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Résumé

Ce protocole décrit la purification de la tubuline à partir de sources à petite ou moyenne échelle telles que les cellules de culture ou les cerveaux d’une seule souris, à l’aide de cycles de polymérisation et de dpolymérisation. La tubuline purifiée est enrichie en isotypes spécifiques ou a des modifications posttranslationnelles spécifiques et peut être utilisée dans des tests de reconstitution in vitro pour étudier la dynamique et les interactions des microtubules.

Résumé

Un aspect important des études du cytosquelette de microtubule est l’investigation du comportement de microtubule dans les expériences in vitro de reconstitution. Ils permettent l’analyse des propriétés intrinsèques des microtubules, telles que la dynamique, et de leurs interactions avec les protéines associées aux microtubules (MAP). Le « code de la tubuline » est un concept émergent qui indique différents isotypes de la tubuline et diverses modifications posttranslationnelles (MNP) en tant que régulateurs des propriétés et fonctions des microtubules. Pour explorer les mécanismes moléculaires du code de la tubuline, il est crucial d’effectuer des expériences de reconstitution in vitro à l’aide de tubuline purifiée avec des isotypes et des MNP spécifiques.

À ce jour, cela a été techniquement difficile que la tubuline du cerveau, qui est largement utilisé dans les expériences in vitro, abrite de nombreux M PT et a une composition définie isotype. Par conséquent, nous avons développé ce protocole pour purifier la tubuline à partir de différentes sources et avec différentes compositions d’isotypes et ptms contrôlés, en utilisant l’approche classique des cycles de polymérisation et de démlymerisation. Comparée aux méthodes existantes basées sur la purification d’affinité, cette approche produit la tubuline pure et polymérisation-compétente, car la tubuline résistante à la polymérisation ou à la dénolysation est jetée pendant les étapes successives de purification.

Nous décrivons la purification de la tubuline à partir de lignées cellulaires, cultivées soit en suspension, soit en cultures adhérentes, et à partir de cerveaux de souris simples. La méthode décrit d’abord la génération de masse cellulaire dans les paramètres de suspension et d’adhérent, l’étape de la lyse, suivie des étapes successives de purification de la tubuline par des cycles de polymérisation-dérimérisation. Notre méthode produit de la tubuline qui peut être utilisée dans des expériences traitant de l’impact du code de la tubuline sur les propriétés intrinsèques des microtubules et des interactions microtubules avec les protéines associées.

Introduction

Les microtubules jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus cellulaires. Ils donnent aux cellules leur forme, construisent des fuseaux méiotiques et mitotiques pour la ségrégation chromosomique, et servent de pistes pour le transport intracellulaire. Pour remplir ces diverses fonctions, les microtubules s’organisent de différentes manières. L’une des questions intrigantes sur le terrain est de comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent aux microtubules structurellement et évolutionnistes de s’adapter à cette pléthore d’organisations et de fonctions. Un mécanisme potentiel est la diversification des microtubules, qui est définie par le concept connu sous le nom de « code tubulin »1,2,3. Le code de la tubuline comprend deux composantes principales : l’incorporation différentielle de produits géniques α et β-tubulin (isotypes tubulaires) dans les microtubules et les modifications posttranslationnelles à la tubuline (MNP).

Depuis les années 1970, les expériences de reconstitution in vitro, combinées à l’évolution des techniques de microscopie légère, ont ouvert la voie à d’importantes découvertes sur les propriétés des microtubules : instabilitédynamique 4 et tapisroulant 5, et leurs autres mécanismeset fonctions 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Presque toutes les expériences in vitro réalisées jusqu’ici ont été basées sur la tubuline purifiée du tissu cérébral utilisant des cycles répétés de polymérisation et de dpolymérisation16,17. Bien que la purification du tissu cérébral confère l’avantage d’obtenir la tubuline de haute qualité en grandes quantités (généralement des quantités de gramme), un inconvénient important est l’hétérogénéité que la tubuline purifiée à partir du tissu cérébral est un mélange de différents isotypes de tubuline et est enrichi avec de nombreux PTMs tubulin. Cette hétérogénéité rend impossible la délimiture du rôle d’un PTM ou d’un isotype de tubuline particulier dans le contrôle des propriétés et des fonctions des microtubules. Ainsi, la production d’une tubuline compétente en assemblage avec des MNP tubulaires contrôlés et une composition homogène d’isotype est essentielle pour traiter les mécanismes moléculaires du code de la tubuline.

