Isolement et imagerie en accéléré de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires primaires de souris pour analyser les attributs de mouvement collectif

Résumé

Nous présentons un protocole d’isolement et de culture de cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris pour l’imagerie en accéléré de la croissance bidimensionnelle (2D) et des tests de réparation des plaies. Nous fournissons également la méthodologie d’analyse des données d’imagerie time-lapse afin de déterminer la formation de flux cellulaire et la motilité directionnelle.

Résumé

Le développement du palais est un processus dynamique, qui implique la croissance verticale des étagères palatines bilatérales à côté de la langue, suivie d’une élévation et d’une fusion au-dessus de la langue. Les défauts de ce processus entraînent une fente palatine, une anomalie congénitale courante. Des études récentes ont montré que l’élévation de la plate-forme palatale implique un processus de remodelage qui transforme l’orientation de l’étagère d’une verticale à une horizontale. Le rôle des cellules mésenchymateuses du plateau palatal dans ce remodelage dynamique a été difficile à étudier. L’analyse quantitative basée sur l’imagerie time-lapse a récemment été utilisée pour montrer que les cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris (MEPM) peuvent s’auto-organiser en un mouvement collectif. Des analyses quantitatives ont pu identifier des différences dans les cellules MEPM mutantes à partir d’un modèle murin présentant des défauts d’élévation du palais. Cet article décrit des méthodes pour isoler et mettre en culture des cellules MEPM à partir d’embryons E13.5 - spécifiquement pour l’imagerie time-lapse - et pour déterminer divers attributs cellulaires du mouvement collectif, y compris des mesures de formation de flux, d’alignement de forme et de persistance de la direction. Il postule que les cellules MEPM peuvent servir de modèle proxy pour étudier le rôle du mésenchyme du plateau palatal pendant le processus dynamique d’élévation. Ces méthodes quantitatives permettront aux chercheurs dans le domaine craniofacial d’évaluer et de comparer les attributs de mouvement collectif dans les cellules témoins et mutantes, ce qui améliorera la compréhension du remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. De plus, les cellules MEPM fournissent un modèle cellulaire mésenchymateux rare pour l’étude du mouvement cellulaire collectif en général.

Introduction

Le développement du palais a été largement étudié car les défauts de la palatogenèse conduisent à une fente palatine - une anomalie congénitale courante qui survient dans des cas isolés ou dans le cadre de centaines de syndromes^1,2. Le développement du palais embryonnaire est un processus dynamique qui implique le mouvement et la fusion du tissu embryonnaire. Ce processus peut être divisé en quatre étapes principales: 1) induction des étagères palatales, 2) croissance verticale des étagères palatales à côté de la langue, 3) élévation des étagères palatales au-dessus de la langue et 4) fusion des étagères palat....

Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisées avec un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de kumc, conformément à leurs lignes directrices et règlements (numéro de protocole: 2018-2447).

1. Récolter des embryons E13.5

1. Euthanasier les souris femelles gravides à l’aide d’une chambre d’inhalation de CO₂ ou par une procédure approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Procédez immédiatement à la dissection.
2. Exposez la moitié inférieure de la cavité abdominale en enlevant la peau et le péritoine. Excisez les deux c....

Résultats

La dissection des étagères palatales est illustrée à la figure 1. La séquence d’incisions est conçue pour minimiser le glissement du tissu. Après le retrait de la tête (Figure 1A, B), la mâchoire inférieure est retirée ( Figure1B, C). L’incision de la partie supérieure de la tête (Figure 1C, D) est faite pour stabiliser le tissu lorsqu?.......

Discussion

L’élévation du plateau palatal constitue un événement de remodelage vertical à horizontal^1,3,4,9,11. Il est postulé que ce processus de remodelage nécessite que les cellules mésenchymateuses du plateau palatal se comportent de manière coordonnée. Les analyses avec des cellules MEPM de type sauvage montrent que ce comportement cellulaire est intrins.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker, 250 mL (x2)	Fisher Scientific	FB-100-250
CO2	Matheson Gas	UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1)	Midwest Scientific	C15B
Debian operating system			computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate	Cytiva Life Sciences	SH30243.01
EtOH, 100%	Decon Laboratories	2701
EVOS FL Auto	ThermoFisher Scientific	AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator	ThermoFisher Scientific	AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates	ThermoFisher Scientific	AMEPVH028
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2)	Fine Science Tools	11295-10	Dissection
Instrument sterilizer bead bath	Fine Science Tools	18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL	Avant	2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight	Roboz	RS-5910	Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes	ThermoFisher Scientific	R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Silicone Insert, 2-well	Ibidi	80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon	Fine Science Tools	MC17C	Dissection
Spring Scissors, 4 mm	Fine Science Tools	15018-10
Sterile 10 cm dishe(s)	Corning	430293
Sterile 12-well plate(s)	PR1MA	667512
Sterile 6-well plate(s)	Thermo Fisher Scientific	140675
Sterile PBS	Corning	21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette	ThermoFisher Scientific	202-1S
Trypsin, 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056