Emplacement, dissection et analyse du ganglion radié murin

Résumé

Les changements pathophysiologiques du système nerveux autonome cardiaque, particulièrement dans sa branche sympathique, contribuent au début et à l’entretien des arythmies ventriculaires. Dans le protocole actuel, nous montrons comment caractériser les ganglions radiés murins pour améliorer la compréhension des processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.

Résumé

Le système nerveux autonome est un moteur important de l’électrophysiologie cardiaque. Particulièrement le rôle de sa branche sympathique est une question continue de recherche dans la pathophysiologie des arythmies ventriculaires (VA). Les neurones dans les ganglions étoilés (SG)   – structures bilatérales en forme d’étoile de la chaîne sympathique –   sont une composante importante de l’infrastructure sympathique. Le SG sont une cible identifiée pour le traitement par l’intermédiaire de l’énervation sympathique cardiaque dans les patients présentant le VA thérapie-réfractaire. Tandis que la retouche neuronale et l’activation glial dans le SG ont été décrites dans les patients présentant le VA, les processus cellulaires et moléculaires fondamentaux qui précèdent potentiellement le début de l’arythmie sont seulement insuffisamment compris et devraient être élucisés pour améliorer la modulation autonome. Les modèles murins nous permettent d’étudier le remodelage neuronal sympathique, mais l’identification du SG murin est difficile pour l’investigateur inexpérimenté. Ainsi, les études biologiques cellulaires et moléculaires approfondies du SG murin font défaut pour beaucoup de maladies cardiaques communes. Ici, nous décrivons un répertoire de base pour disséquer et étudier le SG chez les souris adultes pour des analyses au niveau de l’ARN (isolement de l’ARN pour les analyses d’expression génique, hybridation in situ), au niveau des protéines (coloration immunofluorescente de monture entière) et au niveau cellulaire (morphologie de base, mesure de la taille cellulaire). Nous présentons des solutions potentielles pour surmonter des défis dans la technique de préparation, et comment améliorer la souillure par trempe de l’autofluorescence. Cela permet la visualisation des neurones ainsi que des cellules gliales via des marqueurs établis afin de déterminer la composition cellulaire et les processus de remodelage. Les méthodes présentées ici permettent de caractériser le SG pour obtenir davantage d’informations sur le dysfonctionnement autonome chez les souris sujettes à VA et peuvent être complétées par des techniques supplémentaires étudiant les composants neuronaux et glial du système nerveux autonome dans le coeur.

Introduction

Le système nerveux autonome cardiaque est un équilibre étroitement régulé de composants sympathiques, parasympathiques et sensoriels qui permet au cœur de s’adapter aux changements environnementaux avec la réponse physiologique appropriée^1,2. Des perturbations dans cet équilibre, par exemple, une augmentation de l’activité sympathique, ont été établies comme un facteur clé pour l’apparition ainsi que le maintien des arythmies ventriculaires (VA)^3,4. Par conséquent, la modulation autonome, réalisée par l’intermédiaire de la réduction pharmacologique de ....

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’État de Hambourg (ORG870, 959) et l’Agence d’État de Rhénanie-du-Nord-Westphalie pour la protection de la nature, de l’environnement et des consommateurs (LANUV, 07/11) et sont conformes au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (2011) des National Institutes of Health. Les études ont été réalisées sur des souris C57BL/6 mâles et femelles (âgées de 10 à 24 semaines) (numéro de stock 000664, Jackson Laboratories) et des souris homozygotes (db/db) ou hétérozygotes (db/het; contrôle) pour la mutation spontanée du diabète (L....

Résultats

La figure 1 montre comment identifier et disséquer le SG. La figure 1A montre un dessin schématique de l’emplacement, tandis que la figure 1B présente la vue dans le thorax après le retrait de l’emballage cœur-poumon. Les muscles gauches et droits de colli de longus médiaux du SG et de la cage thoracique sont des points de repère importants pour l’orientation. La dissection est effectuée le long des lignes pointillées.......

Discussion

La compréhension des processus cellulaires et moléculaires dans les neurones et les cellules gliales du système nerveux sympathique qui précèdent l’apparition de l’AV est d’un grand intérêt, car l’arrêt cardiaque soudain reste la cause de décès la plus fréquente dans le monde⁵. Par conséquent, dans le manuscrit actuel, nous fournissons un répertoire de base de méthodes pour identifier le SG murin – un élément murin au sein de ce réseau – et effectuer des analyses ulté.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	TPP	92097	RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm	R. Langenbrinck	03-0060	Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.	Serva	11924.03	Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B2261	Whole mount staining
Chicken anti neurofilament	EMD Millipore	AB5539	Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	D8418	Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	AP194SA6	Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A11057	Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Whole mount staining
Drying block 37-100 mm	Whatman (Sigma Aldrich)	WHA10310992	Whole mount staining
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009	Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)	Th.Geyer	2212.5000	Whole mount staining
Eukitt mounting medium	AppliChem	253681.0008	Whole mount staining
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI	Southern Biotech	0100-20	Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase	EMD Millipore	AP144P	Whole mount staining
H2O2 30% (w/w)	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	H1009	Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml	Rotexmedica	PZN: 3862340	Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit	Life technologies	4368813	RNA isolation
Isoflurane (Forene)	Abbott Laboratories	2594.00.00	Preparation SG
Mayer's hemalum solution	Merck	1.09249.0500	Whole mount staining
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller	Marienfeld	0101040	Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	RNA isolation
NanoDrop 2000c	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C	RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack	Akoya Bioscience	FP1488001KT	RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	43368	Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm	Th.Geyer	7691202	Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets	Gibco	18912-014	Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps	FineScienceTools	11203-25	Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase	EMD Millipore	AB152	Whole mount staining
RNAlater	Merck	R0901-100ML	RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2	biotechne (ACD)	323100	RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2	biotechne (ACD)	431738-C2	RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3	biotechne (ACD)	423391	RNAscope
Stainless steel beads 7 mm	Qiagen	69990	RNA isolation
Sudan black B	Roth	0292.2	Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan mastermix	Applied biosystems	4370074	Gene Expression analysis
Tissue Lyser II	Qiagen	85300	RNA isolation
Triton X-100 10% solution	Sigma-Aldrich	93443-100ml	Whole mount staining
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML	RNAscope
Wacom bamboo pen	Wacom	CTL-460/K	Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2	Sigma-Aldrich	WHA10311647	Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	W21404	RNAscope