Récemment, une approche pour purifier la tubuline par chromatographie d’affinité utilisant le domaine de TOG microtubule-liant (gène tumeur-surexprimé) de levure Stu2p a étédéveloppée 18. Dans cette méthode, la tubuline dans les lysates bruts des cellules ou des tissus est passée à travers une colonne où elle se lie au domaine TOG immobilisé par matrice, ce qui permet l’analyse de l’ensemble du pool de tubulines d’un échantillon donné, voire très petit. Une approche attendue depuis longtemps pour purifier la tubuline recombinante a également été décrite ces dernières années. Il est basé sur le système de baculovirus, dans lequel un vecteur bi-cistronic contenant des gènes de α- et β-tubulin est exprimé dans les cellules d’insecte19. Cependant, cette méthode est très lourde et prend beaucoup de temps et est donc principalement utilisée pour étudier l’impact des mutations de la tubuline20 et des isotypes de la tubuline21,22,23 in vitro.

Dans le protocole actuel, nous décrivons une méthode qui utilise l’approche bien établie et largement utilisée de polymérisation-dépolymérisation comme modèle pour produire la tubuline avec différents niveaux de modification soit des lignes cellulaires ou du tissu cérébral de souris24. Dans cette procédure, la tubuline est pédalée entre la forme soluble (dimère tubuline à 4 °C) et polymère (microtubule à 30 °C en présence de guanosine 5'-triphosphate [GTP]). Chaque forme est séparée par des étapes successives de centrifugation : les dimers de tubuline resteront dans le supernatant après une rotation froide (4 °C), tandis que les microtubules seront granulés à 30 °C. En outre, une étape de polymérisation est effectuée à haute concentration de piperazine-N,N′-bis (acide 2-éthanesulfonique) (PIPES), ce qui permet l’élimination des protéines associées aux microtubules des microtubules et donc, de la tubuline finalement purifiée. La tubuline purifiée à partir des cellules HeLa S3 cultivées sous forme de cultures de suspension ou d’adhérent est pratiquement exempte de n’importe quelle tubuline PTM et a été utilisée dans des expériences récentes de reconstitution in vitro25,26,27,28. Nous avons en outre adapté la méthode pour purifier la tubuline à partir de cerveaux de souris simples, qui peuvent être utilisés pour un grand nombre de modèles de souris avec des changements dans les isotypes de la tubuline et les MNP.

Dans le protocole, nous décrivons d’abord la génération du matériau source (masse cellulaire ou tissu cérébral), sa lyse (figure 1A), suivie des étapes successives de polymérisation et de dénolysation des tubulines pour purifier la tubuline (Figure 1B). Nous décrivons en outre le processus d’évaluation de la pureté (figure 2A,B) et de la quantité (figure 3A,B) de la tubuline purifiée. La méthode peut être adaptée pour produire de la tubuline enrichie d’un PTM sélectionné en surexprimant une enzyme modérable dans les cellules avant la purification de la tubuline (Figure 4B). Alternativement, des enzymes modifiant la tubuline peuvent être ajoutées à la tubuline pendant le processus de purification. Enfin, nous pouvons purifier la tubuline dépourvue d’isotypes spécifiques ou de MNP provenant du cerveau de souris déficientes dans les enzymes correspondantes modificateurs de la tubuline (figure 4B)29.

La méthode que nous décrivons ici présente deux avantages principaux : (i) elle permet la production de quantités suffisamment importantes de tubuline en relativement peu de temps, et (ii) elle génère une tubuline pure de haute qualité, avec une composition spécifique d’isotype de tubuline ou des MNP. Dans la vidéo associée de ce manuscrit, nous soulignons quelques-unes des étapes critiques impliquées dans cette procédure.

Protocole

Les soins et l’utilisation des animaux dans le cadre de cette étude ont été effectués conformément aux recommandations de la Communauté européenne (2010/63/UE). Les procédures expérimentales ont été spécifiquement approuvées par le comité d’éthique de l’Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisation n° 04395.03 donnée par l’Autorité nationale) conformément aux directives internationales.

1. Préparation des reagents pour la purification de la tubuline

REMARQUE : Tous les tampons utilisés pour la purification de la tubuline doivent contenir des sels de potassium et non des sels de sodium30.

