couverture de longueur et d’épaisseur correctes nécessaires pour la lame et le microscope utilisés pour l’imagerie, respectivement.
15. Débarrassez-vous des bulles sous le couvercle en appuyant doucement avec une pointe de pipette dans un mouvement vers l’extérieur à partir du centre de la glissière. Laisser sécher le DPX pendant 4 h jusqu’à la nuit dans l’obscurité à température ambiante.
16. Utilisez une lame de rasoir pour gratter tout support de montage séché qui s’est renversé sur les glissières. Essuyez les glissières avec un nettoyeur d’objectifs. Les diapositives peuvent maintenant être imagées avec la microscopie à fluorescence.
    REMARQUE: Il est préférable de stocker la diapositive dans l’obscurité ou à 4 ° C jusqu’à ce que l’imagerie soit terminée.

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Results

Le but de cette méthode était de démontrer comment injecter des biomatériaux dans le cerveau après un AVC. Un modèle photothrombotique avec du bengale rose et un laser de 520 nm a été utilisé pour contrôler l’orientation de la lésion de course en taille et en emplacement. Cinq jours après l’AVC, l’infarctus a pu être visualisé pendant la chirurgie(Figure 1B)et par TTC et imagerie des lames colorées par IHC (Figure 2). Une augmentation du dia...

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Discussion

Ici, nous démontrons un modèle d’AVC permanent, peu invasif et facilement reproductible et décrivons comment injecter un biomatériau dans l’infarctus cinq jours après l’AVC. L’utilisation du colorant photothrombotique Rose Bengal et d’un laser collimaté de 520 nm connecté au dispositif stéréotaxique nous donne la possibilité de positionner le coup au niveau du cortex moteur de la souris avec une précision accrue. Cinq jours après l’AVC, l’emplacement de l’infarctus est visible à l’œil nu a...

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Normal Goat Serum	VWR	100504-028	For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium	Medline	MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle	Fishcer Scientific	14824663	Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette	Gilson	M-25
2x Beam Expander, 400-650nm	Thorlabs	GBE02-A	Laser beam expander
Adjustable Stage Platform	Kopf Instruments	901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit	Abcam	ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat	abcam	ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12"	Medsupply	367294	For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil	Thorlabs	BKF12	To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2"	Sklar surgical instruments	64-2035
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664	8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter	Fine Science Tools	19007-05	For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate	VWR	EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers	Thorlabs	CLD1010LP
Cotton Swabs	VWR	89031-288
CP 25 pipette tips	Gilson	F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488)	abcam	ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647)	abcam	ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555)	abcam	ab150154
EMS DPX Mountant	Elecron Microscopy Sciences	13512	Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom	Electron Microscopy Sciences	16564	For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 45 PFA
ESD Worstation kit	Elmstat	WSKK5324SB	Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded	Thorlabs	HCA3	Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort	Thorlabs	PAF-X-5-A	FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm	Fine Science Tools	14028-10
GFAP Antibody, rat	Thermo Fisher Scientific	13-0300
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000	For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Iodine Prep Pads	Medx Supple	MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Laser Safety Glasses	Thorlabs	LG10B	Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck	United Scope	LED-11C
Medical USP Grade Oxygen	Airgas	OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade	Intefra Miltex	V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer	Harvard aparatus	72-6110
Mini-pump variable flow	Thomas Scientific	70730-064	Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm	Kent Scientific	RBMA-200c	For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Control Box	Chemyx	10050
Nanojet pump header	Chemxy	10051	Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch	Fishcer Scientific	NC9459562
Non-rupture ear bars 60º	Kopf Instruments	922
PBS buffer pH 7.4	VWR	97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin	Thorlabs	LP520-MF100
Positive charge glass slides	Hareta	AHS90-WH
Power engergy meter	Thorlabs	PM100D	Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Rectal Probe Mouse	kopf Instruments	Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%	Sigma-Aldrich	330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth	Kopf Instruments	1770-02	For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor	Thorlabs	S130VC	Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining	Thorlabs	CP02	For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL	VWR	10002-726	To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System	Simport Scientific	M920-2	For staining slides
Sterotaxic device	Kopf Instruments	940	Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1x2 teeth	Fine Science Tools	91127-12
Student Fine Forceps - straight/broad Shanks	Fine Science Tools	91113-10
Temperature Controller	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound	VWR	25608-930
Triton X-100	VWR	97063-864
Upper Bracket Clamp	Kopf Instruments	1770-c	For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931
Vogue Professional My Manicurist	Bargin Source	6400	For Burrs
VWR Bead Sterilizers	VWR	75999-328
Tissue Tek OCT compound	Sakura	4583	For tissue embeding