Étude de la dynamique des protéines par spectroscopie d’écho de spin neutronique

Résumé

Le présent protocole décrit des méthodes pour étudier la structure et la dynamique de deux protéines modèles qui jouent un rôle important dans la santé humaine. La technique combine la caractérisation biophysique de paillasse avec la spectroscopie d’écho de spin neutronique pour accéder à la dynamique aux échelles de temps et de longueur pertinentes pour les mouvements interdomaines des protéines.

Résumé

L’activité et la fonctionnalité de la plupart des protéines du corps humain sont liées à des changements de configuration de sous-domaines entiers au sein de la structure cristalline de la protéine. Les structures cristallines constituent la base de tout calcul qui décrit la structure ou la dynamique d’une protéine, la plupart du temps avec de fortes restrictions géométriques. Cependant, ces restrictions de la structure cristalline ne sont pas présentes dans la solution. La structure des protéines dans la solution peut différer de celle du cristal en raison de réarrangements de boucles ou de sous-domaines sur l’échelle de temps pico à nanoseconde (c’est-à-dire le régime temporel de la dynamique interne des protéines). Le présent travail décrit comment les ralentis sur des échelles de temps de plusieurs dizaines de nanosecondes peuvent être accessibles en utilisant la diffusion des neutrons. En particulier, la caractérisation dynamique de deux protéines humaines majeures, une protéine intrinsèquement désordonnée qui n’a pas de structure secondaire bien définie et une protéine d’anticorps classique, est traitée par spectroscopie d’écho de spin neutronique (NSE) combinée à un large éventail de méthodes de caractérisation en laboratoire. D’autres connaissances sur la dynamique du domaine protéique ont été obtenues à l’aide de la modélisation mathématique pour décrire les données expérimentales sur les neutrons et déterminer le croisement entre les mouvements diffusifs et internes combinés des protéines. L’extraction de la contribution dynamique interne à la fonction de diffusion intermédiaire obtenue à partir de NSE, y compris l’échelle de temps des différents mouvements, permet une vision plus approfondie des propriétés mécaniques des protéines uniques et de la douceur des protéines dans leur environnement presque naturel dans la solution protéique encombrée.

Introduction

Dynamique de sondage de la matière molle avec des neutrons
L’étude des propriétés dynamiques des protéines et des peptides est une partie importante de la recherche biophysique, et de nombreuses méthodes bien développées existent aujourd’hui pour accéder à un large éventail de paysages énergétiques¹. Relier la dynamique révélée expérimentalement des protéines à leur fonction biologique est une tâche beaucoup plus difficile, nécessitant des modèles mathématiques complexes et des simulations dynamiques assistées par ordinateur. L’importance de la spectroscopie neutronique pour l’analyse des mouvements des protéines a été souli....

Protocole

Les présents travaux caractérisent deux protéines : une protéine d’anticorps humains IgG régulière et le MBP intrinsèquement désordonné. La forme lyophilisée des protéines a été obtenue à partir de sources commerciales (voir tableau des matériaux).

1. Préparation d’échantillons de protéines

1. Préparer un tampon de phosphate de sodium de 50 mM + 0,1 M de NaCl en pesant et en dissolvant les réactifs solides respectifs dans de l’eau lourde (D₂O) (voir tableau des matériaux). Il s’agit du solvant tampon deutéré pour les IgG.
   1. Ajuster le pH de la solution tampon à 6,6.<....

Résultats

Les protéines IgG du sérum humain et des protéines MBP bovines ont été reconstituées à des concentrations élevées (~50 mg/mL) dans des tampons D₂O-base. Comme les protéines ont été dissoutes à des concentrations élevées, les solutions obtenues étaient des solutions protéiques encombrées. Les dynamiques étudiées à l’aide de NSE souffrent de l’environnement surpeuplé dans lequel résident les protéines (interactions des facteurs de structure et effets hydrodynamiques)^.......

Discussion

La spectroscopie NSE fournit une vue unique et détaillée de la dynamique des protéines, que d’autres techniques spectroscopiques ne peuvent pas produire. Les mesures sur une longue échelle de temps fournissent des observations de la diffusion translationnelle et rotationnelle des protéines, comme présenté ici. La dynamique segmentaire et d’autres oscillations internes se révèlent comme une forte désintégration de la fonction de diffusion cohérente S(Q, t) à une courte échelle de temps et sont b.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine MBP protein solution	Sigma-Aldrich	M1891	lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water	Sigma-Aldrich	Product No. 151882	liquid
Dionized water	in house	-	for washing / cleanning cells
DLS instrument	Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich	-	dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards	SNS-NSE, ORNL	-	Al2O3  and Graphite powders
Ethanol	Sigma-Aldrich	65350-M	70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution	Sigma-Aldrich	I4506	lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument	JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany	-	small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent	Alconox	-	Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O	Sigma-Aldrich	Product No.S9390	disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl	Sigma-Aldrich	Product No.S9888	sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	Product No. S9638	monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	Catalog number: ND-2000	NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera	NeutronOptics, Grenoble	NOG210222	100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm	Bemis	Parafilm M - 5259-04LC PM996	all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer	JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany	-	neutron spectrometer
SasView	https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument	FZ-Jülich	-	small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes	Thermo Scientific	88400-88405	Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster	Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)	https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer	ORNL, Oak Ridge, TN, USA	-	neutron spectrometer
Sterile syringe filters	VWR	N.A. PN:28145-501	0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS)	SP Scientific	Part Number 100004055	sample environment equipment
Urea -d4	Sigma-Aldrich	Product No. 176087	deuterated Urea salt
Viscometer	FZ-Jülich	-	falling ball viscometer