  1. Préparer 1 L de milieu complet : le milieu eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, 100 mL), 200 mM de L-glutamine (10 mL de 2 M de bouillon) et 1 x pénicilline-streptomycine (10 mL de stock de 100 x). Conserver à 4 °C.
  2. Préparer 10 M d’hydroxyde de potassium (KOH) en dissolvant 140 g de KOH dans l’eau, ajuster le volume final à 250 mL et les conserver à température ambiante.
  3. Préparer 0,5 M d’acide tétracétique éthylènediamine (EDTA), pH 8, en dissolvant 36,5 g d’EDTA dans l’eau, ajuster le pH à 8,0 à l’aide de KOH (sinon EDTA ne se dissoudra pas) et le volume final à 250 mL, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  4. Préparer 5 mM de solution saline tamponnée de phosphate (PBS)-EDTA en ajoutant 5 mL de 0,5 M EDTA à 500 mL de PBS, filtrer-stériliser et conserver à température ambiante.
  5. Préparer 0,5 M K-PIPES, pH 6.8, en dissolvant 75,5 g de PIPES dans l’eau, ajuster au pH 6.8 avec KOH (sinon PIPES ne se dissoudra pas) et le volume final à 500 mL, filtrer-stériliser, et stocker à 4 °C.
  6. Préparer 1 M K-PIPES, pH 6.8, en dissolvant 15,1 g de PIPES dans l’eau, ajuster au pH 6.8 avec KOH et le volume final à 50 mL, filtrer-stériliser, et stocker à 4 °C.
  7. Préparer 0,5 M potassium-éthylène glycol-bis (éther β-aminoethyl)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique (K-EGTA, pH 7.7) en dissolvant 47,5 g d’EGTA dans l’eau, ajuster au pH 7,7 avec KOH et le volume final à 250 mL, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  8. Préparer BRB80 (80 mM K-PIPES, pH 6,8; 1 mM K-EGTA; 1 mM chlorure de magnésium [MgCl2])solution en mélangeant 3,2 mL de 0,5 M PIPES, 40 μL de 0,5 M K-EGTA, et 20 μL de 1 M MgCl2 et ajuster le volume final à 20 mL. Conserver à 4 °C.
  9. Préparer 0,1 M de fluorure de phénythéthanesulfonyl (PMSF) en dissolvant 435 mg de PMSF dans l’isopropanol pour obtenir un volume final de 25 mL et conserver à -20 °C.
  10. Préparer le mélange d’inhibiteurs de la protéase (200x) en dissolvant 10 mg d’aprotinine, 10 mg de leupeptine et 10 mg de fluorure de benzénerosulfonyl de 4(2 aminoéthyles) dans l’eau pour obtenir un volume final de 2,5 mL, faire des aliquots de 100 μL et les conserver à -20 °C.
  11. Préparer 10% Triton X-100 en mélangeant 5 mL de Triton X-100 dans 45 mL d’eau, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  12. Préparer le tampon de lyse (BRB80 complété par 1 mM 2-mercaptoéthanol, 1 mM PMSF, 1x inhibiteurs de protéase mélange et, en option pour les cellules HEK-293, 0,2% Triton X-100) le jour de la purification de la tubuline en mélangeant 20 mL de BRB80 avec 1,5 μL de 2-mercaptoéthanol, 200 μL de 0,1 M PMSF, 100 μL du mélange inhibiteurs de la protéase et, en option, pour les cellules HEK-293 , 400 μL de 10% Triton X-100.
    REMARQUE : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et doit être utilisé dans le capot de fumée.
  13. Préparer 0,2 M GTP en dissolvant 1 g de GTP dans 9,5 mL d’eau, ajuster le pH à 7,5 à l’aide de KOH, faire des aliquots de 20 μL et les conserver à -20 °C. Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
  14. Préparer 1 M tris (hydroxyméthyle) aminométhane-hydrochlorure (Tris-HCl) en dissolvant 60,56 g de Tris dans l’eau, ajuster au pH 6,8 avec HCl, avec un volume final de 500 mL, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  15. Préparer 5x Tampon échantillon Laemmli (450 mM dithiothreitol (TNT); 10% dodecylsulfate de sodium (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6,8; 50% glycérol; ~0,006% bleu bromophénol) en ajoutant 4 g de SDS à 16 mL de préchauffé 1 M Tris-HCl, pH 6,8, et mélanger la solution doucement. Ajouter 2,6 g de TNT et 20 mL de glycérol à 100 % au mélange et remuer jusqu’à ce que la solution devienne homogène. Ajouter la quantité désirée de bleu bromophénol (2,5 mg) pour atteindre l’intensité de couleur requise. Faire 5 mL aliquots et conserver à -20 °C. Préparer la solution 2x de travail de tampon échantillon Laemmli en diluant le stock 5x dans de l’eau distillée.

2. Amplification et récolte des sources de tubuline

REMARQUE : Dans ce protocole, trois sources de tubuline ont été utilisées : (i) les cellules (HeLa S3 et HEK-293) cultivées en cultures de suspension; (ii) les cellules cultivées en tant que cultures adhérentes (HEK-293, HeLa et U2 OS); et (iii) tissu cérébral de souris. Ce protocole considère le jour de purification de la tubuline comme « jour 0 » et, par conséquent, d’autres étapes ont été décrites par rapport au jour 0.

