Injections d’embryons pour la mutagenèse médiée par CRISPR dans le saltateur Harpegnathos de fourmi

Résumé

De nombreuses caractéristiques de l’eusocialité des insectes reposent sur la communication au sein de la colonie et la division du travail. La manipulation génétique des gènes régulateurs clés dans les embryons de fourmis par micro-injection et mutagénèse médiée par CRISPR donne un aperçu de la nature du comportement altruiste chez les insectes eusociaux.

Résumé

Les traits uniques des insectes eusociaux, tels que le comportement social et la division reproductive du travail, sont contrôlés par leur système génétique. Pour comprendre comment les gènes régulent les traits sociaux, nous avons développé des fourmis mutantes via l’administration du complexe CRISPR dans de jeunes embryons au cours de leur phase syncytiale. Ici, nous fournissons un protocole de mutagénèse médiée par CRISPR dans Harpegnathos saltator, une espèce de fourmi ponérine qui présente une plasticité phénotypique frappante. Les fourmis H. saltator sont facilement élevées en laboratoire. Les embryons sont collectés pour la micro-injection avec des protéines Cas9 et des petits ARN guides synthétisés in vitro (ARNsg) à l’aide d’aiguilles de quartz faites maison. Les embryons post-injection sont élevés à l’extérieur de la colonie. Après l’émergence de la première larve, tous les embryons et les larves sont transportés dans un nichoir avec quelques travailleurs infirmiers pour un développement ultérieur. Ce protocole convient pour induire la mutagénèse pour l’analyse de la physiologie spécifique à la caste et du comportement social chez les fourmis, mais peut également être appliqué à un spectre plus large d’hyménoptères et d’autres insectes.

Introduction

L’évolution de l’eusocialité chez les insectes, à savoir ceux des ordres Hymenoptera et Blattodea (anciennement Isoptera), a abouti à des traits comportementaux uniques et souvent sophistiqués qui se manifestent à la fois au niveau individuel et au niveau de la colonie. La division reproductive du travail, un trait caractérisant les groupes les plus avancés d’insectes sociaux, implique souvent des systèmes de castes composés de plusieurs groupes comportementaux et souvent morphologiquement distincts. Cette diversité comportementale et morphologique entre les castes est contrôlée non seulement par leur système génétique, mais aussi souvent par l’environnement

Protocole

1. Entretien régulier des colonies de salateurs d’Harpegnathos

1. Maintenir des colonies sauvages de H. saltator dans des boîtes en plastique transparent dans une salle d’élevage de fourmis à 22-25 °C et une photopériode de 12 heures de lumière : 12 heures d’éclairage sombre (12L:12D).
   1. Utilisez de petites boîtes (9,5 x 9,5 cm²) pour élever des ouvrières individuelles ou de petites colonies. Utilisez des boîtes moyennes (19 x 13,5 cm 2) ou de grandes boîtes (27 x 19 cm²) pour élever de plus grandes colonies (figure 1).
   2. Pour créer des nichoirs, utilisez du plâtre po....

Résultats

En utilisant le protocole fourni ici, l’édition du génome dans les embryons salateurs d’Harpegnathos a été réalisée avec succès. Ces résultats ont été validés par réaction en chaîne de la polymérase et clonage pGEM de l’ADN extrait d’embryons injectés, suivi d’un séquençage de l’ADN. L’efficacité de la mutagénèse somatique à l’aide de ce protocole a atteint environ 40%. Les mâles mutants F1 ont été accouplés à des femelles de type sauvage.......

Discussion

L’évolution de l’eusocialité chez les insectes, y compris les fourmis, les abeilles, les guêpes et les termites, a entraîné l’apparition de nouveaux traits comportementaux et morphologiques, dont beaucoup sont influencés par une combinaison de facteurs environnementaux et génétiques 1,2,3,4. Malheureusement, l’attrait et l’utilité des insectes eusociaux en tant que modèles d.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030