Découverte de régulateurs métastatiques à l’aide d’un modèle de membrane chorioallantoïque intravitale rapide et quantitative du poussin

Résumé

Il s’agit d’une méthode efficace pour dépister les suppresseurs ou les facteurs de métastases cancéreuses. Les cellules, transduites avec une bibliothèque d’expressions, sont injectées dans le système vasculaire de la membrane chorioallantoïque du poulet pour former des colonies métastatiques. Les colonies ayant un caractère invasif diminué ou accru sont excisées, élargies, réinjectées pour confirmer leur phénotype et, enfin, analysées à l’aide d’un séquençage à haut débit.

Résumé

Les progrès récents de la recherche sur le cancer ont illustré la nature très complexe des métastases cancéreuses. Il a été constaté que plusieurs gènes ou réseaux de gènes sont impliqués dans la régulation différentielle des gènes en cascade métastatique du cancer et des produits géniques en fonction du type de cancer, des tissus et des caractéristiques individuelles du patient. Ceux-ci représentent des cibles potentiellement importantes pour les thérapies génétiques et les approches de médecine personnalisée. Le développement de plateformes de dépistage rapide est essentiel pour l’identification de ces cibles génétiques.

La membrane chorioallantoïque du poussin (CAM) est une membrane riche en collagène hautement vascularisée située sous la coquille de l’œuf qui permet l’échange de gaz dans l’embryon en développement. En raison de l’emplacement et de la vascularisation du CAM, nous l’avons développé en tant que modèle de métastase cancéreuse humaine intravitale qui permet une xénogreffe robuste des cellules cancéreuses humaines et une imagerie en temps réel des interactions des cellules cancéreuses avec la matrice riche en collagène et le système vasculaire.

À l’aide de ce modèle, une plateforme de dépistage quantitatif a été conçue pour l’identification de nouveaux facteurs ou suppresseurs de métastases cancéreuses. Nous avons transduit un pool de cellules cancéreuses HEp3 de la tête et du cou avec une bibliothèque complète de gènes shRNA du génome humain, puis injecté les cellules, à faible densité, dans le système vasculaire CAM. Les cellules ont proliféré et formé des colonies de cellules monotumorales. Les colonies individuelles qui étaient incapables d’envahir le tissu CAM étaient visibles comme un phénotype de colonie compact et excisées pour l’identification de l’ARNh transducté présent dans les cellules. Les images de colonies individuelles ont été évaluées pour leur caractère envahissant. Plusieurs séries de sélections ont été effectuées pour réduire le taux de faux positifs. Des clones individuels de cellules cancéreuses isolées ou des clones nouvellement modifiés qui expriment des gènes d’intérêt ont été soumis à un test de formation tumorale primaire ou à une analyse de cooptation vasculaire des cellules cancéreuses. En résumé, nous présentons une plateforme de dépistage rapide qui permet l’identification de cibles anti-métastatiques et l’analyse intravitale d’une cascade dynamique et complexe d’événements.

Introduction

Les métastases sont la principale cause de décès des patients atteints de cancer^1,2,3. Les cellules cancéreuses métastatiques utilisent des voies de signalisation distinctes, en fonction du type de cancer, tout au long des cinq étapes de la cascade métastatique: invasion locale, intravasation, survie dans la circulation, extravasation et expansion des colonies sur des sites métastatiques éloignés. La compréhension actuelle de ce processus métastatique suggère qu’il existe deux étapes de goulot d’étranglement, l’une est l’invasion directionnelle de la cellule cancéreuse à part....

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux règlements et aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Alberta. Les embryons aviaires ne sont pas considérés comme des animaux vivants par de nombreux instituts de recherche et aucun protocole animal n’est requis. Il est toutefois admis que les embryons aviaires peuvent ressentir de la douleur et, par conséquent, doivent être traités aussi humainement que possible. L’autorité locale de recherche sur les animaux doit être contactée avant le début de tout travail de recherche pour s’assurer que les règlements appropriés sont respectés.

Résultats

L’injection de cellules cancéreuses est considérée comme réussie si la majorité des cellules logées dans les capillaires sont uniques et situées à une différence significative les unes des autres (~0,05-0,1 cm) de sorte que les colonies ne se chevauchent pas après 5-6 jours de période d’incubation (Figure 3A). L’injection n’a pas réussi si une accumulation de cellules cancéreuses peut être observée dans la plupart des capillaires, les e.......

Discussion

Nous décrivons ici un protocole de dépistage intravital basé sur la microscopie à fluorescence rapide qui peut être utilisé pour des applications importantes telles que les criblages génétiques ou candidats médicaments. Les cellules cancéreuses qui ont été transduies avec une bibliothèque génétique d’intérêt ou transfectées avec des constructions d’expression individuelles peuvent être rapidement dépistées et quantifiées quant au phénotype d’intérêt à l’aide de ce modèle CAM de poussin........

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL disposable syringes	BD	BD309659
15 mL conical centrifuge tubes.	Corning	CLS430791-500EA
18 gauge x 1 1/2  BD precision needle	BD	BD305196	we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred
2.5% Trypsin solution	many sources are available
4T1 mouse breast cancer	ATCC	CRL-2539
B16F10 mouse melanoma cell line	ATCC	CRL-6475
Benchtop centrifuge.	many sources are available		Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable
Circular coverslips, 22 mm.	Fisher Scientific	12-545-101
Collagenase	Sigma	C0130-100MG
Confocal microscope			We use Nikon A1r
cotton swabs	many sources are available		must be sterilized before use
Culture media appropriate for the cell lines used	many sources are available		We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media
Egg incubator	many sources are available		An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or  Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA
eppendor tubes , 1.5ml	Sigma	T4816-250EA
Fertilized White Leghorn eggs	any local supplyer
fine forceps	many sources are available		must be sterilized begfore use
Hemocytometer	Millipore-Sigma	MDH-4N1-50PK
HT1080 human fibrosarcoma cell line	ATCC	CCL-121
Image analysis software			We use Nikon Elements
Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine	Vector Laboratories	RL-1042, FL-1041	Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening
MDA-MB-468 human breast cancer	ATCC	HTB-132
PBS (1x)	many sources are available
Plastic weighting dishes	Simport	CA11006-614	dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available
small surgical scissors	many sources are available		must be sterilized before use
Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length	Sutter Instrument	BF100-58-10
Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes).	VWR	CA25378-115	dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available
Stereo fluorescent microscope			We use Zeiss Lumar v12
Tygon R-3603 laboratory tubing	Cole-Parmer	AAC00001	1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness
U-118 MG human glioblastoma	ATCC	HTB-15
U-87 MG human glioblastoma	ATCC	HTB-14
Vertical pipette puller	many sources are available		we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720