  1. Amplification des cellules
    1. Cellules cultivées en tant que cultures de suspension
      REMARQUE : Pour purifier avec succès la tubuline des cultures de suspension, utilisez au moins 2 L de culture de suspension.
      1. Pour 2 L de culture de suspension, raviver et cultiver le type de cellule préféré pour obtenir 6 × 107 cellules 10 jours avant le jour de la préparation. Le jour -10, plaques sur six plats de 15 cm de diamètre à 107 cellules par assiette.
      2. Le jour -8, préchauffer la quantité requise de milieu complet à 37 °C. Ajouter 1 L de milieu préchauffé à chaque bouteille de filature dans des conditions stériles. Placez les essoreurs sur une table agitée fixée à 20-25 tours à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire, ouvrez légèrement les bouchons de filature latérale pour permettre au milieu d’équilibrer à l’atmosphère de l’incubateur.
        REMARQUE : Pour éviter toute contamination, nettoyez soigneusement la surface extérieure des bouteilles multimédias et filatures à l’aide de 70 % d’éthanol.
      3. Le jour -7, trypsinize et recueillir les cellules cultivées à 80-90% confluent (environ 1,8 × 108 cellules). Recueillir les cellules à partir de 3 plats à la fois, tourner vers le bas (200 × g, 5 min, température ambiante), et re-suspendre toutes les cellules dans 10 mL de DMEM.
        REMARQUE : La dissociation complète des cellules à ce stade est très importante pour éviter la formation de plus gros agrégats dans les bouteilles de filature, ce qui affecte la survie cellulaire et entraîne un faible rendement en tubuline.
      4. Ajouter 5 mL de suspension cellulaire à chaque bouteille de spinner contenant 1 L de DMEM, remettre les essoreuses à la table d’agitateur dans l’incubateur de culture cellulaire, et permettre aux cellules de croître pendant une semaine.
    2. Cellules cultivées en tant que cultures adhérentes
      REMARQUE : Pour purifier avec succès la tubuline des cellules adhérentes, utilisez un minimum de 10 plats de 80 à 90 % de confluence.
      1. Raviver et amplifier le type de cellule désiré pour obtenir 1 × 108 cellules trois jours avant le jour de la préparation de la tubuline.
      2. Le jour -3, plaquez ces cellules sur dix plats de 15 cm à 1 × 107cellules par plat et laissez-les pousser 80-90% de confluence.
      3. Le jour -1, si nécessaire, les cellules transfect avec un plasmide pour exprimer une enzyme modifiant la tubuline ou un isotype particulier de la tubuline.
  2. Récolte des cellules et des tissus cérébraux
    1. Cellules cultivées en tant que cultures de suspension
      1. Transférer la suspension cellulaire des essoreuses dans 1 bouteille de centrifugeuse L(table des matériaux)et les cellules à granulés à 250 × g,15 min, température ambiante. Pour commencer immédiatement une autre culture des cellules HeLa S3 dans les bouteilles de filature, laissez 100 mL de suspension cellulaire dans les essoreuses, et ajoutez 1 L de DMEM complet et préchauffé à la bouteille de filature.
        REMARQUE : Vérifiez soigneusement la contamination bactérienne avant de procéder à la purification de la tubuline.
      2. Resuspendez les cellules granulées de chaque bouteille de centrifugeuse dans 10 mL de PBS glacé, et transférez toutes les cellules dans des tubes à bouchon à vis de 50 mL. Pendant la suspension, garder les cellules sur la glace. Pelleter les cellules à 250 × g,15 min, 4 °C.
        REMARQUE : Suivez les recommandations concernant le nettoyage et l’entreposage des bouteilles de filature (voir tableau des matériaux).
      3. Jetez le supernatant et déterminez le volume de la pastille cellulaire. De 2 L de culture de suspension (deux bouteilles de spinner), attendez-vous à une pastille cellulaire de 5-6 mL.
        REMARQUE : Dans le protocole décrit ci-dessous, le volume de granulés cellulaires est supposé être de 10 mL. Ajustez l’expérience en fonction des volumes de granulés.
      4. Ajouter 1 volume (10 mL) de tampon de lyse et suspendre à nouveau la pastille cellulaire.
        REMARQUE : Le rapport entre le volume de granulés cellulaires et le volume tampon de lyse est très important pour la purification réussie de la tubuline. L’ajout de plus de tampon de lyse diminue la concentration de tubuline, qui n’atteint alors pas la concentration critique nécessaire à la polymérisation, réduisant ainsi considérablement le rendement de la tubuline.
        REMARQUE : Les cellules résusées dans le tampon de lyse peuvent être congelées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C pendant deux mois.
    2. Cellules cultivées en tant que cultures adhérentes
      REMARQUE : Les cellules des cultures adhérentes doivent être récoltées très rapidement pour une purification réussie de la tubuline (environ 15 minutes pour la récolte de dix plats de 15 cm). Trois personnes ont participé à cette étape du protocole.
      1. Retirer le milieu de la vaisselle de 15 cm en inclinant la vaisselle, puis laver délicatement les cellules avec 7 mL de PBS-EDTA à température ambiante (personne 1). Ne travaillez qu’avec trois plats de 15 cm à la fois pour éviter de laisser les cellules sans milieu ni tampon.
      2. Ajouter 5 mL de PBS-EDTA aux cellules et les incuber pendant 5 min à température ambiante.
      3. Utilisez un élévateur cellulaire pour détacher doucement les cellules en les pelletant à un bord du plat (personne 2), et recueillir toutes les cellules dans un tube à bouchon à vis de 50 mL (personne 3). Rincer chaque assiette avec 2 mL supplémentaires de PBS-EDTA pour recueillir les cellules restantes de la vaisselle. Au cours de cette étape, gardez le tube de bouchon à vis de 50 mL contenant la suspension cellulaire sur la glace.
      4. Pelleter les cellules à 250 × g,10 min, 4 °C. Jetez le supernatant et déterminez le volume de la pastille cellulaire. Attendez-vous à un volume d’environ 1 mL à partir de dix plats de 15 cm.
        REMARQUE : Dans le protocole décrit ci-dessous, le volume de granulés cellulaires est supposé être de 10 mL. Ajustez les expériences en fonction des volumes de granulés.
      5. Resuspendez les cellules en 1 volume (10 mL) de tampon de lyse.
        REMARQUE : Les cellules réutilisées dans le tampon de lyse peuvent être stockées à -80 °C jusqu’à deux mois.
    3. Tissu cérébral
      REMARQUE : Des souris de tout âge, sexe ou origine génétique peuvent être utilisées. Le choix de la souche transgénique de la souris dépendra de la question scientifique à traiter. Dans ce manuscrit, nous montrons l’exemple de la tubuline purifiée à partir de la ttll1-/- souris, dépourvue d’une enzyme fessier majeure du cerveau, la protéine31de la tyrosine tyrosine de la baignoire 1 (TTLL1).
      1. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale, décapitez rapidement et rassemblez le cerveau dans un tube à fond rond. S’il y a excès de sang sur le cerveau, lavez-le rapidement avec un tampon de lyse. Recueillir le cerveau dès que la souris est sacrifiée comme un retard post mortem peut affecter le succès de la purification de la tubuline. Utilisez des tubes à fond rond pour tenir compte de la largeur de la sonde utilisée pour l’homogénéisation.
        REMARQUE : Les cerveaux de souris collectés peuvent être congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 °C jusqu’à 3 ans.
      2. Ajouter 500 μL de tampon de lyse à un seul cerveau extrait d’une souris adulte. Pour le reste du protocole, le volume de tampon de lyse ajouté est supposé être de 10 mL. Ajustez-vous pour votre expérience en fonction du nombre de cerveaux à utiliser.

3. Lyse des cellules ou des tissus cérébraux

  1. Cellules cultivées en tant que cultures de suspension
    1. Pour HEK-293, lyse les cellules sur la glace en pipetting répétitivement de haut en bas à l’aide de pointes pipette de différentes largeurs. Tout d’abord, fixez une pointe p1000 à une pipette de 10 mL, et pipette la suspension cellulaire de haut en bas toutes les 5 minutes, pendant 10 min (trois cycles de pipetage). Deuxièmement, fixez une pointe p200 à une pointe p1000 et une pipette supplémentaire toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage).
    2. Pour HeLa S3, lyse les cellules à l’aide d’Français presse (voir tableau des matériaux pour les paramètres).
    3. Prendre 1/100e de volume du mélange de lyse (L) (200 μL pour 20 mL de L), et ajouter le même volume de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et conserver à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  2. Cellules cultivées en tant que cultures adhérentes
    1. Transférer les cellules dans un tube à fond rond de 14 mL dont la hauteur a été réduite pour accueillir la sonde sonicator (voir tableau des matériaux pour les réglages). Sonicate les cellules pour ~ 45 impulsions, et de confirmer la lyse cellulaire en échantillonnant une goutte du mélange de lyse sous un microscope.
      REMARQUE : Le nombre d’impulsions peut varier selon le type de cellule utilisé pour la purification de la tubuline. Des cellules sonicantes trop pourraient provoquer une précipitation de la tubuline et affecter négativement le rendement de purification.
    2. Pipette les cellules de haut en bas sur la glace toutes les 5 minutes pendant 20 min (cinq cycles de pipetage), à l’aide d’une pointe p200.
    3. Prendre 1/100e volume de mélange de lyse (L) (200 μL pour 20 mL de L) et ajouter le même volume de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 minutes et conserver à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  3. Tissu cérébral
    1. Lyse le tissu cérébral à l’aide d’un mélangeur de tissus (voir tableau des matériaux pour les paramètres). Alternativement, lyse le tissu à l’aide d’un pilon microtube ou un équipement équivalent et pipette de haut en bas sur la glace avec une seringue de 1 mL avec une aiguille de 18 G.
    2. Prendre 1/100e volume de mélange de lyse (L) (200 μL pour 20 mL de L), et ajouter le même volume de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et conserver à -20 °C pour une analyse plus approfondie.

4. Purification de la tubuline

  1. Lysate Clarification
    1. Effacer le lysate (séparation des granulés et fraction soluble du mélange de lyse) par centrifugation à 150 000 × g,4 °C, 30 min. Consultez tableau des matériaux pour plus de détails sur les rotors et les tubes d’ultracentrifugeuses. Pour les extraits cellulaires, une couche flottante blanche est souvent formée après centrifugation. Ne transférez pas cette couche flottante avec le supernatant, car elle interfère avec la polymérisation de la tubuline. Utilisez une seringue de volume approprié attachée à une longue aiguille de 20 G ou 21 G pour enlever délicatement le supernatant sans déranger la couche flottante. Si le supernatant est encore nuageux, centrifugeuse à 5 000 × g,4 °C pendant 10 min.
    2. Transférer le supernatant (SN1) dans un tube d’ultracentrifugeuse et noter son volume. Pour une pastille cellulaire de 10 mL, attendez-vous à un volume d’environ 12 mL pour SN1.
    3. Prenez 1/100e de volume de SN1 (120 μL pour 12 mL de SN1), et ajoutez le même volume de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et conservez-les à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
    4. Resuspendez la pastille (P1) dans BRB80 (Tableau des matériaux) en utilisant le même volume que SN1. Prenez 1/100e de volume de P1 (200 μL pour 20 mL de P1), et ajoutez le même volume de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  2. Première polymérisation dans le tampon à faible molarité
    1. Préparer le mélange de polymérisation en combinant 1 volume de SN1 (12 mL), 1/200e volume de 0,2 M GTP (60 μL; concentration finale de 1 mM) et 0,5 volume de glycérol préchauffé (6 mL) dans un tube à bouchon à vis du volume approprié.
      REMARQUE : Le glycérol est utilisé comme agent d’encombrement dans les étapes de polymérisation tout au long du protocole et n’est donc pas pris en compte dans les calculs des concentrations d’autres composants.
    2. Pipette le mélange de haut en bas, en évitant doucement la formation de bulles d’air et de le transférer dans les tubes d’ultracentrifugeuse appropriés.
      REMARQUE : Lors du transfert du mélange sur les tubes, ajustez le poids des tubes (par paires). Cela permet à l’expérimentateur de procéder directement à la sédimentation des microtubules après l’étape de polymérisation. Faites ceci pour toutes les étapes de polymérisation tout au long du protocole.
    3. Couvrir les tubes de parafilm, transférer dans un bain d’eau à 30 °C et incuber pendant 20 min.
    4. Centrifugeuse les tubes à 150 000 × g, 30 °C pendant 30 min. Retirer le supernatant (SN2) et conserver la pastille de microtubules polymérisés (P2).
      REMARQUE : Les granulés de microtubules peuvent être congelés et stockés à -80 °C jusqu’à 1 an.
    5. Prenez 1/200e volume de SN2 (90 μL pour 18 mL SN2) et ajoutez le même volume de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  3. Première dénolysation
    1. Dépolymerize microtubules en ajoutant brb80 glacé à la pastille P2, et laisser sur la glace pendant 5 min: pour la tubuline des cellules, ajouter 1/60e (200 μL), et pour la tubuline du cerveau, ajouter 1/20e (600 μL) du volume de la SN1.
      REMARQUE : Le volume de BRB80 glacé ajouté à la pastille pendant les étapes de dénolysation est toujours par rapport au volume de SN1.
    2. Resuspendez doucement la pastille de microtubule, en évitant les bulles d’air, jusqu’à ce que la solution soit complètement homogène. Utilisez une pointe p1000 pour quelques cycles de pipetage suivis d’une pointe p200 toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage). Il s’agit d’une étape cruciale pour le succès de la purification de la tubuline.
    3. Transférer la solution dans des tubes d’ultracentrifugeuse appropriés et faire tourner à 150 000 × g,4 °C pendant 20 min. Transférer le SN3 dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL. La pastille formée après cette étape de centrifugation (P3) contient des protéines précipitées (protéines associées aux microtubules ou MAP) et des microtubules non dépolymérisés. Le supernatant (SN3) contient des composants solubles : des dimers de tubuline dépolymérisés et des MAPs, qui se sont détachés des microtubules dépolymérisés.
    4. Prendre 1-4 μL de SN3, et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
    5. Resuspendez le granulé P3 en BRB80 (dans le même volume de SN3), prenez 1-4 μL, et ajoutez 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C.
  4. Deuxième polymérisation (en tampon à haute molarité)
    1. Préparer le mélange de polymérisation en combinant 1 volume de SN3 (200 μL), 1 volume de PIPES préchauffés de 1 M (200 μL, concentration finale 0,5 M), 1/100e volume de 0,2 M GTP (2 μL, concentration finale de 1 mM) et 1 volume de glycérol préchauffé (200 μL) dans un tube du volume approprié.
    2. Pipette le mélange de haut en bas, en évitant la formation de bulles d’air, et le transférer dans des tubes d’ultracentrifugeuse.
    3. Couvrir les tubes de parafilm, les transférer dans un bain d’eau à 30 °C et incuber pendant 20 min.
    4. Centrifugeuse les tubes à 150.000 × g, 30 °C pendant 30 min. Retirer le supernatant (SN4) et conserver la pastille de microtubules polymérisés (P4). La pastille P4 contient les microtubules polymérisés, et le Supernatant SN4 contient de la tubuline non dominumée, des MAP et d’autres protéines solubles.
      REMARQUE : La pastille de microtubule après la deuxième étape de polymérisation peut être congelée et stockée à -80 °C jusqu’à 1 an.
    5. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
  5. Deuxième dénolysation
    1. Dépolymerize microtubules en ajoutant brb80 glacé à la pastille P4, et laisser sur la glace pendant 5 min: pour la tubuline des cellules, ajouter 1/100e (120 μL), et pour la tubuline du cerveau, ajouter 1/40e (300 μL) du volume de la SN1.
    2. Pipette de haut en bas avec une pointe p200 toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage).
    3. Transférer la solution dans un tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL et faire tourner à 150 000 × g,4 °C pendant 20 min. Transférer le SN5 dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL. La pastille formée après cette étape de centrifugation (P5) contient des microtubules non dépolymérisés. Le supernatant (SN5) contient la tubuline soluble.
    4. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
    5. Resuspendez le granulé P5 en BRB80 (même volume de SN5), prenez 1-4 μL, et ajoutez 9 volumes de tampon 2x Laemmli, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C pour d’autres analyses.
  6. Troisième polymérisation (en tampon à faible molarité)
    1. Préparer le mélange de polymérisation : 1 volume de SN5 (120 μL), 1/200th volume de 0,2 M GTP (0,6 μL, concentration finale est de 1 mM) et 0,5 volume de glycérol préchauffé (60 μL) dans un tube du volume approprié.
    2. Pipette le mélange de haut en bas, en évitant doucement la formation de bulles d’air, et le transférer dans les tubes d’ultracentrifugeuse appropriés.
    3. Couvrir les tubes de parafilm, les transférer dans un bain d’eau à 30 °C et incuber pendant 20 min.
    4. Centrifugeuse les tubes à 150.000 × g, 30 °C pendant 30 min. La pastille (P6) contient des microtubules polymérisés et le supernatant SN6 contient de petites quantités de tubuline non polymérisée.
      REMARQUE : Les granulés de microtubule peuvent être congelés et stockés à -80 °C jusqu’à 1 an.
    5. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
  7. Troisième dénolysation
    1. Dépolymerize microtubules en ajoutant brb80 glacé à la pastille P6, et laisser sur la glace pendant 5 min: pour la tubuline des cellules, ajouter 1/100e (120 μL), et pour la tubuline du cerveau, ajouter 1/40e (300 μL) du volume de la SN1.
    2. Pipette de haut en bas avec une pointe p200 toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage).
    3. Transférer la solution dans les tubes d’ultracentrifugeuses appropriés et faire tourner à 150 000 × g,4 °C pendant 20 min. Transférer le SN7 dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL. La pastille (P7) contient de petites quantités de microtubules non dénolysés. Le supernatant (SN7) contient exclusivement des microtubules dépolymérisés (tubuline soluble).
    4. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
    5. Resuspendez le granulé P7 dans BRB80 (même volume de SN7), prenez 1-4 μL, et ajoutez 9 volumes de tampon 2x Laemmli, faites bouillir pendant 5 min, et stockez à -20 °C pour d’autres analyses.
    6. Quantifier la quantité de tubuline (voir Résultats représentatifs)et aliquot SN7 en petits volumes, casser-congeler, et stocker à -80 °C.

Résultats

L’objectif principal de cette méthode est de produire une tubuline de haute qualité et compétente en assemblage en quantités suffisantes pour effectuer des expériences in vitro répétées avec les composants purifiés. Les microtubules assemblés à partir de cette tubuline peuvent être utilisés dans des essais de reconstitution basés sur la technique de microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRF) avec des microtubules dynamiques ou stables, dans des expériences testant la dynamique des mi...

Discussion

La méthode décrite ici fournit une plate-forme pour générer rapidement des tubulines de haute qualité et compétentes en assemblage en quantités moyennes-grandes à partir de lignées cellulaires et de cerveaux de souris simples. Il est basé sur le protocole d’étalon-or de purification de la tubuline à partir de cerveaux bovins utilisés sur le terraindepuis de nombreuses années 16,17. Un avantage particulier de l’approche est l’utilisation de cul...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par l’ANR-10-IDEX-0001-02, le LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 et l’Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ est soutenu par l’Institut Curie, l’Agence nationale de la recherche du Français (ANR) décerne l’ANR-12-BSV2-0007 et l’ANR-17-CE13-0021, la subvention de l’Institut national du cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1, et la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) accorde à DEQ20170336756. MMM est soutenu par la Subvention Fondation Vaincre Alzheimer FR-16055p, et par la Subvention France Alzheimer AAP SM 2019 n°2023. Jas a été soutenu par le programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 675737, et la subvention FDT201904008210. SB a été soutenu par la subvention frm FDT201805005465.

Nous remercions tous les membres du laboratoire Janke, en particulier J. Souphron, ainsi que G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) et A. Gautreau (Ecole Polytechnique) pour leur aide lors de l’établissement du protocole. Nous tenons à remercier l’établissement animalier de l’Institut Curie pour son aide à l’élevage et aux soins de la souris.

L’anticorps 12G10, développé par J. Frankel et M. Nelson, a été obtenu de la Developmental Studies Hybridoma Bank développée sous les auspices du NICHD et maintenue par l’Université de l’Iowa.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M MgCl2 Sigma#M1028
1-L cell culture vesselsTechne F7610 Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol Sigma #M31482-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride Sigma #A8456
40% Acrylamide Bio-Rad #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS)Sigma#A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowadilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 AdipoGen #AG-20B-0020dilution: 1/20,000
Aprotinin Sigma #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifugeFor collecting spinner cultures
Biological stirrer Techne MCS-104L Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide Bio-Rad #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax® For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA)Sigma #A7906
Bromophenol blue Sigma #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)Sigma#C9268Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma #D8418DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium Life Technologies #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol Sigma #D9779
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma #E3889
Ethanol absolute Fisher Chemical #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)Sigma #F7524
French pressure cell press Thermo electron corporation #FA-078Awith a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol VWR Chemicals #24388.295
GlycineSigma#G8898
GTP Sigma #G8877
Heating block Stuart #SBH130D
Hela cells ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells ATCCATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl )VWR#20252.290
Inverted microscope With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol VWR #20842.298
jetPEIPolyplus #101
JLA-8.1000 rotor For collecting spinner cultures
KOH Sigma #P1767KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine Life Technologies #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubesSigma4-16 K 
Leupeptin Sigma#L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
MicropestlesEppendorf#0030 120.973
Mouse brain tissue Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mmTerumo#18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mmTerumo#20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mmB.Braun#466 5643
Parafilm
PBS Life Technologies #14190169
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Sigma #P7626PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES Sigma #P6757
Pipette-boy
RotorsBeckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment Bio-Rad #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate VWR #442444HFor preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate Sigma #L5750For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator Branson#101-148-070Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubesEppendorf5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine Sigma#9281
Trichostatin A (TSA)Sigma#T8552
Triton X-100 Sigma #T9284
Trizma base (Tris)Sigma #T1503
Trypsin Life Technologies#15090046
Ultracentrifuge rotors TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotorsSet at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes Beckman#357448 for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman#349622for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman#355631 for using with 70.1 Ti rotor
UltracentrifugesBeckmanOptima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holdersSet at 30°C 

Références

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C., Correia, J. J., Wilson, L. . Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. , 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

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